Методическая статья

Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

DOI:

10.3791/57762

⸱

14 июня 2018 г.

 ,  , 
1Vanderbilt University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель настоящего Протокола заключается в том, для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, изолированных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Этот протокол предусматривает подготовка флэш замороженных образцов человеческой кишечника ткани, cryosectioning, обколоть окрашивание и обезвоживания, НОК и извлечение RNA.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод предназначен для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, собранных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Мы определили пять шагов в рабочем процессе, которые имеют решающее значение для получения РНК изоляты от кишечных ганглиев с достаточно высокого качества и количества РНК seq. Во-первых при подготовке кишечника ткани, каждый образец должен иметь все лишнюю жидкость, удалены промокательной до рихтовки serosa как можно больше в нижней части большого базовой формы. Затем образцы быстро заморожены на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane. Во-вторых при резании ткани, важно располагать cryomolds кишечная разделам параллельно плоскости полная myenteric сплетения, тем самым давая наибольшую площадь поверхности кишечного ганглиев на слайд. В-третьих, во время LCM, полиэтилен napthalate (PEN)-мембраны слайды предлагают наибольшую скорость и гибкость в зарисовке неоднородной формы кишечной ганглии, при сборе интестинальная ганглии. В-четвертых для различных визуализации кишечных ганглиев в пределах секции, этанол совместимых красители, как количество кресил фиолетовый, предлагают отличные сохранение целостности РНК относительно водные красители. Наконец для извлечения РНК из захваченных ганглии, мы наблюдали различия между коммерческой РНК добыча комплекты, которые принесли Реновированый РНК и качества, устраняя загрязнения ДНК. Оптимизация этих факторов в текущий протокол значительно ускоряет процесс и дает кишечных ганглиев образцы с исключительной РНК качества и количества.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод предназначен для получения высокого качества образцов РНК кишечных ганглиев от кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Протокол, описанные здесь был оптимизирован для обеспечения достаточной РНК качества и урожайности для РНК (РНК seq) последовательности и предназначен для использования с свежезаваренным резецируется, нефиксированных, флэш замороженные кишечных тканей человека.

Расстройства функциональные моторики желудочно-кишечного тракта и кишки затрагивает один из каждых четырех человек в Соединенных Штатах. Кишечные нервной системы (Ен), также именуемый второй мозг1, ч....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы, описанные здесь были одобрены, Вандербильт университета институционального обзора (КИБ).

1. подготовка до прибытия ткани

  1. Получение надлежащего утверждения IRB и координировать с учреждениями человеческий орган пожертвование для получения свежей резецируется, незафиксированная кишечных тканей от доноров, которые отвечают всем критериям исследований, необходимых для исследования.
    Примечание: Этот протокол может быть адаптирован для использования с мышей и других грызунов модели.
    1. Немедленно после резекции кишечника каждого сегмента, тщательно промойте люмен с охлажденной PBS или ткани-носитель для удаления о....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сделали несколько улучшений в существующих протоколов, позволяющих коллекции относительно быстрое интестинальной ганглиев от человека кишечные образцов с помощью LCM, отвечающие стандартам для РНК-Seq. Во-первых мы оптимизировали быстрое замораживание кишечных тканей сегментов в больших базовой формы на поверхности навозной жижи сухого льда в 2 МБ (рис. 1Б). Успехов во время cryosectioning и последующие LCM был получен путем класть кишечны.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта процедура позволяет эффективного сбора многочисленных кишечных ганглиев в качестве источника для получения РНК для РНК seq. Здесь мы ускорили процесс, изложенные в существующих протоколах, максимально сохраняя целостность РНК. Поскольку все шаги в этой процедуре являются взаимозависимыми, важно ликвидировать все вопросы с самого начала исследования и что все образцы подготавливаются как аналогично друг к другу как можно скорее, чтобы получить надежные РНК след

С самого начала процедуры РНК.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признательны донорам и их семей, которые сделали возможной эту работу. Мы также ценим помощь персонала в Международный Институт медицины и Теннесси доноров услуг для помогать координировать коллекции ткани, используемые в данном исследовании. Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья, низ OT2-OD023850 EMS2 и стипендиальной поддержки от НИЗ T32-DK007673 до AMZ. Мы благодарны сотрудникам Вандербильта трансляционная патологии общих ресурсов для доступа к LCM инструмент и консультации по подготовке ткани. Общий ресурс патологии Вандербильта ткани частично поддерживается NIH грантов P30-CA068485-14 и U24-DK059637-13. Мы благодарим....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% нейтральный буферизованный формалинSigmaHT501128-4L
2-метилбутанFisherO3551-4
3-мл шприцBD309628
50-мл конические пробирки, полипропилен Corning05-526B
Базовые формы 37x24x5мм, одноразовыеЭлектронная микроскопия науки5025511
Belzer UW  Решение для холодильного храненияBridge to LifeN.A.
CapSure Macro LCM крышкиArcturus, ThermoFisherLCM0211
пищевая пленка, пресс n Seal     Глади   N.A. 
Крезил фиолетовый ацетатAcros OrganicsAC405760025
разделочной доскеЭлектронная микроскопия науки63308
Этанол, 190 пруфФармко-ААПЕР111000190
этанол, 200 пруфФармко-ААПЕР111000200
стекольные стекла микроскопаФишер12-550-343
Перчатки, удлиненная манжетаMicroflex 
Халаты, хирургически-одноразовыеKimberly-Clark 19-088-2116
Поднос, 20 л (большая полипропиленовая стерилизующая сковорода)Nalgene   1335920B
СалфеткиKimberly-Clark 34120
Кимвайпы (маленькие)Kimberly-Clark 34133
Система микродиссекции лазерного захвата (ArcturusXT)ThermoFisherN.A.
Leica Cryostat Chuck, большой,  40 мм Юго-восточная служба патологических инструментовN.A. 
Световой микроскопOlympusCX43
Объектив для микроскопа (20X)Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17N.A.
Объектив для микроскопа (10X)Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-N.A. 
Молекулярные ситаAcros OrganicsAC197255000
воды без нуклеазыAmbionAM9937
PicoPure RNA Extraction kitApplied Biosystems12204-01
Пеллетный пестикKimble Kontes4621973
PEN мембрана LCM слайдыArcturus, ThermoFisherLCM022
Пробирки без РНКазы, 1,5 млAmbionAM12400
РНКазеZAP НаборSigma-R2020
"A" (PicoPure)Набор для экстракцииApplied Biosystems12204-01
(RNeasy  Микронабор)Qiagen74004
Метод экстракции РНК "C" (ТРИзол)Invitrogen15596-026
Набор для экстракции РНК "D" (RNeasy PLUS Mini kit)Qiagen74134
Splash Shield, одноразовый лицевой щитокFisher17-310
Ножницы, хирургические, 14,5 см "острый-острый"Fine Science Tools14002-14
Фильтр для шприцев, ацетат целлюлозы (0,2 шт; m)Nalgene   190-2520
Среда для замораживания тканейОбщие данные ЗдравоохранениеTFM-5
КсилолыФишераX3P1GAL
19010144 для экстракции РНК Sigma РНК "B"

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

entericTFM

Похожие статьи