Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка, развитие периферийных обонятельных ткани для молекулярной и Иммуногистохимический анализ у дрозофилы

5.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57716

⸱

13 июня 2018 г.

 , 
1Department of Biology, Duke University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол к сцене и проанализируем развитие обоняния ткани от дрозофилы видов. Иссеченную ткань могут затем использоваться для молекулярного анализа, например количественного RT-PCR (обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции) или РНК последовательности (RNAseq), а также в естественных условиях анализ таких иммуногистохимия или на месте гибридизации.

Аннотация

Обонятельная сенсорная система дрозофилы является широко используемой системой развития нейробиологии, систем неврологии, а также нейрофизиологии, поведения и поведенческих эволюции. Дрозофилы обонятельных тканей дом обонятельных рецепторов нейронов (ORNs), которые обнаруживают летучие химические сигналы наряду с гидро - и термо сенсорных нейронов. В этом протоколе мы описываем рассечение развития периферической обонятельных ткани взрослых видов дрозофилы . Мы сначала описывается этап и возраста личинок дрозофилы , следуют рассечение усиков диска от ранней стадии куколки, следуют рассечение антенн от середины куколки этапов и взрослых. Мы также показать методы, где препараты могут быть использованы в молекулярные методы, такие как извлечение RNA qRT-PCR, RNAseq или иммуногистохимия. Эти методы могут также применяться другие Drosophila видов после раз вегетационных куколки развития определяются, и соответствующих этапов рассчитывается для соответствующего старения.

Введение

Обонятельная сенсорная система дрозофилы является широко используемой системой развития нейробиологии, неврологии систем, а также нейрофизиологии, исследования поведения и поведенческих эволюция1,2,3, 4. Дрозофилы обонятельных тканей дом обонятельных рецепторов нейронов (ORNs), которые обнаруживают летучие химические сигналы наряду с гидро - и термо Сенсорные нейроны1,5,6. Общая цель этой рукописи должна продемонстрировать как этап и вскрыть развивающихся куколки и взрослых обонятельных ткани у дрозофилы видов. Обоснование этой техники заключается в создании образцов из различных куколки этапов для молекулярной и развития анализ периферической обонятельной системы, такие как RNAseq и количественного RT-PCR, кроме в vivo ткани маркировки методы . Этот метод может быть особенно полезно для выявления динамики транскрипционный анализ профиля в системе развивающихся взрослых обонятельных от не -melanogaster Drosophila видов, которые не имеют всех трансгенных реагенты для определенного типа клеток маркировка и анализы. В этой рукописи мы продемонстрируем вскрыть усиков дисков и антенн от видов дрозофилы куколки и взрослых. Во-первых мы покажем, как определить 0 h формирования puparium (АТФ, белые куколки или prepupae) для развития промежуточной и поставляемому старения дрозофилы . Далее мы покажем, как вскрыть усиков диски и третий усиков сегмент; в частности как отделить их от глаз диска и второй усиков сегмент для чистоты ткани, необходимые для RNAseq или RT-PCR. Этапы в D. melanogaster , указанных в настоящем Протоколе примерно соответствуют предварительно узорной усиков диск (prepupae), выбор прекурсоров из усиков диск (8 h НФА), начало дифференцировки терминала для ORNs (40 h НФА), и Взрослый антенна. Наконец мы даем примеры для количественного RT-PCR от взрослых антенн, изоляции с помощью метода, а для иммуногистохимии в естественных условиях . Этот метод может использоваться для создания образцов для анализа РНК/ДНК и иммуногистохимии на развитие периферийных обонятельных тканей из различных видов дрозофилы .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующий протокол в соответствии с руководящими принципами этики Комитет по этике исследований университета Duke.

1. Подготовка тканей и развития постановка Drosophila melanogaster куколки

  1. Во-первых определите, как много мух, будет необходимо для рассечения. RT-PCR и RNAseq Соберите 100-200 усиков дисков и антенн от лиц, которые необходимы на этапах prepupal, 8 h НФА, 40 h НФА и взрослого. Для иммуногистохимии вскрыть 10-20 человек.
  2. Очистить все материалы, включая рассечение колодки и щипцы, с помощью салфетки с 70% EtOH. Если расчлененных материал является использоваться для извлечения РНК, очистить все РНКазы нейтрализаторами и сделать все решения с помощью свободной от нуклеиназы или диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) очищенной воды.
    Примечание: Этот протокол использует силиконовые подушечки рассечение вместо стекла для вскрытия. Силиконовые накладки являются дружественными для сверхтонкого щипцами и способствовать быстрое и высокое качество вскрытия.
  3. Собирайте куколки в 0 ч НФА/prepupal стадии.
    1. Чтобы обеспечить наиболее точную постановку, контролировать личинки в 30 мин с интервалом 1 ч.
      Примечание: Блуждающих третьего instar личинок в умеренно переполненном бутылка будет скорее всего окукливаются в течение нескольких часов.
    2. Как только личинки становятся неподвижными и окружены очень легкий (почти белый) цветные куколки случай, перенести их в небольшой 2 - в Петри с влажной бумагой фильтра.
    3. Продолжаться в течение 1-2 ч, иногда мониторинга, выявления и перевода prepupae.
      Примечание: в качестве альтернативы, ясно бутылка всех куколок и позволяют личинки развивать за 2 ч. Все куколки собранных после 2 h будет в диапазон 0 - 2 h НФА.
  4. Сразу перейти к шагу 3.1 вскрыть prepupal усиков диск для этапа 0 h НФА. Если prepupa должен быть в возрасте, собрать их в блюдо, Обложка блюдо и место парафин фильм по краям подавляют сухости и место Петри при 25 ° C.
    Примечание: Куколки могут теперь быть в возрасте до eclosion.
  5. Для куколок, собранных в диапазоне 2 h, возраст prepupae на 2 часа меньше, чем требуемый возраст для того, чтобы обеспечить, что куколки не излишек.
  6. Используйте ультра-тонкой щипцы (Дюмон 55) ткани очень мелкие и хрупкие.

2. Подготовка тканей и развития стадии куколки от других видов дрозофилы

  1. Для определения длины куколки развития других видов дрозофилы , поместите образцы при оптимальной температуре, записывать даты, когда наблюдаются prepupae, сортировать их в свежий флакон и записывать количество дней от prepupa до совершеннолетия.
  2. Запишите отношение времени куколки развития для не -melanogaster видов и melanogaster. Умножьте коэффициент развития времени на количество часов, используемых для постановки melanogaster чтобы получить количество часов, чтобы возраст не -melanogaster видов.

3. рассечение D. melanogaster куколки усиков диска

Примечание: Все раз старения и протоколы вскрытия описаны для Drosophila melanogaster. Для всех других видов изменение протокола старения на основе вегетационных развития время точек будет необходимо, как описано выше.

  1. Для вскрытия куколки усиков диск собирать 50-100 0 - 2 h или 6-8 ч старый куколок, с помощью шпателя и разместить их на площадку рассечение.
  2. Пипетка 150 мкл раствора изоляции РНК в РНКазы бесплатно отцентрифугировать 1,5 мл трубки с помощью пипетки 200 мкл и поместить трубку на льду.
  3. Вскрыть куколки в 150-200 мкл ПБС (фосфатный буфер, нуклеиназы бесплатно). Место несколько капель PBS (150-200 мкл на капельки) на клавиатуре рассечение.
  4. На площадку рассечение место 0 - 2 h или куколки в возрасте 6-8 ч (одна куколка на каплю) расчлененный в одном из 1 x PBS капельки. Используйте щипцы в одной руке для стабилизации тела.
  5. Для 0 - 2 h возрасте куколок, используя пинцет с другой стороны, провести на наиболее передней части (рот крючки) prepupa и вытащите его подвергать мозги и имагинальных дисков, прилагается к делу передней куколки.
  6. Для 8 h НФА куколок сначала осторожно слезает куколки случай от наиболее передней четверти куколки, обнажая головку в мешок мембраны, которая окружает тело.
    Примечание: Тело, на данном этапе, выглядит как вырождающихся личинки.
  7. Удалите головы на шее сустав.
    Примечание: Это гарантирует, что усиков диски не будут потеряны, которые на данном этапе связаны главным образом с оптической долей головного мозга.
  8. Ткани с мозги и имагинальных дисков передать еще 1 x капелька PBS с помощью щипцов или 20 мкл пипетки.
  9. Идентифицировать глаз усиков диск подключен к мозга на оптические лопастями. С помощью щипцов, отключите глаз усиков диск от мозга и куколки дела. Передача его в новый 1 x капелька PBS с помощью щипцов или 20 мкл пипетки.
    Примечание: Prepupal глаз усиков диск является плоской ткани. Однако по 8 h куколок, глаз диски вращаются купирования усиков диски, который сидит впереди центральной мозга.
  10. С помощью щипцов, сократить ткани в месте соединения между глаз и усиков диск. Использование пипетки 20 мкл мягко переводить Иссеченную ткань на РНК изоляции раствора реагента. Минимизируйте количество жидкости, переданные закупорить сумму как можно меньше.
  11. Повторяйте, пока все куколки были расчленены.

4. рассечение D. melanogaster середине куколки и взрослых антенн

Примечание: По 40 h НФА, большинство метаморфоза является полным, и взрослый структуры становятся очевидными, но по-прежнему белый и невзрачный. В этот момент времени развития взрослых антенна приняло свою окончательную форму, но по-прежнему является прозрачным и большинство обонятельные рецепторы, за исключением нескольких, не начали выражение.

  1. Для куколки усиков Анатомирование собирать 50-100 prepupae, как описано в шаге 1 и их возраст за 40 ч при 25 ° C.
  2. Накапайте 150 мкл раствора изоляции РНК в РНКазы бесплатно microcentrifuge 1,5 мл трубки с помощью пипетки 200 мкл и поместить трубку на льду.
  3. На площадку рассечение место куколки расчлененный в одну из 1 x PBS капельки. Используйте щипцы в одной руке для стабилизации тела. С помощью щипцов с другой стороны, осторожно слезает куколки случай от наиболее передней четверти куколки, обнажая головку в мешок мембраны, которая окружает тело.
  4. С помощью щипцов, тщательно Отрежьте голову от остальной части тела куколки, удерживая тела с одним набором щипцами и сорвал голову на шею совместно с другой набор щипцов. Аккуратно перенесите голову в другой 1 x капелька PBS с помощью щипцов. Пипетка вверх и вниз, чтобы очистить содержимое головы (мозга и т.д.) чтобы получить четкие мембраны, которая используется для окружают развивающихся дрозофилы головы.
    Примечание: В 40-50 h НФА, усики соединены в секцию передней большинстве мембраны. Они станут очевидными для вскрытия, когда содержимое головы очищается с закупорить.
  5. С помощью щипцов, отключите куколки антенн от мембраны. Отключить сегмента 2nd антенны от 3rd с помощью щипцов кусочек на сегментные сустава, как только 3rd сегмент будет дом обонятельных рецепторов нейронов.
  6. Использование пипетки 20 мкл мягко переводить Иссеченную ткань на РНК изоляции раствора реагента. Минимизируйте количество жидкости, переданные закупорить сумму как можно меньше. Повторяйте, пока все куколки были расчленены.
  7. Для взрослых усиков Анатомирование собирают около 50 взрослых и возраст их за неделю после eclosion.
    Примечание: Экспрессии генов, обонятельных рецепторов и других генов пик через неделю после eclosion. Взрослые выдерживаются в неделю, чтобы обеспечить биологически соответствующих генов с низкой изобилие стенограммы подняться выше порога обнаружения.
  8. Для извлечения РНК вскрыть мух, пока они еще живы на площадку CO2 . Лечить CO2 pad с битор РНКазы. Для конфокальная томография, вскрыть мух на площадку рассечение в 1 x PBS или PBS + 0,2% Тритон.
  9. Во-первых поставьте взрослых спать на CO2 станции площадку под область рассечение. На площадку CO2 станции, используя пинцет в одной руке для стабилизации тела Используйте щипцы в другой аккуратно вытащить/щепотку третьего усиков сегмент от второго.
  10. Передача антенн в РНК изоляции решение, используя пинцет для размещения антенн непосредственно в жидкости. Повторяйте, пока все взрослые были расчленены.
    Примечание: Убедитесь, что антенн погружен в раствор РНК изоляции. Антенны могут стать застрял на стороне трубки. Это приведет к увеличению деградации мРНК, снижение количества и качества РНК.
  11. Непосредственно перейти к извлечение RNA или поместить трубку на-80 ° C для длительного хранения.

5. РНК изоляции от расчлененных тканей

  1. Удалите все образцы от-80 ° C хранения и размораживать их на льду.
  2. Кратко спина (5-6 s, ~ 6000 x g) каждый образец для сбора материала в нижней части трубки.
  3. Шлифуют каждый образец, используя газобетона пластиковые пестик и электромотором для 10 s на льду.
  4. Повторите шаги 5.2 и 5.3 4.
  5. Выполните извлечение RNA, используя имеющиеся наборы и следующие протоколы производителя для оптимальной урожайности.
  6. Выполните qRT ПЦР использование коммерчески доступных реагентов и конкретных грунтовки против гены интереса и после производителя протоколы.
    1. Выполнять все ПЦР-реакции, с помощью следующих условий: денатурации 95 ° C за 10 мин, после чего 40 циклов 95 ° c 15 s, 55 ° C за 30 s и 60 ° C за 30 s.
      Примечание: Грунтовка пар для DIP и dpr генов, перечислены в таблице 1, и грунты для обонятельных рецепторов генов, перечислены в CE сказал et al. 8.

6. Фиксация куколки усиков дисков и антенн для иммуногистохимии

Примечание: Исправьте тканей в пакетах из 10-20 лиц, чтобы убедиться, что ткани фиксируются на такое же количество времени. Свести к минимуму количество времени пребывания образцы в PBT (PBS с моющим средством) до их передачи на фиксатор, чтобы максимизировать целостности тканей.

  1. Собирать расчлененных усиков дисков или куколки антенн в 200 мкл ПЦР-пробирки, содержащие 200 мкл 0,2% PBT на льду для поддержания целостности тканей и чтобы избежать образца от прилипания к стене 200 мкл ПЦР трубы которая приведет к неполной фиксации.
    Примечание: Куколки антенн и усиков дисков может быть трудно понять, как они довольно полупрозрачные. Рекомендуется использовать рассечение область для всех стиральных шаги для предотвращения потери ткани. Кроме того 96-луночных Terasaki пластины могут быть используется для фиксации и окраски лучше отслеживать ткани.
  2. Исправить расчлененных усиков диска и усиков образцы из куколки в приблизительно 200 мкл 4% PFA (параформальдегида) за 30 мин при комнатной температуре. Для этого и последующих шагов, держите трубы с образцами на nutator правильно смешивать образцов в растворе. Прогресс к шагу 6.7.
  3. Для взрослых антенны, вскрыть всю голову сначала и исправить ее в приблизительно 200 мкл 4% PFA (параформальдегида) за 1 ч при комнатной температуре.
  4. Вымойте 3 x с 200 мкл 0,2% PBT за 10 мин. Держите образцы на nutator во время инкубации.
  5. Вернуться к Микроскоп диссекции для тонкой рассечение второго сегмента усиков от фиксированной головки. С помощью щипцов для стабилизации головы, аккуратно вытащить/щепотку третьего усиков сегмент от второго.
  6. Перевести расчлененных третьего усиков сегментов в приблизительно 200 мкл 4% PFA (параформальдегида) и исправить их на 30 минут при комнатной температуре.
  7. Вымойте 3 x с 200 мкл 0,2% PBT за 10 мин. Держите образцы на nutator во время инкубации.
  8. Хранить образцы на 4 ° C, или продолжить непосредственно с вся гора иммуногистохимия.
    Примечание: Эффективность пятнать может измениться при использовании антител. Этот метод должен быть подходящим для менее обильные белка теги или слабее антител. Однако время от времени, может потребоваться оптимизация протокола (личность или количество фиксатором или время фиксации).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Иссеченную ткань развивающимися обонятельную может использоваться для извлечения РНК, следуют RT-PCR для оценки экспрессии генов или могут быть приняты через иммуногистохимия протоколы для определения его выражения и субклеточном локализация генов интерес. В этом разделе мы представляем представитель результаты из любой протокол. Рисунок 1 является представитель количественного RT-PCR показаны транскрипции поверхности рецепторами клеток и обонятельных рецепто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол является полезным ресурсом для лабораторий, заинтересованных в поиске генетические и транскрипционный анализ программ, действующих в развивающихся дрозофилы обонятельных ткани, а также сравнительный анализ этих программ через дрозофилы видов. Это особенно полезно, если уровне систем транскрипционный анализ профилей из различные этапы развития необходимы как праймер для будущих исследований. Протокол, описанные здесь демонстрируется этап и изолировать развивающихся обонятельных ткани от

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грант от национального научного фонда для Pelin C. Volkan (DEB-1457690).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10X Фосфатно-солевой растворGibco70011-044Разбавить до 1X в воде без РНКазы
CO2 бакВоздушный газCD R200
Два острых щипца (Dumont #55)Fine Science Tools11255-20
TrizolInvitrogen15596-026Растворы для выделения РНК
Препарирующий микроскоп
Маленькое ведро со льдом
P20 и P200 Микропипетки и наконечники
1,7 мл Микрофуге ПробиркиКупить без нуклеазы для достижения наилучших результатов
0,2 мл ПЦР-пробирки
Параформальдегид порошокPolysciences380
10% Triton X-100TeknovaT1105Разбавить до 0,2% v/v в 1X PBS
2" чашки
55мм фильтровальная бумагаВатман1001-055Смочить водой и поместить в чашку Петри, чтобы куколки оставались влажными
25 C инкубатор
деионизированный H2OКупите нуклеазу без нуклеазы или обработайте с помощью DEPC
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеровDow Corningдля изготовления дисков для препарирования из крышек пластин Terizaki.
MicroWell Mini Trays с крышкамиNunc438733Lids могут быть использованы для изготовления силиконовых подушечек для диссекции
Rabbit anti-GFP антителоMBL international corporPM005первичное антитело
мышь anti RAT CD2AbD seroTecMCA154RHDLпервичное антитело
ADL195 (антиламин, мышь)Dev studies hydoma banADL195-sпервичное антитело
Алекса Флуор 488 козий антикроличьи IgG (H+L)invitrogenA11008Вторичное антитело
Cy3 козье антимышиное IgGJackson ImmunoResearch115-166-003Вторичное антитело
Triton X-100, белок с детергентом, 10% раствор, стерильно отфильтрованныйCALBIOCHEM648463моющее средство
Lab RotatorThermo scientificRotator
Нуклеазная вода безGrowcells.comNUPW-0125
Водосточные салфетки для легких условий эксплуатацииVWR82003-822Для очистки расходных материалов для вскрытия
Superscript IIinvitrogen18064014Reverse Transcriptase 
QIAshredder (50)Экстракция РНКQIAGEN79654
Oligo(dT)12-18 PrimerRTlife technologies18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)Экстракция РНКQIAGEN74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)qPCRRoche04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER qPCRRoche06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96qPCRRoche04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master MixqPCRNEB M0541S
Петри

Ссылки

  1. Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
  2. Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130(2013).
  3. Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
  4. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  5. Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
  6. Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
  7. Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
  8. Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443(2016).
  9. Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
  10. Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780(2016).
  11. Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804(2017).
  12. Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
  13. Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Обонятельная ткань Drosophilaпериферическая обонятельная системадиссекция антеннального дискастадирование развития куколкипротокол экстракции РНКиммуногистохимический анализметод диссекции антенныметоды нейробиологии развитияанализ экспрессии геновразвитие сенсорной системы
Подготовка, развитие периферийных обонятельных ткани для молекулярной и Иммуногистохимический анализ у дрозофилы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.