Методическая статья

Измерение уровня осуществления в Drosophila melanogaster , с использованием системы количественной оценки вращающихся упражнения (REQS)

DOI:

10.3791/57751

⸱

27 мая 2018 г.

 , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вращающиеся осуществлять количественную оценку системы (REQS) может вызвать упражнения в Drosophila melanogaster путем вращения при одновременно измерять количество деятельности животных. Здесь мы представляем протокол точка за точкой, детализируя как измерить уровни активности животных испытывают вращательные упражнения процедуры с использованием REQS.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дрозофилы является новой модели организма для исследований в области биологии упражнения. На сегодняшний день, две основные упражнения системы, мощность башни и Treadwheel были описаны. Однако отсутствует способ измерить количество дополнительных животных активности, индуцированной через упражнения лечение. Вращающиеся осуществлять количественную оценку системы (REQS) заполняет эту потребность, обеспечивая мера деятельности животных для животных, которые испытывают вращательные упражнения. Этот протокол подробно описано, как использовать REQS для оценки активности животных во время вращения упражнения и показывает тип данных, которые могут быть сгенерированы. Здесь мы демонстрируем, как REQS используется для определения конкретного пола и штамм различия в упражнения индуцированной активности. REQS может также использоваться для оценки влияния различных других экспериментальных параметров, таких как возраст, диета или населения размер на упражнения индуцированной деятельности. Кроме того она может использоваться для сравнения эффективности различных осуществлять подготовку протоколов. Важно то, что он предоставляет возможность стандартизировать процедуры осуществления между штаммами, позволяя исследователя для достижения равных количествах деятельности между группами при необходимости. Таким образом REQS заметный новый ресурс для биологов упражнения, работающих с системой модель дрозофилы и дополняет существующие системы упражнений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно исследователи начали использовать плодовой мушки Drosophila melanogaster для изучения биологии упражнения. D. melanogaster был генетической модели системы для более чем 100 лет1,2. Однако исследования дрозофилы внесла вклад не только генетике, но и целый ряд других дисциплин, включая нейробиологии, поведенческой биологии и физиологии3. В 2009 году, власти башня, первый тренажер для дрозофилы было описано4. Башня власти использует ответ отрицательный geotaxis животных. Когда нарушается, дрозофилы, как правило, перейти к верхней части их корпуса. Этот ответ хорошо отлажена и является основой assay популярные «кольцо» (5быстрого итеративного негативные Geotaxis), который используется для оценки восхождение способности и/или физической у дрозофилы. Башня власти использует механическая рука, подключенными к блоку электродвигателя неоднократно поднять набор животных в пределах их корпуса на несколько дюймов и снижается их обратно на землю в ответ отрицательный geotaxis (Tinkerhess et al. 20126 предоставить видео, иллюстрирующие использование Power Tower). Длительное лечение на башне власти таким образом увеличивает объем физической активности (бег или полет) животные выполняют по сравнению необработанных контроля животных и течение времени приводит к улучшению производительности в assay кольцо для физической4. Таким образом эта работа продемонстрировала целесообразность использования дрозофилы как модель для осуществления биологии.

Чтобы расширить репертуар инструменты для исследований упражнения дрозофилы, в 2016 году, Мендес и коллеги описал второй дрозофилы тренажер, Treadwheel7. Подобно к башне власти, Treadwheel эксплуатирует ответ отрицательный geotaxis дрозофила. Однако этот ответ индуцируется продолжение вращения вольеры для животных, а не путем отмены и снижается их как Power Tower. Этот метод индукции мягче и позволяет более выносливость ориентированных на осуществление режима, который избегает любой физической травмы, которые могут возникнуть во время учений в башне власти (см. Katzenberger, R. J. et al. 20138 для воздействия повторяются физической травмы на дрозофилы здоровья). Подобно Power Tower4, упражнения лечение животных на Treadwheel приводит к различных физиологических реакций, включая изменения в физической пригодности, триглицеридов и тела вес7. Таким образом два взаимодополняющих методы доступны для биологов дрозофилы, изучая упражнения.

Одно ограничение мощности башня и Treadwheel является невозможность измерить объем деятельности, вызванных лечения упражнения. Анализ видео записей взяты из Treadwheel продемонстрировал, что имеются существенные различия среди различных штаммов дрозофилы в как они реагируют на лечение упражнение7. В частности штаммы изучал отличается в сколько дополнительной деятельности животных когда стимулировали7. Это наблюдение побудило нас, чтобы разработать систему третьей упражнения, вращающихся осуществлять количественную оценку системы (REQS), что позволяет нам оценить уровни активности животных во время вращения индуцированной упражнение9. REQS использует коммерчески доступных деятельности, мониторинга, установленный на вращающейся рукоятки для стимулирования осуществления путем вращения как Treadwheel. Первоначальная работа с REQS подтверждает, что генетически различных штаммов дрозофилы — и полов - могут иметь существенно различные ответы на вращения стимуляции и таким образом количество упражнений, индуцированной не идентичен среди различных генотипов9 . Таким образом REQS теперь позволяет дрозофилы биологи измерить количество упражнений, вызванных лечения, открыв целый ряд новых направлений исследований в области осуществления.

Здесь мы подробно описать как пользоваться REQS для количественного определения вращательные упражнения. REQS индуцирует вращательные упражнения и одновременно измеряет уровни активности животных лечат. REQS возможность размещения различных программ упражнений, начиная от простого 2 h непрерывного осуществления режима продемонстрировали здесь для более сложных методов обучения интервал как описано Мендес и коллеги7и стимуляции может быть скорректирована посредством скорость вращения (между приблизительно 1-13 оборотов в минуту). В зависимости от активности монитор используется для производства REQS этот метод адаптируется для анализа одного мух или больших популяций животных. Благодаря этой гибкости REQS обеспечивает дрозофилы исследователей с массивом возможностей для изучения, например, различные упражнения режимы, диетические вмешательства или влияния плотности населения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REQS состоит из блока монитора активности дрозофилы (источник информации, см. Таблицу материалы) монтируется на вращающейся руки, которая контролируется электродвигателя (рис. 1). Монитор активности определяет, как часто в течение заданного времени которые массив лазерных лучей, пройдя в середине трубы пробирного нарушается. Подробные чертежи и углубленная характеристика смотрите наши предыдущие публикации9. В то время как наша система использует блок LAM25H, REQS могут быть изменены для размещения другие Drosophila монитор активности единиц, а также.

1. Тестирование настройки REQS

  1. Нагрузочный тест влетает в стеклянных трубок образца, обезболивающим животных с CO2 или другой выбранный метод для обработки, перемещая их в пустой трубы и укупорки трубы.
  2. Вставьте ограничен стекла образец трубки разъемы блока монитора активности. Безопасный трубы, используя резиновые уплотнительные кольца (17-18 калибр) и/или резиновых полос на обе стороны подразделения для обеспечения трубы не двигаться во время вращения:
    1. Скольжения одно кольцо над образец трубки и Установите уплотнительное кольцо рядом середину трубки. Вставьте образец трубки в гнездо монитора активности от фронта и его центр.
    2. Переместите кольцо при необходимости и убедитесь, что после того, как образец трубки центрируется, уплотнительное кольцо заводят как можно ближе к монитор активности как можно скорее. Исправьте образца трубки в месте путем скольжения второе кольцо через стеклянную трубку от спины, снова перемещая кольцо как можно ближе к монитор активности как можно.
  3. Инициировать ротацию REQS, листать выключатель питания на передней панели устройства. Регулировать скорость его вращения с ручку на передней панели устройства для требуемой скорости (4/мин (оборотов в минуту) в этом примере).
    Примечание: Скорость вращения в этом примере был выбран, чтобы соответствовать ранее опубликованные исследования7. Как различные вращательной скорости приведет к различных животных активность, при инициировании нового исследования, оптимизация скорости вращения для конкретных экспериментальных set-up (генотип, продолжительность схватки упражнения и т.д.) может быть необходимо.
    Примечание: Важно обеспечить, что трубы правильно расположены так, что они не тащить вдоль нижней части блока REQS во время вращения.
  4. Проверьте подключение к системе сбора данных, предоставляемых с блоком монитор активности дрозофилы, открыв DAMSystem308 программного обеспечения и обеспечения того, что подключение свет горит зеленым для нескольких ротаций. Программное обеспечение начнет запись данных в текстовый файл «monitorX» (X в номер устройства, если используются несколько мониторов) сразу же после начала. Запись частоты может корректироваться в закладке «Настройки»; Мы обычно записывать с интервалом 5 минут.
  5. Расследования в текстовый файл, созданный DAMSystem308 программного обеспечения, что подключение данных функционирует нормально. Проблемы с подключением к привести к вырезами, время точек, где 0 активность регистрируется для всех позиций в REQS (см. Представитель результаты и Таблица 2). Если вырезами, настройки подключения данных, ведущих к вращающейся телефонной линии, как во время вращения, эта связь может стать сыпучих или витой. Мы находим, что стабилизации связи с лентой помогает предотвратить эту проблему.

2. Подготовка животных

Примечание: Все животные были подняты и испытаны в стандартных условиях в инкубаторе (25 ° C, влажность 60-70%, 12 h свет/темно цикла) на мелассы/кукурузной муки СМИ10.

  1. За две недели до запланированного эксперимента, настроить флаконов с контролируемой плотностью животных для сбора экспериментальных мух от; Обычно мы создали флаконов с 7 мужчин и 10 женщин. С здорового материала, от одного флакона примерно 15 девственной мужчин и 15 женщин могут быть собраны за 4 дня периода времени. Отрегулировать количество флаконов, созданы на основе числа животных, необходимых для анализа; Типичная пробирного в нашей лаборатории включает в себя 10 наборов 10 Девы мужчин и женщин за генотипа (100 мужчин и 100 женщин).
    Примечание: Non Девы мух могут использоваться в зависимости от конкретных экспериментальных вопрос. Если проведение долгосрочных экспериментов с животными не девственница, ползающих личинки могут мешать точного мониторинга.
  2. Удаление родительского мух одну неделю после настройки флаконов.
  3. Начиная на 10 день после создания флаконы, собирать девственной мух от флаконы и хранить их разделены по признаку пола.
  4. Соберите достаточно животных для эксперимента и возраста их как необходимые, 3 дня в этом примере.
    Примечание: Обычно мы анестезировать животных с CO2 для обработки. CO2 , как известно, влияют уровни активности животных для длительных периодов времени после лечения (например, см. Бартоломью et al. 201511). Если эффект CO2 препятствует запланированных течению анализов или анализа, используйте метод другой анестезии как лед анестезии.

3. сбор данных с REQS

  1. Анестезировать животных, которые будут использоваться для осуществления исследования по количественной оценке с CO2 или другого метода анестезии. Разделите их на группы по мере необходимости и загрузить групп животных в пустых стеклянных трубок монитора активности; в этом примере 10 животных того же возраста загружаются в стеклянную трубку, с 10 репликация для каждого животного типа (секс/генотип). Убедитесь, что вы обратите внимание, какие животные тип загружается в каждой тюбике.
    Примечание: Для больше экспериментов, питание могут быть включены в образец трубки. В этом случае важно, что пища является безопасным и не стать выбили во время вращения.
  2. Загрузить пробирного стеклянных трубок в REQS блок и закрепите их с резиновые уплотнительные кольца. При работе с более чем одного пола/генотип, используя рандомизированных блок конструкции или рандомизации положение животных в REQS позволит устранить любые потенциальные последствия позиции. Рандомизации может достигаться путем назначения каждого флакона случайное число, например от веб-генератор случайных чисел (например, https://www.randomizer.org/) или в электронной таблице и затем заказа флаконов на основе случайного числа.
  3. Поместите REQS в инкубатор для обеспечения постоянной температуры, влажности и свету условий. Убедитесь, что кабели питания и данных подключены правильно.
  4. Разрешить животных, чтобы оправиться от анестезии и акклиматизироваться к новой среде за 1 час.
  5. Начните эксперимент, инициируя REQS на желаемую скорость вращения.
    Примечание: Еще один вариант — сначала собирать базовые данные о деятельности от животных до начала вращения, следуют записи уровни активности в ответ на стимуляцию вращения.
  6. Начать сбор данных, открыв программное обеспечение DAMsystem308 (просто открытие программного обеспечения инициирует сбор данных). Данные записываются в текстовый файл с заданным интервалом (здесь, 5 минут); При необходимости, измените параметры интервала в закладке «Настройки» (см. шаг 1.4).
  7. Чтобы гарантировать, что данные успешно передаются на компьютер, откройте текстовый файл, созданный DAMsystem308 программного обеспечения после одного или двух интервалов времени прошло и подтвердите, что данные записываются в файл. Закрыть и снова открыть этот файл, чтобы увидеть данные из любой точки дополнительное время. Сбор данных для желаемого количества времени; в этом примере, 2 ч.
    Примечание: Не открывайте инкубатора в период анализа, как животные очень чувствительны к любой беспорядков и скорее всего будет реагировать с повышенной активностью.
  8. В конце упражнения assay прекратить сбор данных путем закрытия DAMsystem308 программного обеспечения, а затем выключить REQS. Удаление животных из стеклянных трубок пробирного и очистить трубы. Животные могут быть перемещены обратно в пищевой флаконов если повторяется, необходимы меры в разных возрастов.
    Примечание: Если смертей происходят в ходе осуществления режима, она должны регистрироваться, как присутствие мертвые мухи могут влиять деятельность графов. В нашем опыте с DGRP2 летать линии12,13позаниматься в 4 об/мин 2 h не приводили к любой смерти, но слабее штаммы могут реагировать по-разному.

4. анализ данных

  1. Откройте файл .txt, под названием «Monitor1» производства программного обеспечения DAMSystem308.
  2. Проверка файла данных для любых проблем, которые могли произойти во время сбора данных (пропущенные время точек, и т.д.; Таблица 1). При необходимости, цензор файла путем удаления точек данных в начале и в конце записи.
  3. С помощью статистического программного обеспечения по вашему выбору (например, R), анализировать собранные данные. Генерировать описательной статистики и осуществляют дисперсионный анализ (ANOVA) расследовать такие эффекты, как секс и генотип, если данные нормально распределены. Если данные не распространяются как правило, используйте непараметрические методы, такие как тесты Крускала-Уоллиса, для сравнения групп. Конкретные необходимые анализы будет зависеть от конкретного научного вопроса и экспериментальный дизайн.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Из отдельных run с REQS выводится таблица данных, производимых DAMSystem308 программного обеспечения, которое будет называться «Monitor1.txt» по умолчанию (для примера см. дополнительный файл 1). Отрывок из такой таблицы показан в таблице 1. Каждый столбец содержит данные из отдельных пробирного трубки, в то время как строки содержат активности, измеряемая в каждый интервал времени от начала эксперимента (вверху) до конца (внизу). Первые три точки данных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как представитель результаты показывают, REQS точно измерять активность осуществления дрозофилы. REQS является гибким и позволяет исследователям решать разнообразные исследования вопросов, относящихся к биологии упражнения или упражнения вмешательств. Существует два важных шага в протоколе для выделения. Во-первых важно для тестирования установки REQS для обеспечения передачи данных от REQS DAMSystem308 работает нормально. Если не правильно настроен, кабель данных может стать запутанной во время вращения, и иногда связь ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была поддержана премии номер P30DK056336 из Национального института диабета и ЖКТ и почек болезней через экспериментальный грант от питания и ожирения научно-исследовательский центр при университете штата Алабама в Бирмингеме в NCR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мониторинг активности дрозофилы TrikineticsLAM25HREQS компонент
Телефонный шнур для распутыванияUvitaluv20170719REQS компонент
Крышки флаконов (flugs)Genesee Scientific49-102Материалы для культуры дрозофилы
Флаконы Genesee Scientific32-120Материалы для культуры дрозофилы
Сетка для культуры дрозофилыCarolina Biological Supply173090Материалы для культуры дрозофилы
Кукурузная мукаPepsico43375Дрозофила медиа
ПатокаЗолотая бочкаBLA-GALДрозофила медиа
АгарАпекс Биоисследования66-103Дрозофила медиа
Неактивные сухие дрожжиGenesee Scientific62-106Drosophila media
TegoseptApex Bioresearch20-258Drosophila media
Пропионовая кислотаGenesee Scientific20-271Drosophila media

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  4. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance. PLoS One. 4 (6), e5886(2009).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (61), (2012).
  7. Mendez, S., et al. The TreadWheel: A novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila. PLoS One. 11 (10), e0164706(2016).
  8. Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
  9. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS One. 12 (10), e0185090(2017).
  10. Reed, L. K., et al. Genotype-by-diet interactions drive metabolic phenotype variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185 (3), 1009-1019 (2010).
  11. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  12. Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Res. 24 (7), 1193-1208 (2014).
  13. Mackay, T. F., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  14. Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and recording locomotor activity in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer's disease. Front Behav Neurosci. 11, 159(2017).
  15. Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Sci Rep. 5, 8454(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Activity MonitoringRotational ExerciseExercise BiologyGenetic PathwaysStatistical AnalysisIncubator ConditionsData Collection

Похожие статьи