Хотя многие насекомых подотряда клопы (Insecta: полужесткокрылые) являются ядовитыми, их состав яда и функции их яд токсинов в основном неизвестных. Этот протокол описывает методы для сбора heteropteran яды для дальнейшей характеризации, используя электростимуляции, притеснения и железы рассечение.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Заготовка Venom токсины от убийца ошибок и других насекомых, Heteropteran
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Heteropteran насекомых, таких как убийца (Хищнецы) и гигантских воды ошибок (Belostomatidae) произошли от общего предка хищные и ядовитая, и большинство сохранившихся heteropterans сохранить этот трофических стратегии. Некоторые heteropterans перешли кормления на крови позвоночных (например поцелуи ошибок, Триатомовые клопы; и клопов, постельные клопы) в то время как другие вернулись к питанию растений (наиболее Pentatomomorpha). Однако за исключением слюны, используемые целовать ошибок для облегчения подачи крови, мало что известно о heteropteran яды, по сравнению с яды пауков, скорпионов и змей.
Одним из препятствий для характеризации heteropteran яд токсинов является структура и функции желез яда/губной, которые оба морфологически комплекс и несколько биологических ролями (обороны, добычей захвата и дополнительное устное пищеварение). В этой статье мы опишем три метода, которые мы успешно используется для сбора heteropteran яды. Во-первых мы представляем электростимуляции, как удобный способ собрать яд, который часто является смертельным, когда вводят в добычи животных, и которое устраняет загрязнение железистой ткани. Во-вторых мы покажем, что нежный домогательства животных достаточно для производства экструзии яд от Хоботок и/или ядом плевать в некоторых группах heteropterans. В-третьих мы описываем методы урожай яд токсинов путем рассечения анестезированные животных для получения яд желез. Этот метод дополняет другие методы, поскольку это может позволить Уборка токсины из таксонов, в которых электростимуляции и преследования являются неэффективными. Эти протоколы позволят исследователям собрать токсины от насекомых heteropteran структура функция определения характеристик и возможного применения в медицине и сельском хозяйстве.
Введение
Heteropteran яды, мощно биоактивных веществ1. К примеру яд/слюны выделениями крови кормления клопы как целовать (Триатомовые клопы) и кровать ошибок (постельные клопы) облегчает кормление нарушения гемостаза2. Токсины в эти яды целевой несколько путей, включая коагуляции, агрегации тромбоцитов и сужение кровеносных сосудов, а также боль и зуд пути. Яды из большинства других видов heteropteran приспособлены для облегчения хищничество, вместо того, чтобы кровь кормления. Их яды вызывают паралич, смерть и сжижение ткани, когда вводят в беспозвоночных3,4. Когда вводят в позвоночных, их яд может также иметь серьезные последствия. К примеру инъекции яда из убийца ошибка Holotrichius innesi в позвоночных вызывает боль, паралич мышц и кровотечений; мышей envenomated от этот ошибка быстро умирают из-за паралич дыхания5.
Транскриптомики и протеомических исследований выявили белок состав некоторых heteropteran яды. Яды хищные виды богаты протеаз, другие ферменты и пептидов и белков неизвестных структуры и функции6,,78. Целовать ошибка яд богата triabin белка семьи, члены которых глубоко влиять на коагуляцию, агрегации тромбоцитов и вазоконстрикция2,9. Однако не известно, какие токсинов лежат в основе большинства bioactivities яда. Например яд целовать ошибки Триатомовые клопы infestans поступили обезболивающее и подавляют натрия каналы10, однако компоненты, ответственные по-прежнему быть раскрыты. Аналогичным образом не известно, какие элемента(элементов) убийца ошибка яд вызывает паралич или боль. Предпосылкой для определения токсинов, ответственность за bioactivities частности яда и характеризующих структуру и функции Роман яд токсинов, является получение яда.
Яд были получены из heteropterans электростимуляции5,6,,78,11,12,13, провокации обороны ответы4,8, механически сжимая грудную клетку12,14,15,16, рассечения, яд желез8,17 ,18,19,20,21,22и применение агонистами ацетилхолина мускариновых рецепторов23. Судя потенциальные преимущества и недостатки любого метода осложняется морфология heteropteran яд желез, которые состоят из основных железы с двух отдельных люмен, передней основные железы (AMG) и задняя основные железы (PMG), а также связанные аксессуар железы (AG). Эти отсеки разные железы производят секреции различных белков, которые могут быть специализированы для различных биологических функций, включая захват добычу, обороны и дополнительное устное пищеварение8,17. В peiratine и ectrichodiine убийца ошибок AMG был связан с добычей захвата и PMG с экстра устные пищеварение17. Однако в harpactorine ошибка Pristhesancus plagipennis PMG специализирован для захвата добычу и пищеварение тогда как AMG предположил выделять оборонительных яд8. AG был описан как имеющий мало секреторная функция ошибок убийцы8 или как основных сайт хранения протеазы в гигантских воды ошибок23. Очевидно чтобы уточнить функции каждого отсека железы среди различных подгрупп heteropteran и определить функции большинства яд токсинов необходима дальнейшая работа. В настоящем докладе мы описываем протоколы для уборки яд токсины от heteropterans к этой цели.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол соответствует политике университета Квинсленда, изложенных в ответственный подход и использование животных в области преподавания и научных исследований (PPL 4.20.11), а также национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралийский кодекс для ухода за и использования животных для научных целей (8-й выпуск 2013).
Предупреждение: не заботиться быть envenomated при обработке ошибок убийцы. Позаботьтесь, чтобы защитить глаза при обработке видов, плевать яд оборонительно. Будьте осторожны во всем чтобы не травмировать экспериментальных животных. Это включает в себя мониторинг давления на ограничения такие как резинки и обеспечение того, что Хоботок не нарушается.
Примечание: При необходимости, обезболивают животных под воздействием CO2 на 0,5-2 мин или охлаждения для 4-10 ° C до яд уборки в цель 1-3 для содействия безопасной передачи и сдержанность. Обезболивания не является строго обязательным, но может способствовать безопасной сдержанность гибкой или сильный образцов. Однако животных должна быть проснулся, чтобы позволить яд уборки. Имейте в виду, нисходящие приложения, при принятии решений или не добавить ингибиторов протеазы.
1. Уборка токсины яд по электростимуляции
- Получение образцов из которого собрать токсины.
- Использование предварительно подготовленных пластиковые пинцет с положительным и отрицательным электродами монтируется на либо отзыв. Подключите электрифицированных пинцет электростимулятор или источник постоянного напряжения, что позволяет регулировки напряжения.
- Для малых (~ 10 мм) и большие (~ 25 мм) убийца ошибок используйте пика напряжения 15 и 25 V соответственно.
- Для более крупных heteropterans таких гигантских воды ошибок используйте до 40 V.
- Останови живой ошибок путем крепления их к платформе, с использованием резинкой над грудной клетки.
- Место кончике Хоботок в подходящей собирая подсказки. Ошибок убийцы используете наконечник пипетки P200. Гигантские воды ошибок Отрежьте конечности от оконечности Р200 для увеличения размера апертуры.
- Аккуратно поднимите Хоботок с закрытой парой чистого пинцета и нажмите открытой диафрагмой коллекции кончик над конце Хоботок.
- При желании, Совет поглощение ~ 5 мкл ультрачистая вода до размещения Хоботок в сборе. Это уменьшает потери яда, оставаясь внутри чаевые, хотя собранные яд будет разведен.
- Применение электростимуляции. Окуните стимулирующих электродов в проводящего геля, например 2,5 М NaCl/50% глицерина. Применять электроды к грудной клетки. Для belostomatids применяются два электрода к спинной задней поверхности головы.
- Хранить яд для предотвращения autodegradation. После того, как яд выдавливается, быстро, передача его в трубку при-20 ° C или -60 ° C, или трубка, содержащая ингибитор протеазы коктейль.
- Повторите шаги 1.5 и 1.6, пока не приобрела достаточно яда или без дальнейших яд поступает.
2. заготовка Venom токсинов, домогательства
- Готовить животных для уборки яда и поместите кончик Хоботок в коллекции прихожую, как описано в пунктах 1.1 и 1.3-1.4.
- Если яд экструдированный спонтанно, перейдите к шагу 2.3. Если нет, то беспокоить животных, нежно прикасаясь к нему на ноги, живот и антенн с помощью пинцета пока яд производится.
- Быстро передавать яд трубку в-20 ° C-60 ° C или трубка содержащий ингибитор протеазы коктейль, при желании.
3. заготовка Venom токсинов от преследования от яда, «Плевать» видов
- Обезболивают, или частично обезболивают, насекомых перед ее удалением из его корпуса для предотвращения преждевременной оборонительных плевать.
- Спровоцировать ядом плевать поведение. Содержат и переместите насекомых, используя глубокий крышку стандарта 90 x 16 мм Петри. Держите крышку слегка задний и 1-4 см выше насекомых для предотвращения бегства. Большинство насекомых будет плевать несколько раз, часто в быстрой последовательности. Убедитесь, что все яд собирается в нижней части блюда.
- Соберите яда на нижней Петри, полоскание с 10 мкл ультрачистая вода. Быстро, передача его в трубку при-20 ° C или -60 ° C, или трубка, содержащая ингибитор протеазы коктейль.
4. заготовка Venom токсинов, рассечение железы
- Приносить в жертву животных. Сильно обезболивают или убивать животных, с использованием > 5 минут воздействия CO2. Труба чистая CO2 непосредственно в воздух отверстия корпуса Корпус животного.
- PIN-код насекомых рассечение лоток. Ошибок убийцы вскрыть через вентральной поверхности (4.3). Гигантские воды ошибок вскрыть через спинной поверхности (4.4).
- Вентральной рассечение
- Вставьте три штыря в задней брюшной полости для насекомых и удерживайте без проколов яд желез.
- Вырежьте короткий срединной линии разреза в брюшной поверхности живота с помощью миниатюрных скальпель. Используйте миниатюрные ножницы для расширения срединной линии разреза кпереди на голове, заботясь, чтобы вырезать экзоскелет только и не повредить внутренние структуры.
- Подвергать внутренние структуры, сделайте несколько боковых порезов, простирается от срединной линии разреза в сторону насекомых. Затем контактный обратно каждый взмах вентральной экзоскелет выявить внутренние структуры.
- Для больших убийца ошибок сделать четыре боковые разрезы, в середине живота, передней живот, между первым и вторым ног и перед первой ноги.
- Дорсальная рассечение
- Удаление крылья у основания. Вставьте три штыря в задней брюшной полости для насекомых и удерживайте без проколов яд желез.
- Вырежьте срединной линии разреза от головы в брюшную полость, с использованием миниатюрных ножницы и скальпеля, заботясь, чтобы вырезать экзоскелет только и не повредить внутренние структуры.
- Силу друг от друга две половинки насекомых. Место несколько контактов боково вдоль длины насекомое оставить подвергаются внутренней полости.
- Удаление полет мышцы с помощью пинцета.
- Наводнение рассечение лоток. Добавление PBS до тех пор, пока ошибка погружен разрешить внутренние структуры плавать вверх и быть более легко визуализировать.
- С помощью микро ножницы и щипчики, осторожно удалите соединительной и нервной ткани и трахеи. Яд желез появляются как удлиненные, светопрозрачные конструкции, вдоль каждой стороны желудочно-кишечного тракта.
- Определите основные железы, его характерный внешний вид, с передней и задней лопастями и два короба, встреча в хилус.
- При необходимости, определите аксессуар железы путем отслеживания воздуховод от хилус. Бесплатно основные железы путем разрезания два короба, вытекающих из хилус.
- Сбор желаемых железы люмен. Передать microcentrifuge железы на льду, содержащих 30 мкл PBS или PBS плюс ингибитор протеазы коктейль. Лэнс желез с чистой острым PIN-код.
- Вортекс для 10 s и центрифуги (1 мин, 5000 × g, 4 ° C) очистить железы люмен. Удаление железистой ткани, с помощью пинцета.
- Уточнить экстракт токсин. Центрифуга (5 мин, 17000 × g, 4° C) для удаления твердых частиц, сохраняя супернатант и отменяя гранулы. Хранить при-20 ° C или -60 ° C для предотвращения деградации autoproteolytic.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Некоторые виды heteropteran, например harpactorine P. plagipennis и reduviine Platymeris Радаманте, надежно доходность больших количествах (5-20 мкл) яд в ответ электростимуляции (Таблица 1). В общем большинство peiratine, reduviine и harpactorine ошибок принести яд в ответ на этот метод. Среди stenopodaine ошибок электростимуляция вызвал яд от Oncocephalus sp. но не Thodelmus sp. Holoptiline и emesine ошибок выборки не приносят значите...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее важным этапом в уборке убийца ошибка яд является выбор соответствующего метода в зависимости от целей исследования. Каждый из трех методов, представлены для уборки heteropteran яды имеет преимущества и недостатки в зависимости от нисходящие приложения.
Вызывая ошибки высылать яд от Хоботок (протоколы 1-3) позволяет избежать загрязнения яда, железистой ткани. Кроме того эти методы являются нелетального и может повторяться много раз в течение жизни ошибка. Электростимуляция обычно обесп...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы признаем финансовую поддержку от Австралийский исследовательский совет (гранты DP130103813 и LP140100832 к G.F.K., ПОЛУПРОЗРАЧНЫЕ стипендий DE160101142 до EABU), австралийского национального здравоохранения и Совета медицинских исследований (основных исследовательских стипендий APP1044414 к G.F.K.) и университета штата Квинсленд (докторантура стипендий для A.A.W.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Электростимулятор | Grass Technologies | S48 Квадратный импульсный стимулятор | Электростимулятор с возможностью импульсной электростимуляции |
| Пинцет Featherlight | Австралийские энтомологические принадлежности | E122B | Для работы с живыми ядовитыми насекомыми |
| Коктейль ингибиторов протеазы | Sigma | 4693124001 | Для предотвращения аутотеолитического переваривания яда |
| Диссекция | оборудование Австралийские энтомологические принадлежности | E152Micro | Для тонких препараций |
| Булавки от насекомых | Австралийские энтомологические принадлежности | E162 | Для тонких препараций |
Ссылки
- Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43(2016).
- Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
- Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
- Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
- Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. Animal and Plant Toxins. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).
- Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
- Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755(2018).
- Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44(2016).
- Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
- Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
- Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
- Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
- Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
- Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
- Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
- Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
- Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).
- Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. Insect Pest Management, A Current Scenario. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).
- Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
- Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
- Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
- Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
- Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
- Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
- Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
- Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
