Методическая статья

Нейросферы Assay для оценки активации эндогенного нервных стволовых клеток мыши модели минимальная травма спинного

DOI:

10.3791/57727

⸱

13 сентября 2018 г.

 ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы продемонстрировать производительность модели минимальный спинного мозга травмы в взрослой мыши, что запчасти Центральный канал нишу жилья эндогенного нервных стволовых клеток (NSCs). Мы покажем, как нейросферы assay может использоваться для количественного определения активации и миграции окончательного и примитивных NSCs, после травмы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервные стволовые клетки (NSCs) в спинном мозге взрослых млекопитающих являются относительно mitotically покоя населения перивентрикулярной клеток, которые могут быть изучены в пробирке с помощью нейросферы assay. Этот assay, образуя колонии является мощным инструментом для изучения реакции NSCs экзогенных факторов в блюдо; Однако это может также использоваться для изучения эффекта в естественных условиях манипуляций с правильное понимание преимуществ и ограничений assay. Один манипуляции клинический интерес является эффект травмы на эндогенные НСК активации. Текущие модели спинного мозга обеспечивают вызов для изучения это как выраженность общих моделей ушиба, сжатия и перерезка вызывают разрушение НСК нишу на месте травмы, где находятся стволовые клетки. Здесь мы описываем минимальной травмы модель, которая вызывает локализованные повреждения на поверхности поверхностных Дорсолатеральное нижнего уровня (T7/8) грудного отдела спинного мозга взрослого мыши. Эта модель травмы запчасти Центральный канал на уровне травмы и позволяет анализ NSCs, которые находятся на уровне поражения в различные моменты времени после травмы. Здесь, мы покажем, как assay нейросферы могут быть использованы для изучения активации двух отдельных, линейный связанных, популяций NSCs, которые находятся в регионе перивентрикулярной спинного мозга-примитивных и окончательного NSCs (pNSCs и dNSCs, соответственно). Мы продемонстрируем изолировать и культуры эти NSCs от перивентрикулярной региона на уровне травмы и травмы сайт белого вещества. Наши послеоперационные спинного вскрытия показывают увеличение числа ПНШК и dNSC производные neurospheres из региона перивентрикулярной раненых по сравнению с элементами управления, выступая для их активации через травмы связок. Кроме того, после травмы, neurospheres, dNSC производные могут быть изолированы от места повреждения, демонстрируя способность NSCs мигрировать из их перивентрикулярной нишу сайты травмы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Центральной нервной системы содержит субпопуляции самостоятельного обновления, Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые способны привести к возникновению всех различных Зрелые нейронных клеток типы1,2,3,4. Эти нервные стволовые клетки (NSCs) проживают в специализированных нишах в мозг и спинной мозг и может быть активирован после травмы размножаться, мигрировать и дифференцироваться в зрелых нервные клетки. Было показано, что NSCs и их потомства мигрируют к месту травмы в кортикальной травмы модели5,6. В головном мозге NSCs показали мигрировать из боковых желудочков на сайт травмы, где они дифференцируют в астроциты, которые способствуют глиальных шрам формирования7. В спинном мозге однако, было сделано несколько исследований спросить, если эти же эндогенных NSCs может быть использована для поощрения восстановления после травмы спинного мозга. Действительно в настоящее время дискуссии относительно того, требует ли активации стволовых клеток пула в спинном прямого физического ущерба перивентрикулярной ниши, накладки Центральный канал8 или если повреждения спинного шнур паренхимы (оставляя ствола клетки ниши нетронутыми) достаточно для того активировать эндогенного NSCs9.

Ряд моделей спинного травме (ТСТ) были использованы для изучения патофизиологии острые и хронические травмы. Эти модели также использовались для проверки потенциальных терапии для лечения SCI через нейропротекции, иммуномодулирующие и развивающихся клеток Трансплантация/замена стратегии10,11,13. Текущие модели включают в себя сжатие или ушиба травм, которые вызывают крупномасштабных функциональных дефицита, а также обширные поражения и кавитаций в шнур14,15. Результирующая глиальных шрамы могут охватывать несколько сегментов спинного мозга наряду с большинством ширина/окружности спинного16. Таким образом хотя эти модели являются клинически значимых, они могут позволить значительные проблемы для изучения реакции эндогенного NSCs после травмы. Существуют химические модели повреждений, которые могут быть адаптированы к привести к мягкой форм вреда, который может избавить Центральный канал17. Однако эти типы травм сосредоточить внимание на связанных с SCI демиелинизации и не являются клинически значимые модели для физические или механические повреждения, связанных с травматическим SCI.

Чтобы устранить ограничения текущей травмы моделей, мы адаптировали иглы трек минимальный SCI модель, первоначально разработанная в крыса9, для применения в модели взрослых мыши. Наша модель адаптирована травмы может создать последовательную поражением Дорсолатеральное региона спинного мозга мыши и запасных Центральный канал на Этажность травма. Преимуществом этой модели является, что она позволяет исследование кинетики НСК после травмы и их потенциальных радиальных миграции на сайт травмы. Использование мыши модели также допускает использование трансгенных мышей, которые позволяют линии отслеживания эндогенного NSCs и их потомства после травмы. Свойства NSCs, далее может оцениваться с использованием модифицированных формы в vitro нейросферы assay, который вводится в настоящем Протоколе.

Assay нейросферы является в vitro колонии формируя assay который позволяет изоляции NSCs присутствии митогенов. На клоновых обшивка плотности отдельных NSCs размножаться привести к свободно плавающего сферические колонии клеток, которые состоят из небольшой субпопуляции NSCs и подавляющее большинство прародителями18,19. В нашем протокол, мы демонстрируем изоляции двух отдельных, линейный, связанных с NSCs из региона перивентрикулярной спинного мозга — в исходных условиях и после нашей минимальной SCI модели. Окончательным нервных стволовых клеток (dNSCs) Экспресс Нестин и глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и выращиваются в присутствии эпидермального фактора роста (EGF), фактор роста фибробластов (ФБП) и гепарина (совместно называемых EFH)20. Эти dNSCs являются редкими в наивно спинного мозга, что приводит к очень мало neurospheres в пробирке. Тем не менее мы показывают, что dNSCs активируются после минимальной SCI, расширение числа neurospheres, изолированных от региона перивентрикулярной21. Примитивные нервные стволовые клетки (pNSCs) вверх по течению от dNSCs в линии нервных стволовых клеток. pNSCs являются чрезвычайно редки, Ускоренная низкий уровень плюрипотентности маркера Oct4 и лейкемия ингибирующего фактора (LiF) реагировать22. pNSCs не образуют neurospheres при изоляции от спинного мозга взрослого мыши вследствие наличия основного белка миелина (MBP) в первичных культур; Однако, ПНШК neurospheres могут быть изолированы от MBP несовершенным мышей и их численность расширенного следующие травмы — похож на dNSCs21. Наконец мы покажем, что dNSC производные neurospheres могут быть изолированы от сайта травмы в начале раз после минимальной SCI. Эти результаты демонстрируют, что наша модель травмы и анализов можно оценить характеристики активации перивентрикулярной NSCs как их способность размножаться и мигрируют в ответ на травмы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был одобрен Комитетом уход животных в университете Торонто и в соответствии с «руководство для ухода и использования экспериментальных животных» (2nd издание, Канадский совет по лечению животных, 2017).

1. Минимальный спинного мозга Хирургия травмы

Примечание: До операции убедитесь, что все хирургические инструменты и материалы подвергаются стерилизации соответствующими методами (Рисунок 1A).

  1. Постройте грудной поддержки арка, засучив 4 – 5 квадратов марлей и лентой их вместе в середине, чтобы получить фиксированный рулон марли.
  2. Поместите указатель мыши в камере индукции и инициировать анестезии с 5% изофлюрановая. Подтвердите отсутствие мыс щепотку рефлекс прежде, а также на протяжении всей процедуры. Как операция может занять свыше 30 мин, оптимизируйте для минимальной изофлюрановая воздействия (5 мин на 5%) и оставшееся время на 2 – 3%.
  3. Передать мыши носовой конус, приложенный к анестезии машине в 2-3% изофлюрановая поддерживающей дозы. Использование машинки для стрижки волос для удаления меха из спинку животного от середины спины до шеи/уши, чтобы разоблачить широкой прямоугольной области кожи для хирургии.
  4. Передать стереотаксического инструмента мышь, поместив его нос в прилагаемый носовой конус и стабилизации черепа с уха баров. Сохранить изофлюрановая на 5% во время размещения уха баров и нижней обратно в 2-3% закрепив стереотаксического устройства мыши.
  5. Администрировать предоперационной болеутоляющие лекарства внутрибрюшинно — мелоксикам (2,0 мг/кг). Щедро примените смазывание глаз на открытых мыши глаза, чтобы предотвратить истощение роговицы под наркозом.
  6. Место грудной поддержки арки под живот мыши во время выпрямления мыши тело и позвоночника, слегка потянув на основании хвоста. Для защиты хвост и все расширенные конечностей в положении звезда как используйте лабораторной маркировки ленты. После того, как безопасные, нажимаем арку грудной поддержки рострально, от живота мыши к верхней грудной клетки — чтобы подпирать грудного отдела позвоночника (рис. 1B).
  7. Подготовьте стерильные хирургические поле, дезинфекция меха обрезан кожи области, подготовленные в шаге 1.3 с 70% этиловом спирте, следуют повидон йод. Повторите дважды. Примените стерильные хирургические Пелерина сохранить широкий стерильные поле.
  8. С помощью лезвие скальпеля #10, сделать вертикальный разрез параллельно продольной оси животного от медианы обеих лопаток кривизны грудного отдела позвоночника. Втягивать кожу, чтобы разоблачить мягких тканей и контур позвоночника (рис. 1 c).
  9. Определите нижнюю границу suprascapular жировой ткани (это разграничивает позвоночного уровня Т4/5). С же лезвие #10 тщательно, но с силой, разрезать вдоль обеих сторон позвоночной кости T5-T8/9 для отсоединения обратно мышечных сухожилий из столбца.
  10. Вставьте зубы ретракторы в разрез сайтов по обе стороны от позвоночника. Коррекцию экспозиции, развернув ретракторы достаточно поднять позвоночника не ставя слишком много напряжения в задвинутом мышечных слоях (рис. 1 d).
  11. Под микроскопом хирургические тщательно очистите остаточного мышцы и других мягких тканей, обволакивающие позвоночника подвергать позвоночной кости (Рисунок 1E). Идентифицировать позвонков, которые будут удалены clasping остистого отростка позвонка с зубчатым щипцами и переместив ее слегка вверх и вниз.
    Примечание: Это должно разрешить идентификацию межпозвонковых суставов и подвергать небольшие отверстия (межпозвонковых отверстий) под позвонков интерес.
  12. Вставьте обе стороны подвергаются межпозвонковых отверстий, хвостовой позвоночной пластинки к подакцизным, одна голова изогнутые ножницы притупляются и отрезать соединительный межпозвонковых суставов на двусторонней основе.
  13. Поднимите вверх пластинки и отрезать верхний вложение пластинки изолировать и удалить кости.
    Примечание: Это будет подвергать нетронутой дурального мешка, содержащие спинного мозга (Рисунок 1F). Там может быть чрезмерное кровотечение, которые могут контролироваться путем размещения precut марлевый 1 см x 1 см на пострадавших районах и/или промыть стерильной PBS.
  14. С спинной срединной вен, выступающей в качестве ориентира вставьте Дорсолатеральное поверхности спинного мозга (около 1 мм в глубину) на приблизительно 0,5 мм бокового по обе стороны от средней линии 45° коленчатого вала кончика иглой 30 G (с иглы наклона вверх).
  15. Перенести иглы ~ 2 мм из хвостового ростральной (параллельно средней) таким образом, чтобы по всей длине скос иглы вставляется шнур питания. Извлеките иглу, повторяя через путь входа (рис. 1 g).
    Примечание: Там должно быть без кровотечения, но опухоль ткани спинного мозга может рассматриваться на данном этапе.
  16. Чтобы закрыть рану, удалите втягивающего устройства и шов мышцы спины на обе стороны вместе в средней линии, с помощью 6-0 рассасывающиеся шовные травмы. Использование 4-0 шовный материал стерильный шелковые впоследствии закрыть вышележащих кожи.
  17. Применять мазь с антибиотиком в верхней части поверхностно зашивается кожи для профилактики послеоперационной инфекции, используя кончик ватным тампоном. Администрировать послеоперационные анальгетик 0,1 мг/кг бупренорфина подкожно наряду с жидкостями (1 мл раствора Рингер лактат).
  18. Выключите изофлюрановая испарителем и кислорода. Удалите мышь из стереотаксического устройства и место в чистой клетке не постельными принадлежностями.
  19. Поместите указатель мыши в клетке около 30 см от тепла лампы для восстановления от анестезии и контролировать поведение после пробуждения. Мыши должен проснуться в течение 5-10 мин и имеют функцию задние конечности с возможным парез или хвост слабость после пробуждения.
  20. Контролировать поведение мыши в течение следующих нескольких дней и обеспечить надлежащий послеоперационный уход и анальгетиков (т.е., маш, лактат Рингера раствор жидкости подкожной, 0,1 мг/кг бупренорфин 2 x в день подкожно за 2-3 дней и мониторинг надлежащего веса ) в соответствии правилам Фонд местных животных и на индивидуальной основе как восстановления могут отличаться.

2. нейросферы Assay рассечение

Примечание: Выполните процедуры надлежащего стерильные тканевой культуры во всем.

  1. Ферментативный раствора препарата
    1. Добавьте 32 мл из Эрл сбалансированный соли раствора (EBSS) альбумина ингибитор ovomucoid содержащий стеклянная бутылка и аккуратно водоворот до растворения.
    2. Добавьте 5 мл EBSS стекла флакона предварительно порционные папаин и место в ванну воды 37 ° C распустить. Решение станет ясно (решение 1).
    3. Возьмите 500 мкл EBSS и добавить предварительно порционные DNase что я стеклянный флакон для получения концентрации 1 мг/мл (решение 2). Очень осторожно перемешать, Наклонив флакон взад и вперед и 250 мкл этой смеси для решения 1.
      Примечание: Все решения (решения 1 и 2) являются достаточно для обработки двух кусков ткани. Если обработка более кусочки ткани, размещения с более решения преп.
  2. Подготовка тканей и рассечение
    1. Лаборатория очистки пропитанной изофлюрановая в клетку мыши и разрешить 2-3 мин для паров для полностью анестезировать мыши. Следующие нокаут, удалите мышь из клетки и подтвердите отсутствие мыс щепотка рефлекс.
    2. Выполняйте шейки матки дислокации с тупым металлические предметы (например, металлической клетке card) чтобы усыпить животных. Спрей Усыпленных животных от своей шеи до середины спины, щедро с 70% этиловом спирте.
    3. В основании черепа используйте ножницы, чтобы отрезать голову и выбросите в сумку био. Сделайте срединной разрез в коже по всей длине спины подвергать мышц и позвоночной кости контур (рисунок 2A).
    4. Поднимите медиальной аспект каждой лопатки (т.е., лопатки — выявленные вышележащих жировой ткани) и используйте ножницы, чтобы вырезать мягких тканей (между лопатку и позвонков). Отдельные полностью предоставлять основные позвоночника.
    5. После искривления позвоночника вставьте же пару ножниц в верхней апертуры грудной и изолировать позвоночного столба, убирания прилагаемый ребра, мышц и внутренних органов (рис. 2B).
    6. Вставьте хвостового позвонков отверстия/открытие ножницы и вырезать межпозвонковых суставов по обе стороны пластинки (спинной поверхности). Возьмите особую осторожность, чтобы не повредить шнур нетронутыми. Продолжать этот процесс до желаемого уровня и/или подвергаются длина сетевого шнура.
    7. Аккуратно вырежьте spinal nerve(s) простирается латерально от шнур до передачи ткани спинного мозга в чашке Петри с регулярной искусственных спинномозговой жидкости. Держите образец на льду (рис. 2 c).
    8. Под микроскопом, рассечение сократить ткани спинного включить мм ~ 2 ростральной и каудально к месту травмы. Использовать две пары щипцами осторожно отделить шнур на 2 половинки продольно вдоль спинной и брюшной трещины (рис. 2 c').
    9. С microscissors вырежьте из раненых Дорсолатеральное белого вещества. Поместите кусок в 15 мл Конические трубки.
    10. Проведение одной половины спинного мозга вниз с щипцами, дразнить и удалить белого вещества, с помощью другой пары тонкой щипцов вдоль rostrocaudal степени спинного изолировать желаемого перивентрикулярной региона. Повторите для другой половины спинного мозга.
    11. Место кусков ткани перивентрикулярной в отдельном 15 мл конические трубы. Использование microscissors и мягко фарш ткани против стены конические трубы.
      Примечание: Изменения ткани диссоциации являются папаин диссоциации системы протокол23 и ранее описанных ткани подготовки процедуры24.
    12. Добавьте 2.5 мл нового решения 1 (шаг 2.1.3) образца ткани и поместите на рокер при 37 ° C за 30 мин.
    13. Аккуратно нарезанных ткань в растворе с кончиком пипетки 1000 мкл. Центрифуга суспензию облачно клеток на 300 x g 5 мин на RT.
    14. Подготовить раствор 3 с 2,7 мл Эрл сбалансированного солевого раствора, 300 мкл раствора ингибитор ovomucoid (шаг 2.1.1) и 150 мкл DNase I решения (шаг 2.1.3).
    15. Отменить супернатант от шаг (шаг 2.2.13) и Ресуспензируйте в 1,5 мл раствора 3 на предыдущем шаге (шаг 2.2.14).
    16. Слой этой новой суспензию клеток (шаг 2.2.15) на вершине 5 мл раствора ovoimucoid ингибитор (шаг 2.1.1) в новой 15 мл Конические трубки для создания градиента разрывными плотности. Центрифуга на 300 x g 5 мин на RT.
    17. Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 2 мл neurobasal СМИ. Центрифуга на 300 x g 3 мин на RT.
    18. Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 1 мл neurobasal средств массовой информации. Фильтр подвеска с помощью стрейнер ячейки 20 мкм, следуют 4 мл средств массовой информации для общего объема 5 мл.
  3. Покрытие
    1. Подготовить культуры СМИ для роста нейросферы, дополняя neurobasal СМИ с эпидермального фактора роста (20 нг/мл) / фактора роста фибробластов (20 нг/мл) / гепарина (2 мкг/мл) [для окончательного NSCs] или leukemina тормозящий фактор (10 нг/мл) [для примитивных NSCs]. Добавьте 10 мл либо СМИ в колбу 25 мл культуры ткани.
    2. Используйте Горяева и Трипановый синий краситель для вычисления числа клеток в суспензии (шаг 2.2.18)25. После вычисления, добавить клетки культуры ткани колбы в (шаг 2.3.1) подготовлен к клоновых плотность 10 клеток/мкл и место культуры ткани колбу с добавил клеток в инкубатор для 24 h (37 ° C, влажность 95%, 5% CO2).
      Примечание: Пример метода подсчета является следующим: принять 10 мкл суспензии клеток и перемешать с 10 мкл Трипановый синий краситель. Добавьте 10 мкл этой смеси в Горяева. В разделе 10 X световой микроскоп подсчитать количество живых клеток и сумма всех клеток, учитываются в пределах 4 4 x 4 квадрантах. Использовать формулу: 100000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1000] дать объем суспензии клеток, покрываемые в колбе тканевой культуры каждой 25 мл для обеспечения клоновых плотность (10 клеток/мкл).
    3. После 24 часов аккуратно водоворот колбу и вылить содержимое в 15 мл Конические трубки. Центрифуга на 300 x g 5 мин на RT.
    4. Отменить супернатант и вновь приостановить клеток в 1 – 2 мл свежего neurobasal СМИ.
    5. Повторите шаг 2.3.2 подсчитать количество ячеек в клетках подвеска и пластины на клоновых плотности в 24-ну культуры ткани пластины, содержащий 500 мкл их соответствующих Митоген дополнены СМИ (EFH для окончательного роста НСК) и ЛИФА для примитивных НСК роста.
      Примечание: Используйте адаптированы формулу (5000 / [X клеток/4) x 2 x 10 x 1000) вычислить объем суспензии клеток, покрываемые в каждом хорошо содержащие 500 мкл средств массовой информации.
    6. Поместите пластины, содержащие клетки в инкубатор (37 ° C, влажность 95%, 5% CO2), чтобы расти в течение 7 дней.
  4. Подсчет
    1. После 7 дней в культуре удалите пластины и посмотреть под микроскопом света. Количественно neurospheres путем подсчета сферические колонии, которые > 80 мкм в диаметре для dNSCs культур и > 50 мкм в диаметре для pNSCs культур.
      Примечание: При желании, neurospheres может быть далее пассированный26 или продифференцировано. Если клетки больше не нужны, распоряжаться путем добавления ускоренного перекиси водорода к скважинам (приблизительно 1 мл) для 20 мин так что цвет среды желтеет. Затем слейте.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После операции мышей должны испытывать минимальный моторного дефицита, которые могут включать хвост и возможных парез задних конечностей до 24 ч. После этого времени должны испытывать мышей не задних конечностей паралич и парез и минимальные изменения в походке.

Рисунок 3 показывает представитель результаты от нейросферы пробирного 5 дней после минимальной спинного мозга. Абсолютное число dNSC произ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ходе хирургической процедуры есть несколько важных шагов, где исследователь должен уделять особое внимание для того, чтобы получить оптимальные результаты и минимизировать изменчивость между животными. Необходимо проявлять осторожность при ингаляционной анестезии (изофлюрановая) во время операции как анестетик было показано, что нейропротекторной эффекты с длительной экспозиции27. Соответственно при изучении регенеративной способностью спинного мозга после травмы, приложить усилия, чтобы выполни...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансируется Фондом Krembil (эксплуатационные Грант CMM). WX был удостоен премии Студенческая Carlton Маргерит Смит. NL получил стипендию аспирантов Онтарио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Agricola RetractorFine Science Tools17005-04
Moria Vannas-Wolff Пружинные ножницы (изогнутые)Fine Science Tools15370-50Настроить при заказе для получения тупых кончиков
Graefe Щипцы (прямые, 1 x 2 зуба)Fine Science Tools11053-10
Extra Fine Graefe Щипцы (изогнутые, зубчатые)Fine Science Tools11152-10Или любые другие щипцы для наложения швов
Hartman Hemostats (прямые)Fine Science Tools13002-10Или любые другие подходящие для наложения швов
Scalpel Handle #3Fine Science Tools10003-12Или любые другие подходящие
машинки для стрижки волосamazon.cahttps://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BAили любые другие подходящие
стереотаксические инструментStoeling51500или любой другой подходящий
Бупренорфинили любой подходящий санкционированный моим учреждением по уходу за животными
Meloxicamили любой соответствующий санкционированный учреждением по уходу за животными
Tears Naturale P.M.Alconhttps://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXEили любой другой подходящий
IsofluraneBaxter International IncDIN 02225875или любой другой подходящий для анестезии
ватные палочки Cottom Swabsamazon.ca
Хлопчатобумажная марляFisher Scientific13-761-52
30 г ИглыBecton Dickinson305106для травм
25 г ИглыBecton Dickinson305122для инъекций наркотиков
1 мл шприцевBecton Dickinson3090659для инъекций лекарств
3 мл шприцевBecton Dickinson309657для инъекций жидкости
4-0 Шовныйuoftmedstore.com2297-VS881для наложения швов на кожу
6-0 Шовuoftmedstore.comVS889для наложения швов на мышцы
Полиспориновая мазьamazon.ca102051
Изофлуран ВапорайзерVetEquip901806
конические пробирки объемом 15 млThermoFisherЛюбые
подходящие чашки ПетриThermoFisherлюбые подходящие
Trypan BlueThermoFisherЛюбой
гемоцитометрThermoFisherЛюбая подходящая
центрифугаThermoFisherЛюбые
подходящие стандартные инструменты для препарированияТонкая наука Диссекционный
микроскопZeissStemi 2000
Счетный микроскопOlympusCKX41
Нейронный базал-А СредаИнвитроген10888-022
B27Инвитроген17404-044
Пенициллин-стрептомицинGibco15070
L- глутаминGibco25030
DMEMInvitrogen12100046
F12Invitrogen12700075
30% глюкозыSigmaG61521 м, 9,01 г в 100 мл dH<суб>2O
1 м глюкоза
7,5% NaHCO3SigmaS5761155 мМ, 1,30 г в 100 мл dH2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPESSigmaH337523,83 г в 100 мл dH2O
Apo-TransferrinR& D Systems3188-AT
Путресцин SigmaP7505
ИнсулинSigmaI5500
СеленSigmaS9133
ПрогестеронSigmaP6149
Система диссоциации папаина Worthington Biochemical CorporationPDS1 флакон папаина можно использовать для 2 образцов
Эпидермальный фактор ростаInvitrogenPMG8041порошок, восстановленный с 1 мл гормональной смеси и аликвотированный во флаконы 20 мкл для хранения в морозильной камере
Fibroblast GrowthFactor InvitrogenPHG0226порошок, восстановленный с 0,5 мл гормональной смеси и аликвотированный до 20 мкм; L флаконы для хранения в морозильной камере
HeparinSigmaH3149
Фактор ингибирования лейкемиив домашних
Trypan Blue
Гемоцитометр
24 лункиNUNC
2 M NaClSigmaS588611,69 г в 100 мл dH2O
1 М KCLSigmaP54057,46 г в 100 мл dH2O
1 M MgCl2SigmaM239320,33 г в 100 мл dH2O
108 mM CaCl2Sigma C79021,59 г в 100 мл dH2O
https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS условиях

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
  2. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
  3. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  4. Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
  5. Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
  6. Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
  7. Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
  8. Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
  9. Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
  10. Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
  11. Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
  12. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
  13. Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
  14. Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
  15. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  16. Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
  17. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  18. Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
  20. Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
  21. Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
  22. Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
  23. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
  24. Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  25. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  26. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  27. Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
  28. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  29. Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи