Method Article

Зеленый флуоресцирующий белок Сплит система для визуализации эффекторов доставлены из бактерий во время инфекции

DOI:

10.3791/57719

⸱

May 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science, Seoul National University, 2Department of Bioindustry and Bioresource Engineering, Sejong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентный белок подходы к контролировать эффекторы, выделяемая бактериями в клетки хозяина сложной. Это из-за несовместимости между флуоресцентных белков и секреторной системой типа III. Здесь оптимизированный Сплит системы superfolder GFP используется для визуализации эффекторы, выделяемая бактериями в принимающей растительной клетки.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактерии, один из самых важных возбудителей различных заболеваний растений, выделяют набор эффекторных белков в принимающей растительной клетки для подрыва иммунной системы растений. Во время инфекции цитоплазматических эффекторы, доставляются в цитозоле хоста через тип III секреторной системы (T3SS). После доставки в растительной клетке effector(s) цели конкретных отделении(ях) чтобы модулировать принимающей клеточных процессов для выживания и репликации возбудителя. Хотя там были некоторые исследования на субклеточном локализации эффекторных белков в клетки хозяина, чтобы понять их функции в патогенности с помощью флуоресцентных белков, исследование динамики эффекторы, непосредственно впрыскивается от бактерий была сложной из-за несовместимости между T3SS и флуоресцентных белков.

Здесь мы описываем наши последние метод оптимизированный Сплит системы Зеленый флуоресцирующий белок superfolder (sfGFPОПТ) для визуализации локализации эффекторы, доставлено через бактериальный T3SS в клетки-хозяина. SfGFP11 (11й β-стренги sfGFP)-тегами эффекторных выделяется через T3SS может быть собран с определенных органелл целевых sfGFP1-10ОПТ (1-10й β-стренги sfGFP) ведущий флуоресценции выбросов на сайте. Этот протокол предусматривает процедуру для визуализации сигнала флуоресценции восстановленный sfGFP с эффекторных белков от псевдомонас в частности органелл в растениях Arabidopsis и Nicotiana benthamiana .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растения являются сессильных организмов, которые сталкиваются многочисленные вторжения патогенных организмов, включая бактерии, грибки, вирусы, насекомых и нематод на протяжении всего их жизненного цикла. Среди фитопатогенов, грамотрицательных бактериальных патогенов, таких как Pseudomonas spp. и Ralstonia spp., заразить их растений-хозяев, введя через раны или естественных отверстий, например устьиц и Гидатоды1. Успешно колонизировать растений-хозяев, бактериальных патогенов эволюционировали, чтобы разработать целый ряд факторов вирулентности2. Когда бактерии вторгнуться растения-хозяина, они впрыскива....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Все шаги выполняются при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовка растительных материалов (4 недели)

  1. Подготовка для растений, н. benthamiana
    1. 2 семена N. benthamiana на поверхности почвы каждого банка, накрыть лоток с пластиковый купол и семена прорастают в 25 ° C, влажность 60% роста камеры с циклом 16/8-h свет/темно фотопериода.
    2. После двух недель подобрать и отбросить маленький саженец в каждом банке и продолжают расти растения на тех же условиях роста, применяемых для прорастания в шаге 1.1.1. Добавите 1 Л воды на лоток каждые два дня.
      Примечание: Условия рост....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Β-баррель структура GFP состоит из одиннадцати β пряди и можно разделить на два фрагмента, стренгий 1-10 (ОПТGFP1-10) и стренги 11й (GFP11). Хотя ни один из двух фрагментов флуоресцентные сами, собственн-собранные sfGFP может излучать флюоресценция, когда в непосредственной близости (рис. 1A) существуют два фрагмента. В этой системе, sfGFP1-10ОПТ-выражая Arabidopsis или N. benthamiana растения прив.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанные здесь используется для мониторинга точной локализации эффекторных белков, вводят бактериальный T3SS в принимающей растительной клетки после инфекции. Ранее, Сплит системы GFP был использован как инструмент для изучения субцеллюлярные локализация млекопитающих белки23,36, сальмонеллы T3E локализации и Agrobacterium VirE2 доставки через T4SS в завод клетки37. Для применения этой системы в клетках растени.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано основные программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования (СР 2018R1A2A1A05019892) к DC и гранта от центр молекулярной селекции растений ( ВКПМ) следующего поколения Biogreen 21 программы сельского развития администрации (PJ013201) EP. Мы благодарим изображений центр национального центра инструментария для управления природопользованием для предоставления Конфокальный микроскоп для съемок.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Arabidopsis transgenic linesPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Динеш-Кумар, С.. Пространственно-временной мониторинг эффекторов Pseudomonas syringae с помощью секреции III типа с использованием расщепленных флуоресцентных фрагментов белка. Растительная клетка. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
<стронг>таргетированная на органеллы плазмида sfGFP1-10OPTПарк, Э., Ли, Х. И., Ву, Дж., Чой, Д. & Динеш-Кумар, С.. Пространственно-временной мониторинг эффекторов Pseudomonas syringae с помощью секреции III типа с использованием расщепленных флуоресцентных фрагментов белка. Растительная клетка. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-taged Gateway совместимый вектор для системы доставки эффекторов на основе T3SSПарк, Э., Ли, Х. Й., Ву, Дж., Чой, Д. и Динеш-Кумар, С.. Пространственно-временной мониторинг эффекторов Pseudomonas syringae с помощью секреции III типа с использованием расщепленных флуоресцентных фрагментов белка. Растительная клетка. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к Канамицину (25 мкг/мл)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчивый к штаммам Gentamycin (25 мкг/мл
)Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba Koncz and Jeff Schell, Промотор гена TL-DNA 5 контролирует тканеспецифичную экспрессию химических генов, переносимых новым типом бинарного вектора Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Устойчив к гентамицину (50 мкг/мл) и рифампицину (50 мкг/мл)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500Kvitko, B. H. et al. Делеции в репертуаре генов эффектора секреции Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 типа III демонстрируют функциональное перекрытие между эффекторами. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Устойчив к рифампицину (100 мкг/мл
)<сильный>Компоненты среды
<сильный>Среда для проращивания растенийДобавьте 2,165 г/л Мурасиге и Порошок Скуг, 10 г/л сахарозы в воде. Отрегулируйте pH до 5,8 и добавьте 2,2 г/л фитагеля. Автотель.
Мурасигэ и Скуг среда с витаминамиDuchefa BiochemieM0222Хранить при 4 °С.
SucroseDuchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
LB mediaДобавьте в воду 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl. Для твердых сред добавьте 15 г/л микроагара. Автоклав.  Дайте раствору остыть до 55 градусов; В, и при необходимости добавить антибиотик.
ТриптонBD Bioscience211705
Дрожжевой экстрактBD Bioscience212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
МикроагарDuchefa BiochemieM1002
King's B media10 г/л пептон протеазы #2, 1,5 г/л безводный K2HPO4, 15 г/л агара в воду. Автоклав. Охладите до 55 градусов; С и добавить в среду стерильные 15 мл/л глицерина, 5 мл/л MgSO4. При необходимости добавьте антибиотики.
Proteose peptoneBD Bioscience212120
Безводный K2HPO4Sigma-Aldrich1551128 USP
GlycerinDuchefa BiochemieG1345
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Bacto AgarBD Bioscience214010
Жидкая среда <сильного>Маннит-глутамата (MG) Добавьте в воду 10 г/л маннитола, 2 г/л L-глутаминовой кислоты, 0,5 г/л KH2PO4, 0,2 г/л NaCl и 0,2 г/л MgSO4. Настройка на pH 7
MannitolDuchefa BiochemieM0803
L-глутаминовая кислотаDuchefa BiochemieG0707
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B
Инфильтрационный буфер10 мМ MES (2-(N-морфолино)-этановая сульфокислота), 10 мМ MgCl2, 150 &; М ацетосирингон. рН 5,6; Перед использованием подготовьте свежий буфер.
MESDuchefa BiochemieM1503Приготовьте 100 мМ (pH 5,6) бульон в воде. Фильтр простерилизовать.
MgCl2Sigma-AldrichM8266Приготовьте 100 мМ бульон в воде. Автоклав.
АцетосирингонSigma-AldrichD134406Готовьте 150 мМ запаса в ДМСО.
Конфокальный микроскоп оборудование/материалы
710 лазерная сканирующая конфокальная системаCarl Zeiss
Axio observer Z1 инвертированный микроскопCarl Zeiss
Пропидий йодидThermoFisherP1304MP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invas....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Split GFP SystemEffector Protein DeliveryType III Secretion SystemConfocal MicroscopyPseudomonas SyringaeArabidopsis ThalianaNicotiana BenthamianasfGFP11 TagOrganelle TargetingFluorescence Reconstitution

Related Articles