Подготовка, развитие периферийных обонятельных ткани для молекулярной и Иммуногистохимический анализ у дрозофилы

Summary

Здесь мы представляем протокол к сцене и проанализируем развитие обоняния ткани от дрозофилы видов. Иссеченную ткань могут затем использоваться для молекулярного анализа, например количественного RT-PCR (обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции) или РНК последовательности (RNAseq), а также в естественных условиях анализ таких иммуногистохимия или на месте гибридизации.

Abstract

Обонятельная сенсорная система дрозофилы является широко используемой системой развития нейробиологии, систем неврологии, а также нейрофизиологии, поведения и поведенческих эволюции. Дрозофилы обонятельных тканей дом обонятельных рецепторов нейронов (ORNs), которые обнаруживают летучие химические сигналы наряду с гидро - и термо сенсорных нейронов. В этом протоколе мы описываем рассечение развития периферической обонятельных ткани взрослых видов дрозофилы . Мы сначала описывается этап и возраста личинок дрозофилы , следуют рассечение усиков диска от ранней стадии куколки, следуют рассечение антенн от середины куколки этапов и взрослых. Мы также показать методы, где препараты могут быть использованы в молекулярные методы, такие как извлечение RNA qRT-PCR, RNAseq или иммуногистохимия. Эти методы могут также применяться другие Drosophila видов после раз вегетационных куколки развития определяются, и соответствующих этапов рассчитывается для соответствующего старения.

Introduction

Обонятельная сенсорная система дрозофилы является широко используемой системой развития нейробиологии, неврологии систем, а также нейрофизиологии, исследования поведения и поведенческих эволюция^{1,2,3, 4}. Дрозофилы обонятельных тканей дом обонятельных рецепторов нейронов (ORNs), которые обнаруживают летучие химические сигналы наряду с гидро - и термо Сенсорные нейроны^1,5,6. Общая цель этой рукописи должна продемонстрировать как эта....

Protocol

Следующий протокол в соответствии с руководящими принципами этики Комитет по этике исследований университета Duke.

1. Подготовка тканей и развития постановка Drosophila melanogaster куколки

1. Во-первых определите, как много мух, будет необходимо для рассечения. RT-PCR и RNAseq Соберите 100-200 усиков дисков и антенн от лиц, которые необходимы на этапах prepupal, 8 h НФА, 40 h НФА и взрослого. Для иммуногистохимии вскрыть 10-20 человек.
2. Очистить все материалы, включая рассечение колодки и щипцы, с помощью салфетки с 70% EtOH. Если расчлененных материал является использоваться для извлечения РНК, очистить все РНКазы....

Results

Иссеченную ткань развивающимися обонятельную может использоваться для извлечения РНК, следуют RT-PCR для оценки экспрессии генов или могут быть приняты через иммуногистохимия протоколы для определения его выражения и субклеточном локализация генов интерес. В этом разделе мы представляем представитель результаты из любой протокол. Рисунок 1 является представитель количественного RT-PCR показаны транскрипции поверхности рецепторами клеток и обонятельных рецепто.......

Discussion

Этот протокол является полезным ресурсом для лабораторий, заинтересованных в поиске генетические и транскрипционный анализ программ, действующих в развивающихся дрозофилы обонятельных ткани, а также сравнительный анализ этих программ через дрозофилы видов. Это особенно полезно, если уровне систем транскрипционный анализ профилей из различные этапы развития необходимы как праймер для будущих исследований. Протокол, описанные здесь демонстрируется этап и изолировать развивающихся обонятельных ткани от

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Фосфатно-солевой раствор	Gibco	70011-044	Разбавить до 1X в воде без РНКазы
CO2 бак	Воздушный газ	CD R200
Два острых щипца (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	Растворы для выделения РНК
Препарирующий микроскоп
Маленькое ведро со льдом
P20 и P200 Микропипетки и наконечники
1,7 мл Микрофуге Пробирки			Купить без нуклеазы для достижения наилучших результатов
0,2 мл ПЦР-пробирки
Параформальдегид порошок	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Разбавить до 0,2% v/v в 1X PBS
2" чашки
55мм фильтровальная бумага	Ватман	1001-055	Смочить водой и поместить в чашку Петри, чтобы куколки оставались влажными
25 C инкубатор
деионизированный H2O			Купите нуклеазу без нуклеазы или обработайте с помощью DEPC
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров	Dow Corning		для изготовления дисков для препарирования из крышек пластин Terizaki.
MicroWell Mini Trays с крышками	Nunc	438733	Lids могут быть использованы для изготовления силиконовых подушечек для диссекции
Rabbit anti-GFP антитело	MBL international corpor	PM005	первичное антитело
мышь anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	первичное антитело
ADL195 (антиламин, мышь)	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	первичное антитело
Алекса Флуор 488 козий антикроличьи IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Вторичное антитело
Cy3 козье антимышиное IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Вторичное антитело
Triton X-100, белок с детергентом, 10% раствор, стерильно отфильтрованный	CALBIOCHEM	648463	моющее средство
Lab Rotator	Thermo scientific		Rotator
Нуклеазная вода без	Growcells.com	NUPW-0125
Водосточные салфетки для легких условий эксплуатации	VWR	82003-822	Для очистки расходных материалов для вскрытия
Superscript II	invitrogen	18064014	Reverse Transcriptase
QIAshredder (50)	Экстракция РНК	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)	Экстракция РНК	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR		NEB M0541S