Этот протокол сочетает в себе характеристики образец протеина Капиллярный электрофорез и быстро привязки скрининга для заряженных лигандов, близость капиллярного электрофореза. Рекомендуется для белков с гибкой структурой, например неразрывно неупорядоченных белки, чтобы определить какие-либо различия в привязке для различных конформеров.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Растения сильно зависят от окружающей их среды. Для того, чтобы приспособиться к стрессовым изменениям (например, засухи и высокой солености), высших растений развиваться классы неразрывно неупорядоченных белков (ВПЛ) для уменьшения окислительного и осмотического стресса. Эта статья использует комбинацию Капиллярный электрофорез (КГЭ) и мобильность сдвиг сродство электрофореза (ACE), чтобы описать поведение привязки различных конформеров AtHIRD11 ВПЛ из Arabidopsis thaliana. КГЭ используется для подтверждения чистоты AtHIRD11 и исключить фрагменты, Посттрансляционная изменений и других примесей, как причин для сложных пик шаблонов. В этой части эксперимента различные примеры компонентов разделенных их различных масс вязкой гелем внутри капилляра и обнаружены с детектором массив диода. Потом ACE исследуется поведение привязки образца к различных ионов металлов. В этом случае лигандом добавляется буферного раствора и сдвиг в миграции время измеряется для того, чтобы определить, произошло ли событие привязки или нет. Одним из преимуществ использования комбинации КГЭ и ACE определить поведение привязки МВУ является возможность автоматизировать электрофорез геля и пробирного привязки. Кроме того КГЭ показывает нижний предел обнаружения, чем классические гель-электрофорез и туз может определить порядок привязки лиганд в быстром образе. Кроме того ACE также может применяться для других заряженных видов чем ионы металла. Однако использование этого метода для привязки эксперименты ограничен в его способность определить количество сайтов связывания. Тем не менее сочетание КГЭ и туз может быть адаптирована для характеризующие поведение привязки любой образец протеина к многочисленные заряженных лигандами.
Введение
Растения являются более зависимыми от их окружающей среды, чем многие другие формы жизни. Поскольку растения не может переехать в другие места, они должны адаптироваться к изменениям в их окружении (например, засухи, холодной и высокая концентрация соли). Следовательно высших растений разработана специализированная стресс белки как дегидринов, которые выполняют многообразные задачи, чтобы уменьшить стресс ячейки, относящиеся к высокой солености. Эти белки связывают воды и ионов внутри клеток, уменьшить окислительный стресс путем привязки Cu2 +-ионов и взаимодействовать с фосфолипидами, а также cytoskeletons. Кроме того, привязка Zn2 +-ио....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка документов капиллярного электрофореза
-
Подготовить капилляры
- Используйте стеклорез для нарезать голые кварцевое кремнезема капилляра с внешнее покрытие полиимида и внутренний диаметр 50 мкм 33 см (для КГЭ эксперимента) и длиной 30 см (для эксперимента, ACE) капилляров. Выполните резки на стеклянной пластины.
Примечание: 2 различных экспериментальных установок были разработаны для 2 различных инструментов. Для того, чтобы использовать их на других инструментах, надлежащего метода передачи должна быть выполнена и длина капилляра должен корректироваться на допустимую длину документа. - Используйте перо для об....
- Используйте стеклорез для нарезать голые кварцевое кремнезема капилляра с внешнее покрытие полиимида и внутренний диаметр 50 мкм 33 см (для КГЭ эксперимента) и длиной 30 см (для эксперимента, ACE) капилляров. Выполните резки на стеклянной пластины.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 показывает electropherogram для AtHIRD11 образца, полученные в ходе экспериментов КГЭ. Пептид размер увеличивается слева направо. Максимальное число 4 имеет большой массы и указывает интактных белков. Меньшие вершины 2 и 3 представляют собой меньше примесей (например, продуктов разложения). Первый пик и непоследовательность базовой линии до также могут быть воспроизведены без образец протеина. Таким образом, это связано с ПБ гель себе и не .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для всех CE экспериментов подготовка капилляра является важным шагом. Поскольку это стеклянную трубку с малого диаметра, он может легко сломать в местах, где покрытие удаляется, когда он обрабатывается. Установка капилляра, в инструмент следует делать очень осторожно.
Важнейшие шаги, связанные в основном с помощью метода ACE относятся к экспериментальной установки. Другим важным шагом является нахождение правый образец параметров впрыска. Вводится количество образца должно быть достаточно для .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы признательны поблагодарить Masakuza Хара (исследовательский институт зеленый науки и технологий, Университет Шизуока, Япония) для предоставления образцов белка AtHIRD11.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| AtHIRD11 образец | Университета Сидзуока (группа проф. М. Хара) | - | дегидриновый белок из Arabidopsis thaliana экспрессируется в Escherichia coli |
| Barefused silica capillarary | Polymicro Technologies (Phoenix, США) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μ внутренний диаметр м, 363 мкм; m наружный диаметр, полиимидное покрытие |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Вальдбронн, Германия) | в связи с чем уже не доступен | инструмент для капиллярного электрофореза; Agilent 7100 CE может быть использован вместо |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Вальдбронн, Германия) | G7100A | Инструмент для капиллярного электрофореза |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Мельзунген, Германия) | 4606051V | Шприц для фильтрации |
| Ротилабо-шприцевые фильтры | Carl Roth GmbH + Co. KG (Карлсруэ, Германия) | KY62.1 | Мембранный фильтр PVDF для фильтрации раствора |
| Eppendorf Research plus 10 μ L | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Германия) | 3121 000.023 | Микродозатор для работы с пробами |
| Eppendorf Research plus 10 μ L | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Германия) | 3121 000.120 | Микропипетка для работы с лигандными растворами |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Майнц, Германия) | 24 338 08 | Приготовление раствора NaOH |
| Bulb pipette 25 мл | Duran Group GmbH(Майнц, Германия) | 24 338 14 | Приготовление раствора лиганда |
| Duran glas объемная колба 25 мл | Duran Group GmbH (Майнц, Германия) | 24 671 1457 | Приготовление стокового раствора лиганда |
| Duran glas объемная колба 10 мл | Duran Group GmbH (Майнц, Германия) | 24 671 1054 | Приготовление стокового раствора лиганда |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, США) | комерциально больше не доступно | Разделение во время электрофореза капиллярного геля / Альтернативный буфер SDS: прогонный буфер CE-SDS от Bio-Rad Laboratories (Mü nchen, Германия) Каталожный номер: 1485032 |
| Ацетанилид | Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия) | 397229-5G | Электроосмотический маркер потока |
| Марганец(II) хлорид | Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия) | 13217 | Лиганд |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия) | 431788-100G | Промывочный ингредиент |
| Барийхлорид | Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия) | 202738-5G | Лиганд |
| Додецилсульфат натрия | Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия) | 71729-100G | Растворяющий белок для электрофореза капиллярного геля |
| Гексагидрат хлорида никеля(II) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия) | 654507-5G | Лиганд |
| Селена(IV) хлорид | Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия) | 323527-10G | Лиганд |
| 2- амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол (Трис) | Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия) | 252859-100G | Буферный ингредиент |
| Хлорид цинка(II) | Merck Millipore (Дармштадт, Германия) | 1088160250 | Лиганд |
| Стронция Нитрат | Merck Millipore (Дармштадт, Германия) | 1078720250 | Лиганд |
| Кальция хлорид дигидрат Merck | Millipore (Дармштадт, Германия) | 1371015000 | Лиганд |
| 37% соляной кислоты | Merck Millipore (Дармштадт, Германия) | 1003171000 | Регулятор pH |
| Дигидрат хлорида меди(II) | Riedel-de Haë n (Seelze, Германия) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Папенбург, Германия) | 10000084; 0 | Ультразвуковая ванна |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Вальдбронн, Германия) | G2070-91126 | Программные пакеты для работы с приборами CE, получения данных и их оценки |
Ссылки
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
