Method Article

Зеленый флуоресцирующий белок Сплит система для визуализации эффекторов доставлены из бактерий во время инфекции

DOI:

10.3791/57719

⸱

May 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science, Seoul National University, 2Department of Bioindustry and Bioresource Engineering, Sejong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентный белок подходы к контролировать эффекторы, выделяемая бактериями в клетки хозяина сложной. Это из-за несовместимости между флуоресцентных белков и секреторной системой типа III. Здесь оптимизированный Сплит системы superfolder GFP используется для визуализации эффекторы, выделяемая бактериями в принимающей растительной клетки.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактерии, один из самых важных возбудителей различных заболеваний растений, выделяют набор эффекторных белков в принимающей растительной клетки для подрыва иммунной системы растений. Во время инфекции цитоплазматических эффекторы, доставляются в цитозоле хоста через тип III секреторной системы (T3SS). После доставки в растительной клетке effector(s) цели конкретных отделении(ях) чтобы модулировать принимающей клеточных процессов для выживания и репликации возбудителя. Хотя там были некоторые исследования на субклеточном локализации эффекторных белков в клетки хозяина, чтобы понять их функции в патогенности с помощью флуоресцентных белков, исследование динамики эффекторы, непосредственно впрыскивается от бактерий была сложной из-за несовместимости между T3SS и флуоресцентных белков.

Здесь мы описываем наши последние метод оптимизированный Сплит системы Зеленый флуоресцирующий белок superfolder (sfGFPОПТ) для визуализации локализации эффекторы, доставлено через бактериальный T3SS в клетки-хозяина. SfGFP11 (11й β-стренги sfGFP)-тегами эффекторных выделяется через T3SS может быть собран с определенных органелл целевых sfGFP1-10ОПТ (1-10й β-стренги sfGFP) ведущий флуоресценции выбросов на сайте. Этот протокол предусматривает процедуру для визуализации сигнала флуоресценции восстановленный sfGFP с эффекторных белков от псевдомонас в частности органелл в растениях Arabidopsis и Nicotiana benthamiana .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растения являются сессильных организмов, которые сталкиваются многочисленные вторжения патогенных организмов, включая бактерии, грибки, вирусы, насекомых и нематод на протяжении всего их жизненного цикла. Среди фитопатогенов, грамотрицательных бактериальных патогенов, таких как Pseudomonas spp. и Ralstonia spp., заразить их растений-хозяев, введя через раны или естественных отверстий, например устьиц и Гидатоды1. Успешно колонизировать растений-хозяев, бактериальных патогенов эволюционировали, чтобы разработать целый ряд факторов вирулентности2. Когда бактерии вторгнуться растения-хозяина, они впрыскивают ряда белков вирулентности — известный как эффекторов — непосредственно в клетки растений для содействия их патогенности. Эти эффекторы подавить или модулировать врожденного иммунитета растений и манипулировать принимающей клеточных процессов приведет к бактериальной выживания3.

Патогенных бактерий в основном используют T3SS для доставки эффекторные белки прямо в принимающей ячейки4. T3SS напоминает молекулярной шприц с иглы канал, соединяющий из структуры белка лески через внутренний и наружный бактериальной мембраны для укола принимающей ячейки5. Этот механизм секрецию эффекторные опосредовано T3SS (T3E) хорошо сохраняется в различных грамотрицательных бактериальных патогенов завода, а также человека. Один представитель завода патогенов, P. syringae pv. Помидор DC3000 ККПЧ мутант, который обычно имеет дефектных T3SS, ограничил рост растений, вероятно, из-за неспособности Этот мутант полностью подавить завод иммунитета (путем инъекций эффекторные белки)6. После транслокации в клетки хозяина эффекторов цели различных принимающих белков, которые имеют важное значение для ячейки системы, включая завод обороны ответы, транскрипции гена, смерть клетки, протеасомы, везикул людьми и гормон пути7 , 8 , 9 , 10. Таким образом, отслеживание клеточной локализации эффекторных белков в клетках хост является привлекательной мишенью для понимания их функций в отношении модуляции иммунитета растений.

Большинство исследований локализации T3Es использовали Agrobacterium -опосредованной гиперэкспрессия с большой флуоресценции белков в принимающей завод9. Однако чтобы быть неправильно локализованных или иногда нефункциональных в11,12,13было показано метод гетерологичных выражение генов, которые внедряются в других видов. Кроме того несколько исследований показали, что бактериальных эффекторов пройти модификация для правильной ориентации в принимающей клетки14,,1516,17. Таким образом временно выразил эффекторов в цитозоль клетки не могут быть количественно или функционально идентичен эффекторы, которые поставляются T3SS на возбудителя инфекции18завода. Кроме того слияние больших флуоресцентные метки эффекторные белки могут нарушить надлежащее эффекторных доставки и визуализация18,19. Таким образом эти подходы к assay T3E функция не может в полной мере отражает родной локализация T3SS-выделяется эффекторов.

Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) состоит из 11-мель β-ствол, включающего центральной стренге, которая включает хромофора20. Вальдо и др. сообщил Роман Сплит GFP система, которая состоит из небольшого компонента (GFP β нити 11; GFP11) и большой дополнительный фрагмент (GFP β прядь 1-10; GFP1-10)21. Фрагменты не флуоресцировать сами по себе, но флуоресцировать после их самостоятельной ассоциацией, когда обоих фрагментов находятся в непосредственной близости друг с другом. Для оптимизации эффективности складные белок надежные Складные варианты GFP, т.е., sfGFP и sfGFPОПТ, впоследствии были разработаны для Сплит GFP системы20,21,22. Недавно один аминокислотный мутировал варианты sfGFP1-10ОПТ- sfYFP1-10ОПТ и sfCFP1-10ОПТ- который можно восстановить с sfGFP11 фрагмент и показать желтый и голубой флуоресценцией, соответственно, были созданные23 . Кроме того, sfCherry, производное mCherry, могут быть разделены на фрагменты sfCherry1-10 и sfCherry11 так же, как sfGFP23.

Эта система была адаптирована для метки и отслеживания эффекторов T3SS в клетки HeLa во время инфекции, используя эффекторов сальмонеллы24. Однако он был ранее не оптимизирован для системы завод бактериальных патогенов. Недавно мы оптимизировали GFP Сплит системы, основанные на улучшение sfGFP1-10ОПТ для мониторинга субцеллюлярные локализации T3Es, доставленных из P. syringae в клетки растений25. Для облегчения локализации исследования T3Es в различных внутриклеточных отсеков в клетках растений, набор трансгенных Arabidopsis thaliana растения были созданы выразить sfGFP1-10ОПТ в различных отсеках внутриклеточных 25. Кроме того, плазмиды, перевозящих различные органеллы ориентированных sfGFP1-10ОПТ за Agrobacterium-опосредованной переходных гиперэкспрессия и sfGFP11-тегами векторов для доставки на основе T3SS эффектор были также созданы. Семена различных трансгенных линий Arabidopsis и плазмид выразить T3Es интерес может быть получены из источников, упомянутых в Таблице материалов26,27.

В следующий протокол мы описываем оптимизированные системы для мониторинга динамики эффекторы, поставляемые бактерий в клетки хозяина, с помощью Сплит системы sfGFP. Заражение растений, выражаяОПТ sfGFP1-10 с трансгенных Pseudomonas , перевозящих sfGFP11 рекомбинантных плазмид приводит поставка sfGFP11-тегами эффекторных от Pseudomonas в клетки-хозяина. Следовательно эти белки являются восстановленный и перемещать отделении(ях) целевых конкретных эффекторные. Псевдомонас сиреневый pv. помидор Штамм CUCPB5500, в котором удаляются 18 эффекторы, был использован потому что этот штамм показал низкий или не смерть клетки в s A. thaliana и н. benthamiana28. Однако все материалы и шаги, описанные здесь можно заменить или изменить адаптировать Сплит системы sfGFP для расследования других биологических вопросов или оптимизации в условиях данной лаборатории.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Все шаги выполняются при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовка растительных материалов (4 недели)

  1. Подготовка для растений, н. benthamiana
    1. 2 семена N. benthamiana на поверхности почвы каждого банка, накрыть лоток с пластиковый купол и семена прорастают в 25 ° C, влажность 60% роста камеры с циклом 16/8-h свет/темно фотопериода.
    2. После двух недель подобрать и отбросить маленький саженец в каждом банке и продолжают расти растения на тех же условиях роста, применяемых для прорастания в шаге 1.1.1. Добавите 1 Л воды на лоток каждые два дня.
      Примечание: Условия роста для растений может различаться между лабораториями. Поэтому следуйте регулярного полива протокол расти завод в здоровом состоянии.
    3. В неделю передать новый лоток растения и расположить их с достаточное пространство для дальнейшего роста. Держите выращивания растений в условиях, описанных в шаге 1.1.1 до тех пор, пока они готовы быть проникли в возрасте 4 недель.
      Примечание: Рост растений могут отличаться в зависимости от состояния роста всей лаборатории. Обычно, мы находим, что 4-недельных растений N. benthamiana Медведь около шести листьев.
  2. Подготовка трансгенные растения A. thaliana
    1. Обратитесь к Таблице материалов и заказать трансгенных семян арабидопсиса .
    2. Замочите семена трансгенной Arabidopsis ~ 50-100 в 1 мл дистиллированной воды и хранить их на 4 ° C на 3 дня в темноте, чтобы синхронизировать начала прорастания.
    3. Сеять семена ~ 2-3 на поверхности почвы лотка завод вилки и охватывают лоток с пластиковый купол. Разрешить семена прорастают при 23 ° C, влажность 60% с 10/14-h свет/темно фотопериода циклом.
      Примечание: Семена должны быть рецессивной. Однако мы рекомендуем, подтверждая наличие трансген в пакете. В этом случае стерилизовать семена путем промывания с 70% этанола за 2 мин, 50% отбеливатель (около 2% гипохлорита) содержит 0,05% Тритон X-100 для 5 минут следовать путем промывания 5 - 6 раз с двойной стерильной дистиллированной водой (ddH2O). После стерилизации стратифицировать при температуре 4 ° C в течение 3 дней и пластины их на завод всхожесть носителя, содержащего 25 мкг/Л hygromycin B для выбора трансгенных растений.
    4. После недели оставить только один завод за вилку и продолжать расти растения на тех же условиях роста для шага 1.2.3.
      Примечание: Четыре недельных растений были использованы для P. syringae инфекции. Вода растений каждый день, чтобы сохранить здоровые растения.

2. Подготовка Pseudomonas культуры (~ 1 неделя)

  1. Строительство плазмиду для Pseudomonas преобразования
    1. Обратитесь к Таблице материалов и заказать желаемый vector(s) на основе T3SS эффекторные системы доставки векторных25.
    2. Вставьте эффекторных гена интереса в эффекторных доставки вектора с использованием конкретных рекомбинации клонирования25.
      Примечание: При мониторинге субцеллюлярные локализации полнометражного эффекторных белков, положите полнометражного гена в ПБК GW-1-2 или pBG-GW-1-2. Это также можно выбрать pBK-GW-1-4 или pBG-GW-1-4, содержащий 2 x sfGFP11 для увеличения флуоресценции сигнала. В случае частичного эффекторных отсутствует сигнал пептид используйте pBK-GW-2-2 или pBK-GW-2-4. Обратитесь к et al. парк для подробной информации о эффекторных доставки векторов25.
  2. Преобразование плазмида, перевозящих эффекторных сливается с sfGFP11 тегов для P. syringae pv. Помидор (Pst) CUCPB5500 с помощью стандартных электропорации29.
    Примечание: Другие штаммов Pseudomonas может использоваться при необходимости. Построена система тегов sfGFP11 для широкого круга векторов30 и выражение гена эффекторные регулируется AvrRpm1 промоутер, которая сопоставима с, например, Pseudomonas fluorescens (Этан)31.
  3. Распространение преобразованные бактериальной клетки мягко на поверхности плиты агара B короля, содержащие 100 мкг/мл рифампицин и канамицин 25 мкг/мл или 25 мкг/мл гентамицина. Инкубируйте на 28 ° C в течение 2 дней.
  4. Прививок одной колонии в King's B жидких сред с помощью антибиотиков для вектора используется и расти клеток на ночь на 28 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
  5. Сделайте запас глицерина. Добавить газобетона глицерина в конечной концентрации 50% и хранить при температуре-80 ° C.

3. Переходные выражение органеллы ориентированных sfGFP1-10ОПТ в N. benthamiana (4 дня)

  1. Подготовка Agrobacterium культуры
    1. Закажите желаемый vector(s) органеллы ориентированных sfGFP1-10ОПТ plasmid(s) (см. Таблицу материалов).
    2. Преобразование plasmid(s) в Agrobacterium tumefaciens штамм GV3101 клетки32. Рост клеток на носителе агар Бертани Лурия (LB), дополнены канамицин 50 мкг/мл и 50 мкг/мл рифампицин на 28 ° C в течение 2 дней.
    3. От одной колонии на носителе агар LB прививать клетки в 5 мл жидких сред LB, дополненная канамицин 50 мкг/мл и 50 мкг/мл рифампицин. Рост клеток на ночь на 28 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
    4. Урожай клетки центрифугированием в 3000 x g для 10 минут слить супернатанта СМИ и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл свежего сделал инфильтрации буфера.
    5. Измерить количество Agrobacterium путем получения оптической плотности (OD) значение поглощения 600 Нм (Abs 600 Нм). Отрегулируйте ОД600 бактерий до 0,5 с буфером инфильтрации.
      Примечание: 1 мл суспензии достаточно, чтобы проникнуть на два места.
    6. Оставьте культуры при комнатной температуре на нежный рокер для 1-5 ч до проникновения.
    7. Засуните отверстие в центр листья, чтобы быть проникли с 10 мкл наконечником. Используйте 1 мл шприц безыгольной проникнуть Agrobacterium суспензий. Тщательно и медленно вводить около 500 мкл суспензии, приготовленный из шага 3.1.5 в adaxial сторону листьев через шприц. Повторите проникновение на по крайней мере три различных растений для экспериментальной реплицирует.
      Примечание: По причинам охраны здоровья и безопасности, защита глаз следует носить во время проникновения.
    8. Стереть оставшиеся бактериальных подвеска на листьях и Марк границы проникли региона.
    9. Держите проникли растений при тех же условиях роста, используемый для шага 1.1.1 на 2 дня.

4. прививки Pseudomonas (4 дня)

  1. Полоска преобразованные Pseudomonas штамм от глицерина складе шаг 2,5 на короля B агар СМИ с соответствующие антибиотики на 28 ° C в течение 2 дней.
    Примечание: Очень важно здоровье Pseudomonas . Если колоний не образуют хорошо, снова полоска клеток или пропагандирующие клетки в жидких средах короля перед.
  2. Прививать loopful Pseudomonas клеток в жидких средах маннит-глютамат (мг) на 28 ° C с встряхивания на 200 об/мин для ночлега.
  3. Урожай, клетки центрифугированием в 3000 x g для 10 минут слить супернатанта СМИ, Ресуспензируйте гранулы в 10 мм MgCl2и отрегулировать ОД600 до 0,02 (1 x 107 кое/мл) для N. benthamiana листья и 0,002 (1 х 106 кое/мл) для выращивания арабидопсиса листьев.
  4. Для н. benthamianaпроникнуть Pseudomonas подвеска в области листья где Agrobacterium , перевозящих sfGFP1-10ОПТ конструкции было проникли 2 дня ранее (как в шаге 3.1.7). Для sfGFP1-10ОПТ трансгенных Arabidopsisпроникнуть в листья короткий день выросли две 4-недельных Pseudomonas подвеска.
    Примечание: по крайней мере три растения необходимы для экспериментальных реплицирует.

5. наблюдение за sfGFP сигнала через Confocal микроскопии (1 день)

  1. Вырезать лист диска от синегнойной-прививку листья. В точках в определенное время после проникновения Pseudomonas, изображение двух 2-cm2 лист дисков из одного растения, с помощью лазерного сканирования конфокальный системы с 40 X / 1.2 NA C-Апохромат цель погружения в воды или 63 X / 0,8 погружения нефти NA C-Апохромат Цель. Чтобы избежать мертвых клеток, убиты, ранены, наблюдать ячеек от проникновения отверстие.
  2. Запуск наблюдения в условиях низкой мощности 488 нм Аргонового лазера. Увеличьте мощность лазера для обнаружения sfGFP.
    Примечание: Обычно мы используем 2-15% от интенсивности лазерного обнаружения сигнала флуоресценции. Однако мощность лазера и параметр обнаружение следует скорректировать основаны на системе пользователя микроскопии. Здесь фильтры выбросов были установлены до 520-550 Нм. Мертвые клетки часто выделяют auto флуоресценции под 488 нм лазер возбуждения. Поэтому, как отрицательный контроль же эффекторных без sfGFP11 тег следует проникли и наблюдается в тех же условиях наблюдения. Кроме того высокие лазерного возбуждения может вызвать аутофлюоресценция хлорофилла. Таким образом регулировать интенсивность лазера, с помощью элемента управления растительных клеток так, чтобы не вызвать хлорофилл аутофлюоресценция.
    1. Для counterstaining клеточной стенки, проникнуть 20 мм пропидий йодидом (PI) в конечный диск на 5-10 мин до наблюдения.
    2. Для окрашивания ядра погружаться конечные диски в 0,1% параформальдегида 5 минут с последующей промывкой водой. Затем проникнуть на 10 мм PI в конечный диск на 5-10 мин до микроскопические наблюдения. Повторите эксперименты по крайней мере три раза.
      Примечание: Этот шаг не является критической, но полезно для определения локализации эффекторных на плазматической мембраны или ядра. Если эффекторов интерес показали их локализация в определенных органелл, используйте маркер для данного органеллы для подтверждения локализации эффекторные.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Β-баррель структура GFP состоит из одиннадцати β пряди и можно разделить на два фрагмента, стренгий 1-10 (ОПТGFP1-10) и стренги 11й (GFP11). Хотя ни один из двух фрагментов флуоресцентные сами, собственн-собранные sfGFP может излучать флюоресценция, когда в непосредственной близости (рис. 1A) существуют два фрагмента. В этой системе, sfGFP1-10ОПТ-выражая Arabidopsis или N. benthamiana растения прив...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанные здесь используется для мониторинга точной локализации эффекторных белков, вводят бактериальный T3SS в принимающей растительной клетки после инфекции. Ранее, Сплит системы GFP был использован как инструмент для изучения субцеллюлярные локализация млекопитающих белки23,36, сальмонеллы T3E локализации и Agrobacterium VirE2 доставки через T4SS в завод клетки37. Для применения этой системы в клетках растени...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано основные программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования (СР 2018R1A2A1A05019892) к DC и гранта от центр молекулярной селекции растений ( ВКПМ) следующего поколения Biogreen 21 программы сельского развития администрации (PJ013201) EP. Мы благодарим изображений центр национального центра инструментария для управления природопользованием для предоставления Конфокальный микроскоп для съемок.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Arabidopsis transgenic linesPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Динеш-Кумар, С.. Пространственно-временной мониторинг эффекторов Pseudomonas syringae с помощью секреции III типа с использованием расщепленных флуоресцентных фрагментов белка. Растительная клетка. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
<стронг>таргетированная на органеллы плазмида sfGFP1-10OPTПарк, Э., Ли, Х. И., Ву, Дж., Чой, Д. & Динеш-Кумар, С.. Пространственно-временной мониторинг эффекторов Pseudomonas syringae с помощью секреции III типа с использованием расщепленных флуоресцентных фрагментов белка. Растительная клетка. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-taged Gateway совместимый вектор для системы доставки эффекторов на основе T3SSПарк, Э., Ли, Х. Й., Ву, Дж., Чой, Д. и Динеш-Кумар, С.. Пространственно-временной мониторинг эффекторов Pseudomonas syringae с помощью секреции III типа с использованием расщепленных флуоресцентных фрагментов белка. Растительная клетка. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к Канамицину (25 мкг/мл)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчивый к штаммам Gentamycin (25 мкг/мл
)Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba Koncz and Jeff Schell, Промотор гена TL-DNA 5 контролирует тканеспецифичную экспрессию химических генов, переносимых новым типом бинарного вектора Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Устойчив к гентамицину (50 мкг/мл) и рифампицину (50 мкг/мл)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500Kvitko, B. H. et al. Делеции в репертуаре генов эффектора секреции Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 типа III демонстрируют функциональное перекрытие между эффекторами. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Устойчив к рифампицину (100 мкг/мл
)<сильный>Компоненты среды
<сильный>Среда для проращивания растенийДобавьте 2,165 г/л Мурасиге и Порошок Скуг, 10 г/л сахарозы в воде. Отрегулируйте pH до 5,8 и добавьте 2,2 г/л фитагеля. Автотель.
Мурасигэ и Скуг среда с витаминамиDuchefa BiochemieM0222Хранить при 4 °С.
SucroseDuchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
LB mediaДобавьте в воду 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl. Для твердых сред добавьте 15 г/л микроагара. Автоклав.  Дайте раствору остыть до 55 градусов; В, и при необходимости добавить антибиотик.
ТриптонBD Bioscience211705
Дрожжевой экстрактBD Bioscience212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
МикроагарDuchefa BiochemieM1002
King's B media10 г/л пептон протеазы #2, 1,5 г/л безводный K2HPO4, 15 г/л агара в воду. Автоклав. Охладите до 55 градусов; С и добавить в среду стерильные 15 мл/л глицерина, 5 мл/л MgSO4. При необходимости добавьте антибиотики.
Proteose peptoneBD Bioscience212120
Безводный K2HPO4Sigma-Aldrich1551128 USP
GlycerinDuchefa BiochemieG1345
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Bacto AgarBD Bioscience214010
Жидкая среда <сильного>Маннит-глутамата (MG) Добавьте в воду 10 г/л маннитола, 2 г/л L-глутаминовой кислоты, 0,5 г/л KH2PO4, 0,2 г/л NaCl и 0,2 г/л MgSO4. Настройка на pH 7
MannitolDuchefa BiochemieM0803
L-глутаминовая кислотаDuchefa BiochemieG0707
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B
Инфильтрационный буфер10 мМ MES (2-(N-морфолино)-этановая сульфокислота), 10 мМ MgCl2, 150 &; М ацетосирингон. рН 5,6; Перед использованием подготовьте свежий буфер.
MESDuchefa BiochemieM1503Приготовьте 100 мМ (pH 5,6) бульон в воде. Фильтр простерилизовать.
MgCl2Sigma-AldrichM8266Приготовьте 100 мМ бульон в воде. Автоклав.
АцетосирингонSigma-AldrichD134406Готовьте 150 мМ запаса в ДМСО.
Конфокальный микроскоп оборудование/материалы
710 лазерная сканирующая конфокальная системаCarl Zeiss
Axio observer Z1 инвертированный микроскопCarl Zeiss
Пропидий йодидThermoFisherP1304MP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
  3. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
  4. Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
  5. Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4(2013).
  6. Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
  7. Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
  8. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
  9. Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
  10. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  11. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
  12. Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
  13. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
  14. Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
  15. Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
  16. Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
  17. Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563(2012).
  18. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  19. Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59(2008).
  20. Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
  21. Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
  22. Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854(2013).
  23. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046(2016).
  24. Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
  25. Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
  26. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
  27. Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
  28. Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388(2009).
  29. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  30. Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  31. Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
  33. Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
  34. Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
  35. Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
  36. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
  37. Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
  38. Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Split GFP SystemEffector Protein DeliveryType III Secretion SystemConfocal MicroscopyPseudomonas SyringaeArabidopsis ThalianaNicotiana BenthamianasfGFP11 TagOrganelle TargetingFluorescence Reconstitution

Related Articles