Методическая статья

Геном широкий наблюдения ошибок транскрипции в эукариотических организмов

DOI:

10.3791/57731

⸱

13 сентября 2018 г.

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает исследователей с новым инструментом для мониторинга верности транскрипции в несколько модельных организмов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для добросовестного выражение генетической информации требуется точная транскрипция. Удивительно, однако, мало что известно о механизмах, которые управляют верности транскрипции. Чтобы заполнить этот пробел в научных знаниях, мы недавно оптимизирован круг последовательности проба для выявления ошибок транскрипции на протяжении транскриптом Saccharomyces cerevisiae, дрозофилыи Caenorhabditis Элеганс. Этот протокол обеспечит исследователей с новый мощный инструмент для сопоставления пейзаж транскрипции ошибки в эукариотических клетках, что механизмы, которые управляют верности транскрипции можно освещены в беспрецедентных деталях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Геном обеспечивает точные биологические план жизни. Чтобы реализовать этот план правильно, это важно для геном транскрибируется с большой точностью. Однако маловероятно быть безошибочной транскрипции. Например РНК-полимеразы уже давно известны к ошибкам в пробирке1,2, и недавно было показано, что они совершают ошибки в естественных условиях также3,5,6, особенно, когда сталкивается с ДНК повреждения7,8,9....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка

  1. Полиадениновый вездесущий; Поэтому, тщательно очистить рабочую область путем распыления его вниз с реактивом обеззараживания (например, РНКазы ПРОЧЬ) и на 70% спирте. Спрей вниз любой пипетки, ручки или трубы стойки для удаления потенциальных источников загрязнения РНКазы.
  2. Для дальнейшего предотвращения полиадениновый от загрязнения образцов, носите пальто лаборатории или джемпер во время экспериментов. Избегайте контакта между Перчатки и внутри трубы, которые будут использоваться, особенно при извлечении их из коробки или сумку.
  3. Перед обратной транскрипции часто менять перчатки.
    Примечание: Для....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как все массивно параллельной последовательности подходов каждый эксперимент C-seq производит громоздким, большой набор данных. Для пользователей, впервые он может быть сложным для обработки этих наборов данных; Таким образом рекомендуется, что все пользователи связаться опытных био informatician до экспериментов. В среднем ожидается, что пользователи будут генерировать примерно 55 – 70 гига базы (Gbases) на запуск на большинстве платформ, массивно параллельной последовательности. Для это.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем оптимизированный протокол для подготовки библиотек C-seq для обнаружения ошибок транскрипции в Saccharomyces cerevisiaeи Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans. Этот протокол имеет многочисленные преимущества по сравнению с существующими протоколами, а также альтернативные методы.

За последние 15 лет были разработаны многочисленные репортер систем, которые полагаются на Люцифераза7,8

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это издание стало возможным благодаря финансирование от Грант T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641 и следователь молодой Афар предоставить (M. Вермюльст).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для очистки РНК RiboPureThermoFisherAM1926Полная очистка РНК
Набор для очистки мРНК Genelute Набор для очистки мРНКSigma-AldrichMRN70-1KTОчистка мРНК
без нуклеазы ВодаAmbionAM9937Элюирование и разбавление
Ambion RNase IIIThermoFisherAM2290Фрагментация РНК
T4 РНК Лигаза 1 (ssRNA Лигаза)Новая Англия БиолабсM0204SЦиркуляризация РНК
РиболокThermoFisherEO0381Ингибитор РНКазы
SuperScript III Обратная транскриптазаThermoFisher18080044Роллинг круг обратная транскрипция
10 мМ дНТФ миксThermoFisher18427013Роллинг круг обратная транскрипция
Случайные гексамеры (50 нг/&м; L)ThermoFisherN8080127Катящийся круг обратной транскрипции
NEB Модуль синтеза второй цепи NEBБиолаборатории Новой АнглииE6111SСинтез второй цепи
NEBNext Ultra Набор для подготовки библиотеки ДНК для IlluminaNew England BiolabsE7370SПодготовка библиотеки кДНК
NEB Next индексные праймерыNEBE7335SMultiplex PCR праймеры
Олиго Клин & КонцентраторZymo ResearchD4061Очистка образцов РНК и ДНК
DynaMag-2 МагнитThermoFisher12321DМагнитная очистка
шариков AMPure XPBeckman CoulterA63881Магнитная очистка шариков
Eppendorf 5424 МикроцентрифугаFisherScientific05-403-93центрифуга
INCU-Shaker 10 лBenchmark ScientificH1010Cell Culture
T100 ТермоамплификаторBIO RAD1861096Средне- и высокотемпературные циклические условия
PTC-200 ТермоамплификаторGMI8252-30-0001 Низкотемпературные циклические условия
РНКаза AwayМолекулярные биопродукты700S-11Стерилизация
50 мл Центрифужная пробиркаCorning430290
Центрифужная пробирка безПробирки Corning430052
Пробирки EppendorfСША Scientific1615-5500Безнуклеаза
4200 Tapestation SystemAgilentG2991AAПрибор для анализа нуклеотидов для контроля качества образцов РНК и одноцепочечной ДНК
Высокочувствительная РНК-лентаAgilent5067-5579Контроль качества образцов РНК и одноцепочечной ДНК
Буфер для образцов РНК ScreenTape Agilent5067-5577Контроль качества образцов РНК и одноцепочечной ДНК
Лестница для РНК ScreenTape Agilent5067-5578Контроль качества образцов РНК и одноцепочечной ДНК
2100 Биоанализатор ПриборAgilentG2939BAКонтроль качества двухцепочечной ДНК
Высокочувствительный набор ДНКAgilent5067-4626Контроль качества двухцепочечных образцов кДНК
Водяная баняVWR462-0244Инкубация
NanoDrop 2000/2000C СпектрофотометрThermoFisherND-2000CОпределение концентрации РНК
нуклеазы 15 мл без нуклеазы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Saccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansT4

Похожие статьи