Здесь мы представляем протокол для подтверждения наличия Точечная мутация для диагностики наследственных Транстиретин амилоидоза, используя Ala97Ser, наиболее распространенных эндемических мутации в Тайване, в качестве примера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генетический анализ наследственных Транстиретин Ala97Ser связанных амилоидоза
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Генетическое тестирование является наиболее надежный тест для наследственных Транстиретин связанных амилоидоза и должна быть выполнена в большинстве случаев Транстиретин амилоидоз (ATTR). ATTR является редким, но роковой болезни с гетерогенными фенотипов; Следовательно диагноз иногда задерживается. С увеличением внимания и более широкого признания на ранних проявлений ATTR, а также новые процедуры, соответствующие диагностические исследования, включая Транстиретин (TTR) генетический тест, чтобы подтвердить типы и варианты ATTR поэтому фундаментальное значение для улучшения прогноза. Генетический анализ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) методов подтвердить наличие TTR точечные мутации гораздо быстрее и безопаснее, чем традиционные методы, такие как Южная помарка. Здесь мы демонстрируем Генетическое подтверждение ATTR Ala97Ser мутации, наиболее распространенных эндемических мутации в Тайване. Протокол включает четыре основных этапа: сбор образцов цельной крови, экстракции ДНК, генетический анализ всех четырех TTR экзонов с PCR и секвенирования ДНК.
Введение
Амилоидоз Транстиретин (TTR) (ATTR) является наиболее распространенной формой наследственной амилоидоз системный1и может быть вызвана аутосомно-преимущественно унаследованные мутации в ген Транстиретин (TTR)2. TTR мутации дестабилизировать структуры tetrameric белков и привести к ее диссоциации в мономеров, которые собирает в амилоидных фибрилл2. Более чем 100 amyloidogenic TTR мутации были сообщалось во всем мире1. Генетический анализ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) методов подтвердить наличие TTR Точечная мутация и имеют преимущества, включая избежать обработк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Испытаний, проведенных в лаборатории была проведена в соответствии с требованиями из клинических лабораторных улучшение поправки (CLIA) 1988 года, положения, утвержденного институционального обзора Совет из Чанг Gung Мемориальный госпиталь и Университет (лицензия № 100 - 4470A3 и 104-2462A3). Информированное согласие было получено от всех пациентов.
1. кровь образец коллекции
- Сбор цельной крови в коммерчески доступных лечение ЭДТА трубы. Осторожно перемешать и хранить пробы крови при температуре 4 ° C до обработки.
2. ДНК извлечение из периферической крови
Используйте ком....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Электрофорез геля агарозы двух пациентов и один здоровый отдельных выявленных полос ожидаемых размеров, в том числе 454 продукт PCR bp для экзона 4 TTR гена (рис. 1).
Рисунок 1 . Электрофорез геля, изображающие ПЦР усиленный TTR ген. Нормальное: здоровый человек. Лейн M:.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существует два важных шага в рамках протокола. Во-первых для того чтобы иметь достаточное количество белых кровяных клеток, hemodiluted образец следует избегать11. Во-вторых использование соответствующих праймеры PCR имеет основополагающее значение для получения надежных результатов12. Мы использовали грунт-ДОМЕННАЯ веб-инструмент для разработки грунты4,13; минимум 40 пар на каждой стороне четыре экзонов TTR должны .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы хотим поблагодарить Мисс Ву Син-удовольствие за ее помощь в экспериментах. Это исследование было поддержано грант от Чанг Gung программа медицинских исследований (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) и IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Тайвань.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пробирки с обработкой ЭДТА | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 спектрофотометр | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Салфетки для деликатных задач | Kimberly-Clark Kimtech | Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 Прикладные | биосистемы | 4398823 | |
| геном TTR intronic праймеры | Экзон1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' | |
| Экзон1 | R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' | ||
| Экзон2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' | ||
| Экзон2 | R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' | ||
| Экзон3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGGGT-3' | ||
| Экзон3 | R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' | ||
| Экзон4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' | ||
| Экзон4 | R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' | ||
| термоамплификатор | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| электрофорез клетка | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| краситель | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| автоматический секвенатор | анализатор ДНК Biosystems | 3730xl |
Ссылки
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
