Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Геном широкий наблюдения ошибок транскрипции в эукариотических организмов

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57731

⸱

13 сентября 2018 г.

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает исследователей с новым инструментом для мониторинга верности транскрипции в несколько модельных организмов.

Аннотация

Для добросовестного выражение генетической информации требуется точная транскрипция. Удивительно, однако, мало что известно о механизмах, которые управляют верности транскрипции. Чтобы заполнить этот пробел в научных знаниях, мы недавно оптимизирован круг последовательности проба для выявления ошибок транскрипции на протяжении транскриптом Saccharomyces cerevisiae, дрозофилыи Caenorhabditis Элеганс. Этот протокол обеспечит исследователей с новый мощный инструмент для сопоставления пейзаж транскрипции ошибки в эукариотических клетках, что механизмы, которые управляют верности транскрипции можно освещены в беспрецедентных деталях.

Введение

Геном обеспечивает точные биологические план жизни. Чтобы реализовать этот план правильно, это важно для геном транскрибируется с большой точностью. Однако маловероятно быть безошибочной транскрипции. Например РНК-полимеразы уже давно известны к ошибкам в пробирке1,2, и недавно было показано, что они совершают ошибки в естественных условиях также3,5,6, особенно, когда сталкивается с ДНК повреждения7,8,9,10. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что транскрипция ошибки возникают непрерывно во всех живых клетках, предполагая, что они могут быть мощным источником мутировавших белков.

Этот процесс называется transcriptional мутагенеза, отличается от классической мутагенез двумя способами. Во-первых в отличие от генетических мутаций, транскрипция ошибки влияют на митотическая и пост митотическая клетки, как они не зависят от репликации ДНК. Изучение механизмов, которые влияют на верность транскрипции таким образом, даст ценную информацию о мутации нагрузки митотическая и пост митотическая клеток. Интересно, что ошибки транскрипции недавно были вовлечены в поощрении белка агрегации11,12,13 и были предположил вносить обоих канцерогенеза10 и развитие резистентности к антибиотикам бактерий14.

Во-вторых в отличие от генетических мутаций, транскрипция ошибки являются временными по своему характеру. Их временное существование является особенно сложным, потому что он делает ошибки транскрипции чрезвычайно трудно обнаружить. Например в то время как несколько лаборатории разработали ценные репортер анализов для изучения transcriptional мутагенеза, эти анализы являются только возможность измерить транскрипции ошибки в ограниченном количестве контекстов и модель организмы4,15. Чтобы преодолеть эти ограничения, многие исследователи обратились к технологии последовательности РНК (РНК seq), которая теоретически позволяет транскрипции ошибки быть записан в течение транскриптом любых видов. Однако эти исследования легко осложняется библиотека строительство артефактов, таких как обратная транскрипция ошибки, ошибки амплификации PCR и подверженных ошибкам характер последовательности сам. Например реверс transcriptases совершить примерно одна ошибка каждые ~ 20000 баз, в то время как РНК полимеразы (RNAPs), как ожидается, сделать только одну ошибку каждый 300.000 базы5,6. Потому что ошибка скорость обратной транскрипции только карлики погрешность РНК полимеразы внутри клетки, это практически невозможно отличить истинное транскрипции ошибки от артефактов, вызванных библиотека подготовку в традиционных РНК-Seq данных ( Рисунок 1a).

Для решения этой проблемы, мы разработали оптимизированной версии круг-последовательности (Cirseq, или C-seq отныне) пробирного5,16. Этот assay позволяет пользователю обнаружить ошибки транскрипции и другие редкие варианты в РНК на протяжении транскриптом5. Assay последовательности циркулярное письмо носит это имя, потому что ключевой шаг в этот assay вращается вокруг РНК рецензий. После того, как circularized РНК цели, они обратной транскрипции в подвижного круга моды, производить линейное cDNA молекул, которые содержат многочисленные копии один и тот же шаблон РНК. Если ошибка находился в одном из этих шаблонов, эта ошибка будет также присутствовать в каждый один повторить содержащийся в молекуле cDNA. В противоположность этому ошибки, представленный обратной транскрипции, амплификации PCR или последовательности обычно возникают случайно и таким образом будет присутствовать только один или два повторяется. Таким образом путем создания консенсуса последовательность для каждого cDNA молекулы и отличать случайные ошибки от ошибок, которые происходят в все повторяется, Библиотека строительство артефакты эффективно может быть отделена от истинной транскрипции ошибок (рис. 1b).

Если используется должным образом, C-seq assay может использоваться для точно определить уровень базового замен, вставок и удалений в РНК на протяжении транскриптом любых видов (см. Например, Траверс и Ochman17). Например мы использовали C-seq assay предоставлять генома общесистемной измерения коэффициента ошибок транскрипции в Saccharomyces cerevisiaeи Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans с разрешением единый базовый5 (неопубликованные наблюдения). Первоначально используется для точного последовательности РНК вируса населения, это оптимизированная версия C-seq пробирного была оптимизирована для сведения к минимуму суровых условиях во время подготовки библиотеки, которые способствуют библиотека строительство артефакты. Кроме того с помощью ряда коммерчески доступные наборы, пропускная способность assay значительно улучшилось, а также ее удобство. Если используется должным образом, этот assay может точно определить транскрипции ошибок в репликации, тем самым значительно улучшая на предыдущих исследований6тысячи. В целом этот метод является мощным инструментом для изучения transcriptional мутагенеза и позволит пользователю получить новые идеи в механизмы, контролирующие точность транскрипции в широком диапазоне организмов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Полиадениновый вездесущий; Поэтому, тщательно очистить рабочую область путем распыления его вниз с реактивом обеззараживания (например, РНКазы ПРОЧЬ) и на 70% спирте. Спрей вниз любой пипетки, ручки или трубы стойки для удаления потенциальных источников загрязнения РНКазы.
  2. Для дальнейшего предотвращения полиадениновый от загрязнения образцов, носите пальто лаборатории или джемпер во время экспериментов. Избегайте контакта между Перчатки и внутри трубы, которые будут использоваться, особенно при извлечении их из коробки или сумку.
  3. Перед обратной транскрипции часто менять перчатки.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, не прерывалось эксперимент до обратной транскрипции.

2. ячейки и животных культуры и коллекции

  1. Saccharomyces cerevisiae роста и коллекции
    1. Если библиотека C-seq из дрожжей, сначала прививок одной колонии S. cerevisiae в 3 мл средних содержащих экстракт дрожжей, аденин, Пептон и декстрозы (YAPD) и проинкубируйте его на ночь на 30 ° C в прокатки барабан.
    2. Утром, повторно прививать культуру в 50 мл YAPD средних оптической плотности (OD) 0.1 и расти ячейки до тех пор, пока они достигают ОД 0,5 – 0,7 (~ 7 х 106 клеток/мл).
    3. Сбор культуры всего 50 мл (примерно 350 х 106 клеток) в 50 мл Конические трубки и спина клетки вниз на 3 мин на 2100 x g. Осторожно удалите средство YAPD и помыть лепешка с PBS 1 x.
    4. Затем Ресуспензируйте гранулы в 480 мкл буфера lysis, 48 мкл 10% SDS и 480 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта (25:24:1), pH 6.8. Вихрь образца на максимальной скорости 5 s, и передачи его колпачок 1,5 мл трубки с 750 мкл ледяной циркония бусины (входят в комплект). Перейдите к шагу 3 настоящего протокола для лизиса клеток и общее извлечение RNA.
      Примечание: Все реагентов, необходимых для шага 2.1.4 предоставляются в рекомендуемой дрожжи РНК добыча комплект. Эти реагенты работать одинаково хорошо для дрожжей, червей и мух так, что после сбора дрожжей (шаг 2.1), Вормс (шаг 2.2) или мух (шаг 2.3), единый подход может использоваться для создания библиотек C-seq (шаги 3 – 10).
  2. Caenorhabditis elegans культура и коллекции
    1. Если библиотека C-seq от червей, депозит 30 взрослых червей на свежие плита агара, пятнистый с ОР50 бактериями.
      Примечание: Пять пластины являются достаточными для 1 репликации.
    2. Культура червей на 4 дня и собирать червей, осторожно промывки пластин с 5 мл M9 СМИ и бассейн червей в единый 50 мл Конические трубки.
    3. Спиновые глисты вниз на 100 x g на 2 мин для создания гранул. Замедления центрифуги на минимальной скорости, возможно, чтобы не нарушить гранулы.
    4. Осторожно переместить червей в 1,5 мл трубку, мыть их два раза в 1,5 мл M9 СМИ и центрифуги трубки на 100 x g 1 мин для удаления бактерий и генерировать чистой 100 мкл Пелле червей.
    5. Ресуспензируйте червей в 480 мкл буфера lysis, 48 мкл 10% SDS и 480 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта. Вихрь образца на максимальной скорости 5 s и передачи его колпачок 1,5 мл трубки содержащих 750 мкл ледяной циркония бусины. Перейдите к шагу 3 настоящего протокола для лизиса червей и общее извлечение RNA.
  3. Drosophila melanogaster культуры и коллекции
    1. Если библиотека C-seq от мух, культура 20 – 25 мух в пузырьки, которые содержат декстрозы или средство на основе патоки. Аликвота мухи над 3 ампул, так что каждый флакон содержит около 8 мух.
    2. Чтобы собирать мух, место флакона в ведёрке со льдом до седативные мух. Затем соберите их с кистью в 1,5 мл. Не собирать мух, CO2 лечение.
    3. Пусть летит теплой комнатной температуры (RT) и быстро добавить готовые смеси 500 мкл буфера lysis, 50 мкл 10% SDS и 500 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта в трубку. Используйте micropestle чтобы молоть вверх мух с примерно 15 ударов, в сопровождении фирмы скручивания движения, когда толкателем достигает нижней части трубки.
    4. Вылейте смесь мух и лизис СМИ в колпачок 1,5 мл трубки содержащих 750 мкл ледяной циркония бусы и вихрь на максимальной скорости, для 5 s. переходите к шагу 3 настоящего протокола для lysis мух и общее извлечение RNA.

3. Общая РНК

Примечание: на данный момент, сходятся все три протокола, и единый подход может использоваться для создания библиотек C-seq.

  1. Плотно завинтите крышку и Подсоедините трубку к Вортекс с адаптер или клейкой лентой. Вихревой трубе на максимальной скорости на 10 минут, чтобы лизируйте образцы. Затем Центрифугуйте образцы на 16,100 x g 5 мин для разделения органических растворителей из водной фазы.
  2. Тщательно удалить 400 – 500 мкл водной фазе не нарушая интерфаза белый, облачный и добавить его в 15 мл конические трубка, содержащая 1.9 мл буфера привязки. Тщательно перемешайте их, vortexing.
  3. Добавьте 1,25 мл 100% этанола и перемешайте образец по vortexing. Передавать 700 мкл пример фильтра картриджа, собранные в коллекции трубку и спина образца на 14,500 x g для 30 s. повторять до тех пор, пока все образца передается через картридж.
    Примечание: на данный момент, образец может оказаться немного непрозрачной. Если слишком много ячеек, червей или мухи были лизированы, преципитаты может показаться, что может засорить фильтр.
  4. Промойте фильтр один раз с 700 мкл промывочного раствора 1 и дважды с 500 мкл промывочный раствор 2 или 3. Закончите стирок, крутя образцов 14500 x g за 2 мин удалить любые излишки этанола.
  5. Передать трубку Дельфин 1,5 мл картриджа фильтра и 108 мкл подогретую Элюирующий раствор (65 ° C).
    Примечание: Никогда не подвергайте образцов РНК до температуры выше 65 ° C до обратной транскрипции, как делать так будет провоцировать цитозина урацила дезаминирование события, которые невозможно отличить от ошибок транскрипции.
  6. Снизить загрязнение ДНК в изолированных РНК (см. шаги 2.1-3.4) путем добавления 11 мкл 10 x DNase буфере, 2 мкл битор РНКазы и 4 мкл DNase I (8 U) и инкубировать их при 37 ° C за 30 мин.
  7. После переваривания 11 мкл Реагента DNase инактивации. Вихревой смесь и дайте ему сидеть в РТ за 5 мин. Затем центрифуга образца на 15000 x g 3 мин Пелле инактивацию реагент и собирать 110 мкл супернатант не нарушая гранулы. Передать супернатант 1,5 мл.
    Примечание: DNase инактивацию реагент может быть довольно трудно накапайте должным образом, так что визуально проверить наконечник пипетки после каждого дозирования действий. Если реагент инактивации становится слишком вязким для пипетки, добавьте 10 мм трис-HCl (рН 7,4) равен 1/5 оставшихся тома.
  8. (Контроль качества) Измерьте концентрацию общего РНК с помощью спектрофотометра. Затем отложите 1 мкл всего РНК и разбавляют до концентрации 10 нг/мкл в свободной от нуклеиназы воды (NF). Запустите РНК на инструмент анализа соответствующей нуклеотидной с высокой чувствительности РНК ленты для обеспечения что РНК не снижается и Эрин значение по крайней мере 8.5 или выше (Рисунок 2Б).

4. мРНК обогащения

  1. Выполните мРНК обогащения с мРНК алкалический комплекта (см. Таблицу материалы). Мкл 140 NF воды в общий объем 250 мкл пример. Затем, 250 мкл 2 x привязки буфера, тщательно перемешать образца, vortexing и 15 мкл бусины oligo (dT).
  2. Смешать образца, закупорить вверх и вниз и Инкубируйте на 65 ° C на 2 мин. Затем поместите образец в РТ за 10 мин. Наконец центрифуга образца на 16,100 x g за 2 мин до Пелле шарик: мРНК комплексов.
  3. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл промывочного раствора. Передача решения в столбец спин и спина его за 1 мин на 15000 x g. Отказаться от потока через и мыть образца с дополнительных 500 мкл промывочного раствора. Затем спина образца для 2 мин на 15000 x g для удаления любой избыток этанола из спин фильтров.
  4. Передача вращения фильтр дельфин трубка и Ресуспензируйте гранулы в столбце с 80 мкл подогретую Элюирующий раствор (65 ° C). Проинкубируйте образцы для 1,5 мин при температуре 65 ° C и элюировать, крутя его за 1 мин на 15000 x g.
  5. Измерьте концентрацию очищенный РНК с помощью спектрофотометра или аналогичный инструмент, который позволяет для количественного определения концентрации РНК и качества.

5. РНКазы III фрагментации и РНК очистка

Примечание: (Важно) подготовить циркуляр молекулы РНК, подходящие для создания библиотеки C-seq, РНК необходимо фрагментировать примерно 60-80 баз в длину. В то время как предыдущие методы использовали химические фрагментации фрагмент РНК, химические фрагментации с тяжелыми металлами, вводит ущерб образцов РНК, которые могут быть неправильно распознаны как транскрипции ошибки во время заключительного анализа. Чтобы обойти эту проблему, вместо полагаться на фрагментацию, используя РНКазы III для создания небольших фрагментов. Дополнительным преимуществом этого ферментативные подхода является, что она создает совместимый концы, необходимых для перевязки, избавит от необходимости ушивания конец после химического фрагментации.

  1. Настройка реакции фрагментации РНК с 1 мкг очищенный РНК, 10 мкл буфера реакции, 5 мкл РНКазы III и достаточно NF воды довести объем до 100 мкл (см. Таблицу материалы). Последние добавления фермента и Пипетка смеси вверх и вниз по крайней мере 10 раз перемешать. Проинкубируйте образцы при 37 ° C за 25 мин, которая имеет тенденцию производить РНК фрагменты примерно 60-80 баз в длину.
  2. После инкубации 25 мин, очистить реакции сразу с олиго clean-up и концентратор kit (см. Таблицу материалы) для предотвращения любого дальнейшего переваривания. Добавьте 200 мкл буфера oligo привязки к образцу, перемешать, vortexing и 800 мкл, 100% этанола. Mix образца vortexing и передать его на предоставленный спин столбец в коллекции трубку.
  3. Центрифуга для выборки в 10 000 x g 30 s и мыть его с 750 мкл буфера мытья для удаления РНКазы III. Центрифуга для выборки в 10 000 x g за 30 сек, отменить потока через и мыть образца еще раз с 750 мкл буфера мыть, как описано выше. После второго потока через был проигнорирован, центрифуга столбца на 15000 x g за 2 мин удалить любые излишки этанола.
  4. Передать свежие 1,5 мл столбце и элюировать образца в 24 мкл воды NF, крутя его на 10000 x g за 1 мин.
  5. Проверка качества: Возьмите 2 мкл очищенного фрагменты РНК и разбавить вдвое, добавив 2 мкл NF воды к нему. Запустите фрагментированных РНК на экране ленты для обеспечения что фрагментарный РНК находится в диапазоне 50-100 баз в длину (рис. 2 c).

6. РНК рецензий и подвижного круга обратная транскрипция

  1. Циркуляры фрагменты РНК, тепло денатурируют 20 мкл образца при температуре 65 ° C за 1 мин и поместите его на льду сразу на 2 мин. Затем добавьте 4 мкл 10 x буфер лигаза T4 РНК, 4 мкл АТФ 10 мм, 1 мкл АБС битор РНКазы, 1 мкл воды NF и 8 мкл 50% полиэтиленгликоля (PEG).
  2. Тщательно перемешать образца, vortexing, затем добавить 2 мкл 10 U/мкл T4 РНК лигаза I. смеси образца снова, его закупорить и Инкубируйте на 25 ° C в течение 2 ч в Термоциклер с температурой крышку на 30 ° C.
  3. Через 2 ч 10 мкл воды NF образца и очистки образца с олиго clean-up и концентрации комплекта согласно спецификациям производителя. Элюировать образца в 20 мкл воды NF.
  4. Чтобы обратить вспять транскрибировать круговые молекулы РНК, добавить 4 мкл дНТФ 10 мм, 4 мкл 50 случайных hexamers нг/мкл и 9 мкл воды NF 9 мкл РНК. Все тщательно перемешать, дозирование, денатурировать образца при температуре 65 ° C за 1 мин и поместите его на льду на 2 мин Store оставшиеся РНК как резервные.
  5. Добавить 8 мкл 5 x синтез перв стренги буфера, 2 мкл 0,1 мм DTT и 4 мкл 200 U/мкл обратной транскриптазы и перемешать, закупорить. Инкубируйте образца при 25 ° C для 10 мин, затем 20 минут инкубации при 42 ° C с крышкой на 5 ° C выше температуры инкубации.
    Примечание: Обратная транскриптаза с возможностями перемещения нити должен использоваться на данном этапе для подвижного круга обратной транскрипции.
  6. 10 мкл воды NF образца и очистить его вверх с олиго clean-up и концентрации комплекта согласно рекомендациям изготовителя. Элюировать образца в 42 мкл Элюирующий раствор.
  7. Проверка качества: Развести 2 мкл сингл мель cDNA в 2 мкл воды NF и запустить этот образец на инструменте анализа нуклеотидов РНК лентой высокой чувствительности. Если обратной транскрипции работал должным образом, Библиотека cDNA молекул, начиная от примерно 60 – 1500 баз в длину, должны быть видны. В идеале большинство cDNA находится в диапазоне 500-1000 баз (Рисунок 2d).

7. второй синтез cDNA стренги и окончания ремонта

  1. Используйте второй комплект синтеза прядь для создания библиотеки двойной мель cDNA. Поместите образцы на льду и 30 мкл воды NF в 38 мкл пример. Затем добавьте 8 мкл 10 x второй стренги буфера и 4 мкл второй стренги фермента и смешивать образца, нежный дозирование до инкубации на 16 ° C в течение 2,5 ч.
  2. Очистить образцы с олиго clean-up и концентрации комплекта согласно рекомендациям изготовителя для 100 мкл реакций и элюировать примеров в мкл 38 NF воды.
  3. Настройка реакции конце ремонт, добавив 20 мкл воды NF 35.5 мкл двойной мель cDNA, 6,5 мкл конце ремонта реакции буфера и 3 мкл конец Prep фермент смесь. Тщательно проверьте реакцию буфер для белого осадка и растворить их руки потепления, если он присутствует.
  4. Смешать ремонтно конце реакции, закупорить и проинкубируйте его при 20 ° C в течение 30 мин, затем второй инкубации 30 мин при температуре 65 ° C. Установите температуру Термоциклер крышки на 5 ° C выше температуры инкубации.

8. адаптер перевязки и выбор размера подготовленных библиотек

  1. Используйте модуль библиотеки многоступенчатой подготовки для подготовки окончательного библиотеки (см. Таблицу материалы). Во-первых, разбавить адаптеры для следующего поколения секвенирования 10 раз в 10 мм трис-HCl до конечной концентрации 1,5 мкм. Затем добавить 2,5 мкл разбавленного адаптера и 1 мкл лигирование усилитель для каждого образца и смешивать их, vortexing.
  2. 15 мкл Блант/TA лигаза Мастер микс, смешать его, закупорить и проинкубируйте его при 20 ° C на 15 мин. Затем 3 мкл урацил конкретных иссечение реагент фермента и проинкубируйте его при 37 ° C 15 мин. После перевязки, 13,5 мкл воды NF в суммарный объем 100 мкл пример и приступить к выбор размера.
    Примечание: Это лучше Размер выберите для cDNA молекул, которые находятся в диапазоне 600 – 800 баз в длину. Если фрагментирован молекулы РНК примерно 60-80 баз в длину, выбрав для молекул, которые являются 600 – 800 баз в длину обеспечит что большинство отдельных молекул содержат по крайней мере три тандемные повторы, который идеально подходит для глубокой переработкой и анализ.
  3. Чтобы выбрать для молекул, которые являются 600 – 800 bp в длину, добавьте 30 мкл ресуспензированы магнитные бусы (см. Таблицу материалы), приспособиться к RT, каждый образец и смешивать, закупорить. Передать образец 1,5 мл трубки и Инкубируйте на RT на 5 мин.
  4. Поместите образец на магнитные постоять 5 мин для отделения бисера от супернатант. Передача (который содержит требуемый cDNA молекул) супернатант новый 1,5 мл трубки и распоряжаться магнитные бусы (которые связаны с большими cDNA молекул).
  5. Добавить свежие Алиготе 15 мкл магнитных шариков для каждой пробы, тщательно перемешать, дозирование и проинкубируйте 5 мин на месте RT. образцы на магнитные стойки и проинкубируйте 5 мин на RT. Затем тщательно и утилизируют supernatants, убедившись в том, чтобы не мешать шарики.
    Примечание: Не выбрасывайте магнитные бусы, которые теперь содержат желаемому cDNA.
  6. Добавить 200 мкл 80% свежеприготовленные этанола для каждого из образцов не нарушая гранулированных магнитные бусы и Инкубируйте 30 s. отмены этанола и стирать образцы еще раз с 80% этанола. Тогда полностью удаления следов этанола из образцов и просушите бусы на 5 мин, но будьте осторожны, чтобы не слишком сухой бисер. Если шарики являются Пересушенный, трещины появятся в гранулы.
  7. Элюировать образцы из бисера, удалить трубы из магнитного стенд и 19 мкл 10 мм трис-HCl. Накапайте его вверх и вниз несколько раз для высокомобильна бисер и Проинкубируйте образцы для 5 мин на RT. Если бусины были Пересушенный, инкубировать их > 10 мин.
  8. Поместите образцы обратно на магнитного стенд и инкубировать их на 5 минут отделить бисер от супернатант. Тщательно удалить 15 мкл супернатанта, содержащего очищенный, размер выбран cDNA библиотек от трубы и передать его на свежий 1,5 мл.

9. ПЦР-амплификации и последний шарик очистки

  1. Добавить 5 мкл универсальная грунтовка и 5 мкл уникальный индекс грунта (см. таблицу материалы) для каждого очищенного кДНК библиотеки и смешайте их тщательно закупорить. Тщательно проверьте мастер смесь полимеразы кристаллы и другие осадки и теплые мастер смесь вручную до тех пор, пока преципитаты распустить.
    1. Добавьте 25 мкл полимеразы мастер смеси для образца, смешивать их, закупорить и следовать Велоспорт условия ниже для амплификации PCR. Запустить первоначальный Денатурация при 98 ° C за 30 сек и затем выполнить двойной шаг реакции PCR denaturating образцы на 98 ° C 10 s и отжига/расширение продуктов ПЦР на 65 ° C для 75 s (12 x), а затем окончательное расширение при 65 ° C за 5 мин и бессрочное владение при 4 ° C.
  2. Очистить вверх окончательный библиотек, добавив 45 мкл ресуспензированы магнитные бусы непосредственно к реакции PCR, смешать их дозирование и инкубировать их в RT на 5 мин передачи образца до 1,5 мл и поместить его в магнитного стенд. Инкубируйте 5 мин, удалить супернатант и мыть дважды с свежеприготовленные 80% этанола для 30 s.
  3. После второго мыть полностью удалить этанола из образца и воздушно-сухой шарик Пелле за 5 мин и элюировать в 35 мкл 0.1 x TE. Ресуспензируйте бисер, закупорить их и инкубировать их в RT на 5 мин место образца на магнитную подставку и через 5 мин, передать свежие 1,5 мл тюбик 30 мкл супернатант. Хранить библиотек в-80 ° C.
  4. Проверка качества: Разбавьте 1 мкл окончательного библиотеки в 9 мкл воды NF и запуск образца на выделенный инструмент анализа ДНК с высок чувствительности чип; Большинство cDNA должно быть в диапазоне 600 – 800 bp в длину (рис. 2е).
  5. После элюции отправляем образцы для виртуализации на платформе массивно параллельной последовательности, используя 250 bp в паре конец читает, или 300 гласит один конец bp.

10. био информатики анализ круга последовательности данных

Примечание: Анализ и интерпретация необработанные данные из C-seq assay требует выделенный био информатики трубопровода. Схема трубопровода, который был использован для нашего анализа изображена на рисунке 3. Скачайте этот трубопровод на https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Во-первых обрежьте читает удалить адаптер последовательности и низкого качества базы звонков с cutadapt18, используя качество Оценка порога 20.
  2. Затем, определите повторяется, закодированные с помощью соответствующего алгоритма для обнаружения любых повторений с минимальным размером 30 нуклеотидов молекулы РНК concatemerized и максимум 2 несоответствия между повторяет18. Наследовать эти повторы последовательность консенсуса и отслеживать все базы звонков и связанные качества оценки на каждой позиции.
    Примечание: Поскольку обратной транскрипции можно начать в любой позиции на circularized молекулы РНК, начала повторять не обязательно соответствуют 5 ′ конца фрагментированных молекулы РНК (далее именуемые как точек перешнуровка). Соответственно последовательность консенсуса не будет непрерывно Карта против соответствующего транскриптом, которая требует идентификации точек перешнуровка.
  3. Для определения точек перешнуровка, карта concatemer последовательность консенсуса против транскриптом ссылку, с помощью взрыва как выравнивание инструмент (БЛАТ)19.
    1. Сцепляет два экземпляра последовательности консенсуса для обеспечения что сопоставленный последовательность содержит по крайней мере один полный непрерывное появление начальный фрагмент последовательности РНК. Затем поверните последовательность консенсуса для начала в точке предсказал перевязки.
  4. Карта последовательности повернутый консенсус против геноме используя шляпе20 и использовать ряды для обнаружения любых единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP), которые могут быть ошибочно приняты за транскрипции ошибок.
  5. Вызовите транскрипции ошибки из сопоставленных повернутый консенсуса последовательностей и проверить ли ошибки кандидата пройти четыре дополнительные тесты.
    1. Во-первых убедитесь, что ошибка транскрипции не перекрываются с SNP (типичная требование, что по меньшей мере 20 гласит должны охватывать конкретный базовый и не более, чем 5% гласит может поддерживать альтернативные базовый вызов).
    2. Во-вторых убедитесь, что последовательность консенсуса является производным от по крайней мере 3 тандем повторяется, каждая из которых требует той же паре базы; и в-третьих, убедитесь, что сумма показателей качества этой позиции должны быть более 100.
  6. Четвертый и заключительный проверить, вращать последовательность консенсуса во всех возможных комбинациях (имитируя все возможные позиции точек перешнуровка) и карта каждой версии против геном ссылку, с помощью шляпе.
    Примечание: Если один из повернутого последовательностей находит идеальный матч в геноме, соответствующая точка перевязка в настоящее время считается правильным и транскрипции ошибка вызова должны быть отвергнуты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Как все массивно параллельной последовательности подходов каждый эксперимент C-seq производит громоздким, большой набор данных. Для пользователей, впервые он может быть сложным для обработки этих наборов данных; Таким образом рекомендуется, что все пользователи связаться опытных био informatician до экспериментов. В среднем ожидается, что пользователи будут генерировать примерно 55 – 70 гига базы (Gbases) на запуск на большинстве платформ, массивно параллельной последовательности. Для это...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем оптимизированный протокол для подготовки библиотек C-seq для обнаружения ошибок транскрипции в Saccharomyces cerevisiaeи Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans. Этот протокол имеет многочисленные преимущества по сравнению с существующими протоколами, а также альтернативные методы.

За последние 15 лет были разработаны многочисленные репортер систем, которые полагаются на Люцифераза7,8

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это издание стало возможным благодаря финансирование от Грант T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641 и следователь молодой Афар предоставить (M. Вермюльст).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для очистки РНК RiboPureThermoFisherAM1926Полная очистка РНК
Набор для очистки мРНК Genelute Набор для очистки мРНКSigma-AldrichMRN70-1KTОчистка мРНК
без нуклеазы ВодаAmbionAM9937Элюирование и разбавление
Ambion RNase IIIThermoFisherAM2290Фрагментация РНК
T4 РНК Лигаза 1 (ssRNA Лигаза)Новая Англия БиолабсM0204SЦиркуляризация РНК
РиболокThermoFisherEO0381Ингибитор РНКазы
SuperScript III Обратная транскриптазаThermoFisher18080044Роллинг круг обратная транскрипция
10 мМ дНТФ миксThermoFisher18427013Роллинг круг обратная транскрипция
Случайные гексамеры (50 нг/&м; L)ThermoFisherN8080127Катящийся круг обратной транскрипции
NEB Модуль синтеза второй цепи NEBБиолаборатории Новой АнглииE6111SСинтез второй цепи
NEBNext Ultra Набор для подготовки библиотеки ДНК для IlluminaNew England BiolabsE7370SПодготовка библиотеки кДНК
NEB Next индексные праймерыNEBE7335SMultiplex PCR праймеры
Олиго Клин & КонцентраторZymo ResearchD4061Очистка образцов РНК и ДНК
DynaMag-2 МагнитThermoFisher12321DМагнитная очистка
шариков AMPure XPBeckman CoulterA63881Магнитная очистка шариков
Eppendorf 5424 МикроцентрифугаFisherScientific05-403-93центрифуга
INCU-Shaker 10 лBenchmark ScientificH1010Cell Culture
T100 ТермоамплификаторBIO RAD1861096Средне- и высокотемпературные циклические условия
PTC-200 ТермоамплификаторGMI8252-30-0001 Низкотемпературные циклические условия
РНКаза AwayМолекулярные биопродукты700S-11Стерилизация
50 мл Центрифужная пробиркаCorning430290
Центрифужная пробирка безПробирки Corning430052
Пробирки EppendorfСША Scientific1615-5500Безнуклеаза
4200 Tapestation SystemAgilentG2991AAПрибор для анализа нуклеотидов для контроля качества образцов РНК и одноцепочечной ДНК
Высокочувствительная РНК-лентаAgilent5067-5579Контроль качества образцов РНК и одноцепочечной ДНК
Буфер для образцов РНК ScreenTape Agilent5067-5577Контроль качества образцов РНК и одноцепочечной ДНК
Лестница для РНК ScreenTape Agilent5067-5578Контроль качества образцов РНК и одноцепочечной ДНК
2100 Биоанализатор ПриборAgilentG2939BAКонтроль качества двухцепочечной ДНК
Высокочувствительный набор ДНКAgilent5067-4626Контроль качества двухцепочечных образцов кДНК
Водяная баняVWR462-0244Инкубация
NanoDrop 2000/2000C СпектрофотометрThermoFisherND-2000CОпределение концентрации РНК
нуклеазы 15 мл без нуклеазы

Ссылки

  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484(2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065(2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36(2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод кругового секвенированияточность РНК-полимеразыSaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansциркуляризация фрагментов РНКРНК-лигаза T4обратная транскрипциясинтез второй цепилигирование адаптеровселекция по размеру с помощью магнитных частицПЦР-амплификацияочистка библиотеки
Геном широкий наблюдения ошибок транскрипции в эукариотических организмов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.