Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

Aaron A. May-Zhang; Karen K Deal; E. Michelle Southard-Smith

doi:10.3791/57762

Method Article

Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

DOI:

10.3791/57762

⸱

June 14th, 2018

Aaron A. May-Zhang¹ , Karen K Deal¹ , E. Michelle Southard-Smith¹

¹Vanderbilt University Medical Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель настоящего Протокола заключается в том, для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, изолированных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Этот протокол предусматривает подготовка флэш замороженных образцов человеческой кишечника ткани, cryosectioning, обколоть окрашивание и обезвоживания, НОК и извлечение RNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод предназначен для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, собранных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Мы определили пять шагов в рабочем процессе, которые имеют решающее значение для получения РНК изоляты от кишечных ганглиев с достаточно высокого качества и количества РНК seq. Во-первых при подготовке кишечника ткани, каждый образец должен иметь все лишнюю жидкость, удалены промокательной до рихтовки serosa как можно больше в нижней части большого базовой формы. Затем образцы быстро заморожены на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane. Во-вторых при резании ткани, важно располагать cryomolds кишечная разделам параллельно плоскости полная myenteric сплетения, тем самым давая наибольшую площадь поверхности кишечного ганглиев на слайд. В-третьих, во время LCM, полиэтилен napthalate (PEN)-мембраны слайды предлагают наибольшую скорость и гибкость в зарисовке неоднородной формы кишечной ганглии, при сборе интестинальная ганглии. В-четвертых для различных визуализации кишечных ганглиев в пределах секции, этанол совместимых красители, как количество кресил фиолетовый, предлагают отличные сохранение целостности РНК относительно водные красители. Наконец для извлечения РНК из захваченных ганглии, мы наблюдали различия между коммерческой РНК добыча комплекты, которые принесли Реновированый РНК и качества, устраняя загрязнения ДНК. Оптимизация этих факторов в текущий протокол значительно ускоряет процесс и дает кишечных ганглиев образцы с исключительной РНК качества и количества.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод предназначен для получения высокого качества образцов РНК кишечных ганглиев от кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Протокол, описанные здесь был оптимизирован для обеспечения достаточной РНК качества и урожайности для РНК (РНК seq) последовательности и предназначен для использования с свежезаваренным резецируется, нефиксированных, флэш замороженные кишечных тканей человека.

Расстройства функциональные моторики желудочно-кишечного тракта и кишки затрагивает один из каждых четырех человек в Соединенных Штатах. Кишечные нервной системы (Ен), также именуемый второй мозг¹, ч....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы, описанные здесь были одобрены, Вандербильт университета институционального обзора (КИБ).

1. подготовка до прибытия ткани

Получение надлежащего утверждения IRB и координировать с учреждениями человеческий орган пожертвование для получения свежей резецируется, незафиксированная кишечных тканей от доноров, которые отвечают всем критериям исследований, необходимых для исследования.
Примечание: Этот протокол может быть адаптирован для использования с мышей и других грызунов модели.
1. Немедленно после резекции кишечника каждого сегмента, тщательно промойте люмен с охлажденной PBS или ткани-носитель для удаления о....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сделали несколько улучшений в существующих протоколов, позволяющих коллекции относительно быстрое интестинальной ганглиев от человека кишечные образцов с помощью LCM, отвечающие стандартам для РНК-Seq. Во-первых мы оптимизировали быстрое замораживание кишечных тканей сегментов в больших базовой формы на поверхности навозной жижи сухого льда в 2 МБ (рис. 1Б). Успехов во время cryosectioning и последующие LCM был получен путем класть кишечны.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта процедура позволяет эффективного сбора многочисленных кишечных ганглиев в качестве источника для получения РНК для РНК seq. Здесь мы ускорили процесс, изложенные в существующих протоколах, максимально сохраняя целостность РНК. Поскольку все шаги в этой процедуре являются взаимозависимыми, важно ликвидировать все вопросы с самого начала исследования и что все образцы подготавливаются как аналогично друг к другу как можно скорее, чтобы получить надежные РНК след

С самого начала процедуры РНК.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признательны донорам и их семей, которые сделали возможной эту работу. Мы также ценим помощь персонала в Международный Институт медицины и Теннесси доноров услуг для помогать координировать коллекции ткани, используемые в данном исследовании. Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья, низ OT2-OD023850 EMS² и стипендиальной поддержки от НИЗ T32-DK007673 до AMZ. Мы благодарны сотрудникам Вандербильта трансляционная патологии общих ресурсов для доступа к LCM инструмент и консультации по подготовке ткани. Общий ресурс патологии Вандербильта ткани частично поддерживается NIH грантов P30-CA068485-14 и U24-DK059637-13. Мы благодарим....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
10% нейтральный буферизованный формалин	Sigma	HT501128-4L
2-метилбутан	Fisher	O3551-4
3-мл шприц	BD	309628
50-мл конические пробирки, полипропилен	Corning	05-526B
Базовые формы 37x24x5мм, одноразовые	Электронная микроскопия науки	5025511
Belzer UW Решение для холодильного хранения	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM крышки	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
пищевая пленка, пресс n Seal	Глади	N.A.
Крезил фиолетовый ацетат	Acros Organics	AC405760025
разделочной доске	Электронная микроскопия науки	63308
Этанол, 190 пруф	Фармко-ААПЕР	111000190
этанол, 200 пруф	Фармко-ААПЕР	111000200
стекольные стекла микроскопа	Фишер	12-550-343
Перчатки, удлиненная манжета	Microflex
Халаты, хирургически-одноразовые	Kimberly-Clark	19-088-2116
Поднос, 20 л (большая полипропиленовая стерилизующая сковорода)	Nalgene	1335920B
Салфетки	Kimberly-Clark	34120
Кимвайпы (маленькие)	Kimberly-Clark	34133
Система микродиссекции лазерного захвата (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Leica Cryostat Chuck, большой, 40 мм	Юго-восточная служба патологических инструментов	N.A.
Световой микроскоп	Olympus	CX43
Объектив для микроскопа (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Объектив для микроскопа (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Молекулярные сита	Acros Organics	AC197255000
воды без нуклеазы	Ambion	AM9937
PicoPure RNA Extraction kit	Applied Biosystems	12204-01
Пеллетный пестик	Kimble Kontes	4621973
PEN мембрана LCM слайды	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
Пробирки без РНКазы, 1,5 мл	Ambion	AM12400
РНКазеZAP	Набор	Sigma-R2020
"A" (PicoPure)Набор для экстракции	Applied Biosystems	12204-01
(RNeasy Микронабор)	Qiagen	74004
Метод экстракции РНК "C" (ТРИзол)	Invitrogen	15596-026
Набор для экстракции РНК "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, одноразовый лицевой щиток	Fisher	17-310
Ножницы, хирургические, 14,5 см "острый-острый"	Fine Science Tools	14002-14
Фильтр для шприцев, ацетат целлюлозы (0,2 шт; m)	Nalgene	190-2520
Среда для замораживания тканей	Общие данные Здравоохранение	TFM-5
Ксилолы	Фишера	X3P1GAL

19010144 для экстракции РНК Sigma РНК "B"

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles