Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Бронхоальвеолярный лаваж Exosomes в Липополисахарид индуцированной септик легких травм

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57737

⸱

21 мая 2018 г.

 ,  , 
1Department of Veterans Affairs, Atlanta VAMC, 2Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Medicine, Emory University

В этой статье

Краткое содержание

Мышей в внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК выделяют exosomes в жидкости бронхо альвеолярные промывание (БАЖ), которые упакованы с адаптивной. С помощью системы совместного культуры, мы показывают, что exosomes, выпущенный в жидкости бал нарушить экспрессию белков жесткой перехода в бронхиальной эпителиальных клеток и увеличить выражение провоспалительных цитокинов, что подчеркнет повреждения легких.

Аннотация

ОПЛ (Али) и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) представляют собой разнородную группу легочных заболеваний, который продолжает иметь высокие показатели заболеваемости и смертности. Молекулярный патогенез Али в настоящее время лучше определены; Однако ввиду сложного характера заболевания молекулярной терапии еще не разработаны. Здесь мы используем модель индуцированных мыши липополисахарида (LPS) септик ОПЛ разграничить роль exosomes в воспалительной реакции. С помощью этой модели, мы смогли показать, что мышей, которые подвергаются воздействию внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК выделяют exosomes в бронхо альвеолярные промывание (BAL) жидкости из легких, которые упакованы с Мирна и цитокины, которые регулируют воспалительной реакции. Далее с помощью системы модель совместного культуры, мы показываем, что exosomes выпущена с макрофаги нарушить экспрессию белков жесткой перехода в бронхиальной эпителиальных клеток. Эти результаты показывают, что 1) кросс talk между врожденной иммунной и структурных клетки через exosomal челночные способствовать воспалительной реакции и нарушения структурных барьеров и 2) ориентации этих адаптивной может предоставить новые платформы для лечения Али и ОРДС.

Введение

Али и ОРДС являются опасные для жизни формы дыхательной недостаточности с тяжелой гипоксемия, вызванные non кардиогенный отек легких, которая затрагивает около 1 миллиона человек во всем мире ежегодно1. Этиология ОРДС включает прямой травмы легких от инфекции или аспирации и целый ряд косвенных оскорбления. За последнее десятилетие наблюдается рост понимания молекулярный патогенез ОРДС, однако, конкретных целевых лечения ОРДС еще быть разработаны2,3.

Были разработаны несколько животных модели острого повреждения лёгких, которые обеспечивают мост для перевода экспериментальной терапии для человека исследования4,5. Часто используемые модели включают в себя местные установки олеиновой кислоты, бактерий, ПЛАСТИНОК и блеомицин. Другие подходы включают ишемии реперфузии, сенситизации лигирование прокол, механические ИВЛ индуцированное стрейч травмы, гипероксия или системного администрирования бактерий и LPS5. Эти модели обеспечивают полезные биологические системы для тестирования клинических гипотезы и для разработки потенциальных терапий. Чтобы имитировать человека ОРДС, Животные модели следует воспроизвести воспаления и острой травмы эпителиальных и эндотелиальных клеток с дефектами в барьерные функции в легких.

Exosomes мембрана везикулы с 20-200 Нм в диаметре, содержание которых молекулярный содержит белки, ДНК, РНК и липидов, и облегчить между сотовой связи в ткани микроокружения молекулярного состава переводом. Exosomes выделяется несколько типов клеток, таких как эндотелиальные клетки, клетки эпителия, гладкомышечные клетки и клетки тумора и существуют в человеческий организм жидкости. Исследования показывают, что exosomes регулировать перекрестных помех между иммунные клетки и стромальных клеток при инфекционных и стерильные воспалительных заболеваний, и их аномальные релиз, как представляется, регулируются различные природные и экспериментальных стимулы при физиологических и6патологических процессов. Такие сети связи могут играть важную роль в патогенезе легочных заболеваний и может повлиять на патофизиологические прогрессирования7,8. Как 18-22 нуклеотидов некодирующих РНК, адаптивной существуют в ткани и жидкости организма, плазмы, сера и модулировать выражение mRNA в столб-поступательные уровня9,10.

Фасованные интерферирующим в exosomes влияние дифференциации и функции различных типов клеток, и чрезмерные уровни связаны с целым рядом заболеваний, включая рак, легочных заболеваний, ожирения, диабета и сердечно-сосудистых заболеваний11, 12,13,14,,1516. Вступление в получателя клетки и челночные exosomal интерферирующим облегчить межклеточные связи, изменения гемостаза микроокружения17,18. Острого повреждения лёгких-это сложные процессы, с участием нескольких типов клеток с обширной межклеточных коммуникаций через exosomes8. Мир-155 и мир 146А общий механизм transcriptional регулирования и способствовать воспалительной реакции и Иммунологическая толерантность19,20. Недавние исследования показывают, что оба модуляции воспалительной реакции через exosomal интерферирующим челночные иммунные клетки21. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе модулирующее влияние exosomal интерферирующим на альвеолярной ответ эндотоксина остаются неясными, несомненно потенциальных клинической значимости и заслуг трансляционная последствия дальнейшего расследования.

Совместное культуры модели используются для определения взаимодействия типов конкретных клеток в сложных условиях, таких как воспаление и рак22,23. Эти платформы предоставляют альтернативную стратегию допросить кросс talk между типами клеток, особенно для иммунной и структурных клеток.

Внутри трахеи, аэрозольных, внутрибрюшинного или системного администрирования LPS широко используются для стимулирования экспериментальной легких повреждений24,25,26и показали, чтобы побудить проницаемость эпителия и эндотелиальных дефекты. Здесь мы используем внутрибрюшинного LPS побудить децентрализованная модель острого повреждения легких у мышей. В течение 24 h внутрибрюшинного администрации LPS проницаемость дефектов наведенные в легких с набора воспалительных клеток. Кроме того мы показывают, что exosomes от бал содержат Мирна-155 и мир 146А, и exosomes от жидкости бал побудить выражение провоспалительных цитокинов в получателей эпителиальных клеток, включая ИЛ-6 и ФНО α. Эти данные являются первым, чтобы показать, что exosomal интерферирующим выделяется в бал в этой модели септик ОПЛ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Общий протокол требует 2 дней, включая первый день индукции сепсиса и изоляции бал жидкости из животного и на второй день для exosomes изоляции от мыши BALF. Все процедуры, рассмотрели и утвердили институциональный уход животных и использования Комитетом в медицинском центре Атланты ва.

1. мышь септик ОПЛ травмы модель

  1. Использовать 6-8 недель - старый одичал тип C57BL/6J мышей-самцов (вес 20-22 g) для животных модель и выполнять все процедуры с использованием асептических методов и инструментов. Автоклав всех хирургических инструментов, в том числе щипцы и ножницы для 20 мин при 121 ° C.
  2. Случайным образом распределите мышей в экспериментальной и контрольной группы. Останови мышей на доске хирургического. Лечат мышей с кишечной палочкой липополисахарида (LPS, 15 мг/кг), внутрибрюшинного маршрут. Согласно индивидуального тела вес разбавить соответствующие LPS дозировки до 0,1 мл PBS на мыши, а затем LPS раствор с помощью 1 мл шприц с иглой 27 G и вставляют эквивалентный объем PBS для контроля животных.
  3. Держите мышей в объекте животных BSL2, который состоит из чистой клетки при соответствующей температуре.
  4. 24 часа спустя, усыпить мышей с CO2 ингаляции.
  5. Выберите область, хирургические в центре мыши шеи. Сделать небольшой надрез (около 5 мм) и осторожно отделить мышцы для доступа к трахеи, используя тупой щипцы до тех пор, пока подвергается трахеи.
  6. Снимать мыши бал жидкости с 10 мл стерильного шприца с иглой 27 G. Во-первых осторожно, вставить иглу в трахею и медленно вводить 1 мл стерильного PBS в трахею, а затем нарисуйте BALF в одноразовые шприц 3 мл с иглой 27 G. По завершении процедуры распоряжаться шприцев и игл в биологически опасных Шарпс контейнер.
  7. Лечения хирургических инструментов с диоксидом хлора, как описано ранее, Chauret и др. 27и затем стерилизовать всех хирургических инструментов путем автоклавирования 20 мин при 121 ° C.

2. Exosomes изоляции серийный ультра центрифугирования и характеристика

  1. Собирайте мыши бал жидкости в 15 мл конические трубы. Урожая альвеолярных клеток, Центрифугуйте образцы на 10 мин на 1000 g, при 4 ° C.
  2. Перенесите супернатант новые 15 мл конические трубы, затем Центрифугуйте образцы на 30 мин в 4000 x g при 4 ° C для удаления мусора ячейки.
  3. Соберите супернатант в образцах центрифуги 60 мин в 10 000 x g при 4 ° C для удаления сотовой частицами и ультрацентрифугирования трубы.
  4. Передать новые конические трубы супернатанта, а затем фильтр образцы через 0,2 мкм шприц фильтр для удаления оставшихся крупных частиц.
  5. Сбор образцов в ультрацентрифуга трубы и баланс трубы. Центрифугуйте образцы на 2 ч в 140 000 x g при 4° C до Пелле exosomes.
    Примечание: Размер exosomes изменяется 20-200 Нм. 0.2 мкм фильтр используется для удаления крупных частиц, которые являются более чем 200 Нм в размер.
  6. Выбросите supernatants осторожно. Растворяют гранулы с 100 мкл PBS или лизис решение и передача exosomes образцы для 1.5 мл пробирок и хранить при температуре-80 ° C до использования.
    Примечание: Просвечивающий электронный микроскоп рекомендуется проверить изолированных exosomes.
  7. Следуйте стандартного образца ТЕА, обработки протокол28. Анализировать образцы exosomes с помощью просвечивающей электронной микроскопии и принимать образы, шкала бар 200 Нм.

3. Подготовка Мирна и исполнительских Мирна q-RT-PCR

Примечание: Мирна q-RT-PCR рекомендуется проанализировать уровень экспрессии адаптивной.

  1. Следуйте стандартным интерферирующим Протокол изоляции и убедитесь в том использовать одинаковое количество очищенной РНК в сингл стренги обратной транскрипции24.
  2. Следуйте стандартным реального времени протокол постановки ПЦР для выявления уровня exosomal микроРНК в BAL жидкости. Использование конкретных праймеры PCR реального времени против мир-155, мир 146А и U6 мяРНК. Запуск реакции PCR с аппаратом количественного PCR и нормализовать значения выражений для внутреннего контроля U6 мяРНК.
    Примечание: Каждая группа состоит из трех экземплярах образцы24.

4. Exosomes маркировки и очистки

  1. Приостановить Пелле exosomes раствором 100 мкл подвеска в 1,5 мл полипропиленовые трубы, а затем 0.4 мкл exosomes красителя в другую трубу с 100 мкл раствора подвеска.
  2. Быстро добавить exosomes в растворе в раствор красителя и перемешать, закупорить. Храните образцы для 5 мин при комнатной температуре, защищать от света.
  3. Положите один спин столбец exosome в трубку элюции 1,5 мл. Передача смеси решение центр столбце спина exosome.
  4. Спина в столбце 2 мин на 800 x g при комнатной температуре.
  5. Удалить столбец и хранить eluted образца при-20 ° C до использования.

5. Проверка Exosomes вверх, принимаемые получателями клетки

  1. Семена, 1 x 104 /cell MLE 12 в слайд 8-Ну камеры и культуры клеток при 37 ° C, 5% CO2.
  2. Добавьте 10 мкл люминесцентные меченых exosomes клетки. Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
  3. Удалите медиа культуры и вымыть клетки с PBS, а затем исправить клетки с 1% параформальдегида 10 минут при комнатной температуре.
  4. Смонтируйте слайд в горе среде с DAPI.
  5. Анализировать образцы через микроскоп флуоресценции и принимать изображения, 40 кратном.

6. Проверка взаимодействия между Exosomes и получателей клетки

  1. Семенной 2 x 105 MLE12/колодец в 12-ну культуры пластины, содержащие соответствующие питательной среды и культуры клеток при 37 ° C, 5% CO2.
  2. Добавить 20 мкг exosomes от мыши бал жидкости MLE12 клеток и настройка повторных измерений на экспериментальной группы.
  3. 24 часа позже, вымыть клетки с PBS и добавить 600 мкл буфера lysis в колодец. Осторожно встряхнуть пластину и собирать образцы лизиса в 1,5 мл с пипеткой.
  4. Следуйте стандартным всего РНК изоляции и протокола cDNA обратной транскрипции, завершить cDNA стренги одной обратной транскрипции29.
  5. Следуйте стандартным реального времени протокол постановки ПЦР для выявления уровня выражение mRNA в получателей клетки29. Использование конкретных праймеры PCR реального времени против ФНО α, Ил-6 и ZO-1. Запустите реакций PCR с аппаратом количественного PCR и нормализовать значения выражений для внутреннего контроля GAPDH.
    Примечание: Каждая группа состоит из трех экземплярах образцов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы побудить септик легких травм, мышей лечили внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК (15 мг/кг). В течение 24 ч LPS администрации нейтрофильные приток был замечен в легких, как показано на рисунке 1A. Было обращено мыши бал жидкости, следуют изоляция и очищение exosomes. Морфология BALF exosomes было подтверждено Микроскопия электрона передачи (рис. 1B).

Q-RT-PCR от очищенной ex...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модели мыши заболеваний широко используются для оценки физиологические функции конкретных генов и уменьшить стоимость экспериментов2. Септик ОПЛ описанных здесь имитирует воспалительной реакции, видел в людях с ОРДС. Эта модель имеет отношение к расследованию молекулярный патогенез, разработка биомаркеров и для проверки потенциальных новых терапии5.

Совместное культуры системы актуальны в vivo исследований в контексте расследования потен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Эта работа была поддержана обзор заслуги ва 2I01BX001786-06A1 финансирование RS.

Благодарности

Авторы заявили никакого конфликта интересов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
липополисахаридSigma-AldrichEscherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X)Life technologies20012-027
mirVana набор для выделения микроРНКThermo Fisher449774
TaqMan Gene Expression Master MixThermo Fisher4369016
mmu-miR-155 (002571) праймерThermo Fisher4427975
has-miR-146a (000468) праймерThermo Fisher4427975
U6snRNA праймерThermo Fisher4427975
TNF-α( Mm00443258_m1 ) грунтовкаThermo Fisher4331182
ИЛ-6 (Mm00446190_m1    )грунтовкаThermo Fisher4331182
ZO-1 (Mm00493699_m1  )праймерThermo Fisher4331182
минимальной эфирной среде (MEM)Thermo Fisher11095-072
Trysin-EDTA раствор (0,05%)Экзосомы Thermo Fisher25300054
были помечены PKH67 через PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit Центрифуга Sigma-AldrichMINI67-1KT
Exosome Spin Columns (MW3000)Thermo Fisher4484449
Beckman Coulter Optima L-100XP Beckman CoulterL-100XP
Ультрапрозрачные центрифужные пробиркиBeckman Coulter344058
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher
просвечивающие электронные микроскопы (TEM)JEOL Ltd120 кВ TEM
Olympus BX41 микроскоп Olympus BX41
Ультрацентрифуга

Ссылки

  1. Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. Epidemiology and outcomes of acute lung injury. Chest. 131, 554-562 (2007).
  2. Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).
  3. Han, S., Mallampalli, R. K. The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 855-860 (1950).
  4. Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements. Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).
  5. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).
  6. Terrasini, N., Lionetti, V. Exosomes in Critical Illness. Critical care medicine. , (2017).
  7. Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity. American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).
  8. Kubo, H. Extracellular Vesicles in Lung Disease. Chest. 153, 210-216 (2018).
  9. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).
  10. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  11. Fanini, F., Fabbri, M. CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART. Seminars in cell & developmental biology. , (2016).
  12. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation research. 120, 701-712 (2017).
  13. Prattichizzo, F., et al. Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity? Diabetes, obesity & metabolism. 18, 855-867 (2016).
  14. Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).
  15. Khalyfa, A., et al. Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea. American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).
  16. Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
  17. Gregson, A. L., et al. Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection. American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).
  18. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).
  19. Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5750-5761 (2015).
  20. Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing. Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).
  21. Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nature communications. 6, 7321(2015).
  22. Yuan, Z., et al. TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer. PloS one. 9, e94241(2014).
  23. Xu, R., Richards, F. M. Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade. Combinatorial chemistry & high throughput screening. 20, 451-457 (2017).
  24. Yuan, Z., et al. TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).
  25. Sadikot, R. T., et al. High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice. American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).
  26. Yuan, Z., et al. Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 2032-2043 (2012).
  27. Chauret, C. P., et al. Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators. Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).
  28. Cizmar, P., Yuana, Y. Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy. Methods in molecular biology. , Clifton, N.J. 221-232 (2017).
  29. Yuan, Z., et al. HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Scientific reports. 7, 42028(2017).
  30. Jackson, M. V., et al. Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC). Bio-protocol. 7, (2017).
  31. Fujita, Y., et al. Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity. American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).
  32. Gunasekaran, M., et al. Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).
  33. Kalra, H., et al. Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma. Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).
  34. Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PloS one. 10, e0145686(2015).
  35. Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Септическое повреждение легкихиндуцированное ЛПСизоляция экзосомочистка экзосомзахват экзосомфлуоресцентная микроскопияпросвечивающая электронная микроскопияПЦР в реальном временимодель совместного культивированиявоспалительный ответ
Бронхоальвеолярный лаваж Exosomes в Липополисахарид индуцированной септик легких травм
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.