Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57762

⸱

14 июня 2018 г.

 ,  , 
1Vanderbilt University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Цель настоящего Протокола заключается в том, для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, изолированных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Этот протокол предусматривает подготовка флэш замороженных образцов человеческой кишечника ткани, cryosectioning, обколоть окрашивание и обезвоживания, НОК и извлечение RNA.

Аннотация

Этот метод предназначен для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, собранных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Мы определили пять шагов в рабочем процессе, которые имеют решающее значение для получения РНК изоляты от кишечных ганглиев с достаточно высокого качества и количества РНК seq. Во-первых при подготовке кишечника ткани, каждый образец должен иметь все лишнюю жидкость, удалены промокательной до рихтовки serosa как можно больше в нижней части большого базовой формы. Затем образцы быстро заморожены на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane. Во-вторых при резании ткани, важно располагать cryomolds кишечная разделам параллельно плоскости полная myenteric сплетения, тем самым давая наибольшую площадь поверхности кишечного ганглиев на слайд. В-третьих, во время LCM, полиэтилен napthalate (PEN)-мембраны слайды предлагают наибольшую скорость и гибкость в зарисовке неоднородной формы кишечной ганглии, при сборе интестинальная ганглии. В-четвертых для различных визуализации кишечных ганглиев в пределах секции, этанол совместимых красители, как количество кресил фиолетовый, предлагают отличные сохранение целостности РНК относительно водные красители. Наконец для извлечения РНК из захваченных ганглии, мы наблюдали различия между коммерческой РНК добыча комплекты, которые принесли Реновированый РНК и качества, устраняя загрязнения ДНК. Оптимизация этих факторов в текущий протокол значительно ускоряет процесс и дает кишечных ганглиев образцы с исключительной РНК качества и количества.

Введение

Этот метод предназначен для получения высокого качества образцов РНК кишечных ганглиев от кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Протокол, описанные здесь был оптимизирован для обеспечения достаточной РНК качества и урожайности для РНК (РНК seq) последовательности и предназначен для использования с свежезаваренным резецируется, нефиксированных, флэш замороженные кишечных тканей человека.

Расстройства функциональные моторики желудочно-кишечного тракта и кишки затрагивает один из каждых четырех человек в Соединенных Штатах. Кишечные нервной системы (Ен), также именуемый второй мозг1, часто находится в центре этих расстройств, как она играет решающую роль в кишечнике гомеостаза и подвижности. Манипуляция сократительной способности кишечника обычно ограничивались хирургическая резекция aganglionic/noncontractile ткани, хронический диетическое изменение и/или лекарства. Удивительно полным транскриптом взрослых ENS остается последовательной, значительно ограничивает нашу способность идентифицировать молекул в ENS, которые могут быть направлены фармацевтически или используются в терапии стволовой клетки.

Существует относительно небольшое число методов для изоляции RNA от человека кишечные ганглии. Первый подход, клетки диссоциации2, требует температуры высокой инкубации и длительный инкубационный раз; оба из которых известны содействовать деградации РНК и изменить транскриптом2,3. Альтернативный подход, НОК, более надежно сохраняет транскриптом и защищает целостность РНК. Хотя ряд исследований использовали LCM для сбора ганглиев от кишечных тканей человека свежемороженые4,5,6, эти подходы были либо затруднены бедных РНК качества и количества, были довольно трудоемкий, или необходимые модификации пятнать или РНК добыча методы для работы в наших руках. Другие LCM протоколы предназначены для сохранения РНК, которые были найдены в продукте LCM, предоставляемых пособий, дополнительные усовершенствования7,8, но адаптация необходима при применении к изоляции кишечных ганглиев8, 9. по этим причинам, мы разработали оптимизированный протокол, основанный на эти ресурсы, дает значительное количество высокопрочные РНК от человека кишечные ганглии, имеет сравнительно быстрый рабочий процесс и производит последовательные результаты через большой Количество выборок.

В этом исследовании мы представляем краткий обзор оптимизации процедур, которые способствуют изоляции высокопрочные РНК от кишечных ганглии, получены из резекции кишечника ткани человека. Наш метод включает в себя пять важных аспектов. Во-первых, свежезаваренным резецируется, незафиксированная человека кишечные образцы должны быть сокращены до размера, имеют все излишки влаги удален с ткани лаборатории и выравнивается в большой базы плесень до флэш замораживания на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane (2 МБ). Во-вторых, гистологическое части кишечника должны быть готовы получить полное плоскости myenteric сплетения на слайде, который предлагает большой полезной кишечной ганглии. Успех этого шага в значительной степени зависит от процесса подготовки ткани. В-третьих неоднородной структуры ганглиев в ENS требует использования полиэтиленовых napthalate (PEN) мембраны слайды6, который предлагают наибольшую скорость и точность в процессе НОК. Четвертый, этанол совместимых красителей, таких как количество кресил фиолетовый, должны использоваться для сохранения целостности РНК во время окрашивания кишечных ганглии. Наконец процесс извлечения РНК имеет решающее значение для успешного исхода с РНК-последующие Мы стремились РНК добыча подход, который производит высокой целостности РНК, максимизирует РНК урожайности при запуске с небольшими коллекциями кишечных ганглиев, устраняет загрязнения ДНК и сохраняет как много видов РНК как можно скорее.

Вместе взятые, оптимизация этих факторов в настоящем исследовании значительно ускоряет процесс и дает образцы кишечных ганглиев с исключительной РНК количества и качества. Результаты были во многом согласуется среди значительные группы образцов, указывающее последовательность этого подхода. Кроме того мы использовали эти подходы для успешной виртуализации десятки образцов РНК от кишечных ганглии. Стратегии, подчеркнул здесь также может быть широко адаптирована для выполнения LCM желаемого ганглиев или ядер периферической и центральной нервной системы и других случаях, требующих изоляции высокого качества РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы, описанные здесь были одобрены, Вандербильт университета институционального обзора (КИБ).

1. подготовка до прибытия ткани

  1. Получение надлежащего утверждения IRB и координировать с учреждениями человеческий орган пожертвование для получения свежей резецируется, незафиксированная кишечных тканей от доноров, которые отвечают всем критериям исследований, необходимых для исследования.
    Примечание: Этот протокол может быть адаптирован для использования с мышей и других грызунов модели.
    1. Немедленно после резекции кишечника каждого сегмента, тщательно промойте люмен с охлажденной PBS или ткани-носитель для удаления остаточного материала Люминал или Кале.
    2. После промывки и выброса отходов в соответствующей биологической сосуда, погружать ткани в достаточном объеме ткани-носителя (например, 3 - 5 раз объем кишечного ткани) и хранить в индивидуально меченых воды плотный пластик контейнеры, погруженной в лед или в холодильнике до использования).
    3. Обрабатывать ткани в течение 18-26 часов от времени сбора для предотвращения существенной деградации РНК.
      Примечание: В зависимости от чистоты кишечных сегмента и хранения, это может быть возможным распространить наши предлагаемые сроки.
  2. Подготовить все материалы, необходимые для коллекции тканей человека заранее, как указано в настоящем Протоколе (см. Таблицу материалы для более подробной информации). Убедитесь, что все необходимые средства индивидуальной защиты носится во все времена.
  3. Подготовьте сухой лед ведра наряду с сухим льдом пульпы, как показано на рисунке 1.
    1. Раздавить достаточно сухого льда для заполнения 4 стандартных круговой лед ведра и одно прямоугольное ведро льда. Один из стандартных контейнеров должны иметь небольшие (11 x 21 см) Лаборатория тканей помещается на поверхности сухого льда. Если возможно используйте новые, закрытой коробки лаборатории тканей.
    2. Сделайте раствор сухой лед, powderizing 2 Л сухого льда в чистой прямоугольное ведро льда.
    3. Добавьте предварительно охлажденный 2 МБ до поверхности сухого льда. Слегка перемешать и придавить суспензии с помощью пипетки кончик Обложка формы поверхности навозной жижи в окружении больших частей сухого льда по бокам прямоугольное ведро канал.
    4. Место несколько тонких блоков сухого льда по краям ведро льда, чтобы стимулировать более быстрое замораживание. Там должно быть места для базовой формы ≥4 свободно помещается в ведро раствора сухого льда в данный момент.
      1. При необходимости стек ведро льда внутри другой прямоугольное ведро льда заполнены ¼ с сухим льдом. Это позиционирование помогает лучше изолировать навозной жижи сухого льда и предотвращает необходимость частых корректировок сухого льда и 2 МБ во время процедуры.
    5. Расположите сухой лед ведра в сборочной линии в следующем порядке: 1) сухого льда навозной жижи ведро, ведро льда ткани сухой 2) лаборатории, 3 & 4) обычной сухой лед ведра, 5) прямоугольной сухой лед ведро (рис. 1А).

2. Подготовка Flash замороженные кишечных тканей человека

Примечание: Весь этот процесс может занять от 45-80 мин на кишечные сегмент, в зависимости от качества кишечных тканей. Мы также рекомендуем, сбор образцов контроля качества для оценки качества РНК и гистология перед НОК.

  1. Заполнить большой поднос с влажного льда и место хирургические разделочные доски на вершине сухой лед.
  2. В этой установки холод 500 мл и 100 мл мензурки для хранения ткани и обрезать сегменты в холодного хранения решения. Предварительно холод база формы на доски так, что они готовы принять ткани.
  3. По получении свежей кишечных тканей, слить СМИ, в котором перевозится ткани и сохраняет его в предварительно охлажденные стаканы. Некоторые оставляют в эти стаканы для временного хранения кишечных тканей и подстриженные сегментов, которые будут подготовлены в последующих шагах.
  4. Вырежьте кишечных сегмент длиной около 20 см, что обеспечивает достаточно ткани (40-60 см2) для создания РНК нисходящие приложения и контроля качества образцов. В зависимости от целостности тканей это может быть возможным для достижения изоляции РНК для последующей обработки с гораздо меньшей длины (т.е. 5 см кишечника).
  5. Трим прочь жировой и соединительной ткани из кишечника, используя Ножницы хирургические. Остаточные жировой вдоль кишечных serosa подрывает способность полностью свести ткани в последующих шагах. Тщательно Обрежьте ткань, с тем чтобы избежать уменьшение поперечного сечения serosa во время удаления жира и соединительной ткани, которые структурно может повредить myenteric сплетения или сделать внешний вид ткани неравномерно сплющить для разрезания.
  6. Сделайте продольный разрез вдоль всей длины кишечника образца, предпочтительно в месте верхней брыжеечной вложения.
  7. Вскрыть прочь и отбросить теня палочки из толстой кишки, так что он выравнивает более легко, после освобождения от напряжения.
  8. Скошенный кишечника слизистую оболочку стороне вниз на охлажденные разделочную доску и вырежьте полоски шириной 1,25 см от полной длины ткани.
    Примечание: Кишечные ткани часто расширяет после обрезки, так что этот размер должен быть соответствующим образом скорректированы.
  9. Временно Храните полоски в охлажденной ткани хранения решения.
    Примечание: Мы используем Belzer UW холодного хранения решения, потому что он имеет длительный срок хранения, относительно экономически эффективным и может храниться при комнатной температуре до тех пор, пока требуется.
  10. Удаление полосы ткани из холодного хранения решения и разрезать его на сегменты ~1.5-2 см длиной.
  11. Быстро промокните кишечных сегментов в стеке лаборатории салфетки, чтобы удалить лишнюю жидкость и предотвратить образование кристаллов льда вдоль кишечных serosa во флэш замораживания. Если ткань высушивается не достаточно, это будет трудно получить высокое качество разделы из myenteric сплетения.
  12. Класть блотирования кишечных кусочки слизистой оболочки стороне на предварительно охлажденные, большой, одноразовые базовый пластмасс (37 x 24 x 5 мм).
  13. Тщательно выравнивают каждый сегмент слегка растяжение тканей над поверхностью базовой формы и с помощью Изогнутый пинцет аккуратно прижмите и изгнать все пузырьки воздуха, которые могут быть в ловушке под serosa. Обратите внимание, что расширяет сферу уплощение ткани. При необходимости, обрезать сегменты и вырезать остальные образцы с меньшим размером.
    Примечание: Если ткань истощенные, то это будет мешать myenteric сплетения. После того, как будут удалены все пузырьки воздуха, оцените толщину образца до замораживания. При необходимости нажмите края внутрь образца до кишечной образца приближается к своей оригинальной толщины.
  14. Поместите загруженные базы плесень на поверхность сухим льдом, суспензии 2 МБ. Ткани следует полностью замораживание в течение 30-60 сек, в зависимости от размера и толщины кишечника сегмента.
  15. Химчистка в нижней части базовой формы для удаления остаточного 2 МБ, быстро потерев базы плесень на лабораторных ткани, предварительно охлажденный в втором сегменте, сухого льда.
  16. Высушенные образцы передать третьей ванны сухого льда и похоронить его по поверхности сухой лед, до тех пор, пока он готов быть обернуты.
  17. Быстро наблюдать в нижней части базы плесень до упаковка, чтобы изучить качество подготовки образца. Запишите любые образцы, которые не появляются плоские или имеют большие воздушные пузыри, как они должны избегать для cryosectioning и НОК.
  18. Оберните образца в предварительно помечены алюминиевой фольги, которая укладывается поверх сухого льда в контейнере таким образом, чтобы упаковка ткани происходит во время держат полностью заморожены.
  19. Оберните образца с слоем полиэтиленовой пленкой, чтобы свести к минимуму обезвоживания тканей во время хранения при температуре-80 ° C.
  20. Хранить образцы в прямоугольное ведро, пока они не готовы быть перемещены в морозильник.
  21. Предварительно метку и предварительно охладите морозильная камера коробки на-80 ° C для немедленного хранения образцов после сбора.
  22. Возьмите небольшую часть ткани от каждого кишечных сегмента для оценки целостности РНК до проведения НОК.
    1. Предварительно ярлык бесплатно РНКазы трубку 2 мл для каждого сегмента, наполненный пола≥500 мкл буфера lysis. Мы рекомендуем использовать РНК добыча комплект «D», перечисленных в Таблица материалов.
    2. Гомогенизации маленьких (2 мм х 2 мм) кусок кишечника в стандартные ткани микро гомогенизатора (20-40 s, до тех пор, пока не куски ткани остаются). Затем немедленно заморозить РНК lysate на сухой лед и хранить при температуре-80 ° C до разбирательства с извлечение RNA.
    3. При необходимости внедряйте некоторые из разделов в ткани замораживания среднего (TFM) как back-up. Подготовка разделов ткани в точно так же, описанные в этом разделе, но потопить образцов в TFM в пределах базовой формы до флэш замораживания.

3. Cryosectioning

  1. До cryosectioning подготовить все необходимые материалы для окрашивания и обезвоживания и передавать образцы желаемого ткани из морозильной камеры-80 ° C в ведро сухого льда.
  2. Подготовить криостат для использования, установив для оптимального раскроя температуры (-18-22 ° c) и вытирая вниз поверхностей с 100% этанола и лечении лезвие и чистите лоток с РНКазы обеззараживания решения.
  3. Лучше всего придерживаться образец патрона, используйте следующий подход.
    1. Место щипцами в сухой лед для по крайней мере 30 s перед разверток кишечных образца и поместив его на поверхности сухой лед serosa стороной вверх.
    2. Залить 3-5 мм Курган ткани замораживания среды (TFM) на держатель образца большой криостат и немедленно передать кишечных образца serosa стороной вверх на TFM.
    3. Быстро передавать держатель образца сухого льда и накрыть порошкообразного сухого льда после позволяя TFM придерживаться образца для 2-5 s при комнатной температуре. Убедитесь, что TFM остается ниже плоскости myenteric сплетения.
      Примечание: В идеале, внешняя поверхность слизистой оболочки кишечника будет полностью придерживаться TFM прежде чем TFM начинает заморозить без оттаивания образца.
  4. Смонтировать держатель образца в криостата образца голову и выравнивание образца с лезвием криостат, таким образом, чтобы плоскость myenteric сплетения будет параллельно лезвие.
  5. Установите Толщина резания на криостат для 8 мкм. Отлично выравнивание образца предназначен для получения максимально возможной площади поверхности myenteric сплетения на каждом слайде. Эта толщина обычно рекомендуется для ткани человека и грызунов, но может быть скорректирована, при необходимости.
  6. Раздел через serosa и продольные мышцы до достижения myenteric сплетения.
    1. Чтобы найти myenteric сплетения, смонтировать раздел Пример на слайд и пятен раздел с водной краской, например 1% количество кресил фиолетовый или толуидиновый синий, и т.д.
    2. Просмотрите раздел под световой микроскоп с увеличением 40-2000 X для определения соединения между слоями продольных и круговых мышц. Микроскоп параметры приведены в Таблице материалов. В начале секционирование будет отмечен serosa присутствие соединительной ткани. Некоторые оставшиеся брыжеечных жира может также присутствовать вдоль serosa. Затем начинается лист внешней продольных мышц слоя. По достижении границы между слоями продольных и круговых мышц будет соблюдаться часть кишечных ганглиев.
      Примечание: В следующих нескольких разделах, myenteric сплетения, станет весьма очевидным, с большим swaths ганглии, присутствуя в пределах одного раздела (рис. 2C). Если ткани в начале секционирование не вполне плоско, то только часть ганглиев будет присутствовать в каждом разделе в данный момент. Иногда кишечные образца могут иметь по сути неравномерным myenteric сплетения, несмотря на ткани, появляются совершенно плоские. Это особенно верно для образцов двенадцатиперстную кишку. В нашем опыте, эти образцы может занять гораздо больше времени для обработки с LCM, но достаточно РНК могут быть собраны в течение одного дня сессии. Точное расположение myenteric сплетения может существенно различаться между образцами, основанный на ткани и его подготовки до замораживания.
  7. Начните сбор последовательных секций для LCM, с оптимальной коллекции, обеспечивая наибольшее количество нейронов и глии каждого слайда. В зависимости от площади поверхности образца несколько разделов могут быть объединены на один слайд перо мембраны.
  8. Смонтируйте разделы на перо мембраны слайды, охлажденные кратко в криостат для 5-10 s. При монтаже, ткани должны расплава незначительно, максимально сохраняя целостность РНК.

4. Окрашивание

Примечание: Обзор процесса окрашивания, обратитесь к таблице 1. Все решения, используемые готовятся в стандартных 50 мл конические флаконов. Лечении наружной трубки с РНКазы обеззараживания решения не представляется, улучшить результаты (данные не показаны).

  1. Подготовить насыщенный раствор 4% количество кресил фиолетовый в 95% этаноле заранее по крайней мере один день и полностью вновь приостановить количество кресил фиолетовый перед загрузкой шприца.
    Примечание: Концентрация этанола может потребоваться быть снижен для эффективного окрашивание, как описано в разделе обсуждения. Мы не испытали ли использование 50% или 75% этанола во время окрашивания значительно уменьшает РНК целостности. Количество кресил фиолетовый светочувствительных и таким образом должны быть защищены от света.
  2. После монтирования разделов myenteric сплетения на слайд, немедленно погрузите слайд в коническую пробирку 95% этанола (предварительно охлажденным при-20 ° C) для 30 s.
    1. Если разделы не полностью придерживаться слайд на предыдущем шаге, слегка теплой в нижней части слайда с перчатке (Лаборатория очистки должны быть помещены между слайд и перчатки), за полное соблюдение перед погружаясь в 95% этаноле. Это решение может быть повторно использован для по крайней мере 3-6 слайдов без снижения РНК целостности.
  3. Положите слайд вверх на wipe лаборатории размещены на вершине предварительно очищенной, RNase бесплатный контейнера8.
  4. Предварительно заполните шприц 3 мл с 4% количество кресил фиолетовый и прикрепить фильтр шприц 0,2 мкм.
    Примечание: Мы рекомендуем фильтры ацетат целлюлозы.
  5. 6-10 капель пятно непосредственно на ткани разделы8 и инкубировать на 10-30 s, или до достаточного краска сохраняется при исключении из окрашенных. Во время окрашивания, осторожно поверните контейнере слайда вручную, чтобы обеспечить, что в разделах ткани равномерно покрыты пятно.
  6. Слить пятно и немедленно снять пятно слайд в флакон 75% этанола. Неоднократно погрузите слайд до тех пор, пока избыток краска просочилась основном офф образца. Это может занять от 10-20 s.
  7. Завершить де пятнать неоднократно окунания образец в пузырек этанола 95% для 10 s. Submerge образца неоднократно до тех пор, пока все излишки пятно было удалено.
    1. Измените destaining продолжительность, при необходимости, для оптимизации пятнать ганглии. Если слишком много пятно удаляется, образец становится слишком прозрачным, и это может быть трудно визуализировать
      Примечание: Это окрашивание протокол оптимизирован на основе нескольких публикаций5,8,10,11 необходимые изменения до того, как были получены удовлетворительные результаты. Таким образом концентрация этанола, используемых в краске и во время процесса destaining следует изменить, при необходимости, для получения оптимального результата.

5. обезвоживание

  1. Сразу же погрузите слайд в 100% этанола 2 - 3 раза, для в общей сложности 10-20 s.
  2. Погрузите слайд в безводный 100% этанола для по крайней мере 30 s. Как очень гигроскопичен безводного этилового спирта, добавьте молекулярные сита (8-12 меш) флакон 100% этанола до начала процедуры, чтобы удалить любые поглощенной воды и таким образом более полностью обезвоживает образца5.
  3. Неоднократно погрузите слайд в ксилоле на 15-20 s. Этот шаг полностью удаляет слой этанола на слайде. Добавьте молекулярные сита досрочно трубы ксилол, чтобы полностью абсорбируются излишки этанол и вода молекул5.
    Предупреждение: Ксилолов классифицируются как раздражение глаз и верхних дыхательных путей и должен использоваться в химической зонта.
  4. Погрузите слайд в ксилоле (с молекулярные сита, 8-12 сетки) для по крайней мере 10 мин.
    Примечание: Краткий перерыв может приниматься после этого шага, при необходимости. Образцы можно оставить в ксилоле на 4-5 часов без вредных последствий для окрашивания, НОК или РНК доходность/целостность.
  5. При необходимости, индивидуально Подготовьте несколько дополнительные слайды на данный момент. При подготовке второго раунда слайды после завершения LCM на всех подготовленных слайдов, ткани в криостата может потребоваться refaced, из-за обезвоживания на поверхности ткани. Одного до четырех разделов может должны быть отброшены, прежде чем использовать разделы могут быть собраны.

6. Лазерная захвата Microdissection (LCM)

  1. Удалить слайд из ксилол и просушите его в химической зонт для по крайней мере 1 min. вставить картридж LCM шапки в LCM микроскопа. Загрузить слайд на сцену и приобрести обзор изображение слайда.
  2. Определить нужное место для LCM и загрузить колпачок на слайд.
  3. Совместите инфракрасные (ИК) лазер и отрегулировать его мощность и длительность сделать 20-30 мкм диаметр захвата пятна.
  4. Найдите лазер ультрафиолетового (УФ) и задайте соответствующие резки скорость и интенсивность.
  5. Наброски желаемого ганглиев собираться с помощью программного обеспечения LCM, убедившись в том, чтобы остаться в пределах границ области коллекционные на крышку (изображены в слайд Обзор программного обеспечения как зеленая окружность).
  6. В каждом из следов Отрегулируйте ИК пятна, таким образом, что есть по крайней мере один ИК съемки каждые 100-500 мкм.
  7. Нажмите кнопку Вырезать ИК/УФ приступить к коллекции все отмеченные ганглии.
  8. После завершения коллекции, переместите крышку на новое место и повторите процесс сбора или изучить LCM колпачок на КК станции после достаточно заполнена с ганглии (или пока не будет достигнуто рекомендуемый срок 60-80 минут).
  9. Если мусора присутствуют на крышку, протрите его с помощью острым концом кисточки, предварительно обработанных раствором РНКазы обеззараживания, промываются водой, нуклеиназы свободной и полностью высох.
  10. Тщательно изучить колпачок на глаз или с увеличением под микроскопом светлые области для обеспечения всех мусор был удален. Если мусор не могут быть удалены путем использования предварительно очищенной кисть, используйте кончик тонкой пипетки (РНКазы бесплатно) чтобы отчищать мусора.
  11. Закрепите колпачок на 0,5 мл отцентрифугировать заполнены с 230 мкл буфера lysis РНК (RLT буфера от РНК добыча комплект «B», с β-меркаптоэтанол добавлены в концентрации 10 мкл/мл).
  12. Инвертировать шапку, кратко вихрь и инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
  13. Центрифуга ≥ 5000 g x 5 мин и затем передачи отцентрифугировать трубки для сухого льда.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Лизатов РНК может храниться при температуре-80 ° C без существенного влияния на РНК деградации по крайней мере за 1 неделю. Если РНК изоляция выполняется в тот же день, затем охладите образцы на льду, пока они не готовы для извлечения.
  14. Выполните все дополнительные коллекции в рекомендованные максимальные сроки 80-90 мин после удаления слайд из ксилола. Как обезвоженные секций подвергаются воздействию влажности, полиадениновый постепенно может стать реактивирован. Ограничение периода сбора можно свести к минимуму таких последствий и максимально сохранить целостность РНК.

7. РНК изоляции

  1. Подготовьте РНКазы свободной станции для экстракции РНК.
  2. Подготовьте все трубы и реагенты согласно инструкции для извлечения набора РНК.
    Примечание: Хотя многие наборы доступны для изоляции РНК после LCM, у нас было лучшее успеха, используя РНК добыча комплект «B», в списке материалов. Смотрите Рисунок 5 для бок о бок сравнения РНК добыча реагентов.
  3. Удаление образцов из морозильной камеры-80 ° C и быстро таять в ванну воды 37 ° C.
  4. Сразу же вихрь талой образцы для 2-3 s, чтобы равномерно распределить тиоцианат соли Гуанидиновые.
  5. Объединить каждого образца с равным объемом 70% этанола. Бильярд 2 или более лизатов вместе, при необходимости, для достижения достаточной концентрации РНК.
  6. Действовать согласно инструкциям производителя в руководстве для процесса извлечения РНК, используя протокол, оптимизированный для microdissected образцов.
  7. Элюировать РНК на заключительном этапе в минимальный рекомендуемый объем свободной от нуклеиназы воды (14 мкл).
  8. После изоляции РНК аликвота 1-2 мкл РНК от каждого образца в новую предварительно помечены бесплатные РНКазы трубка для оценки качества/контроля качества микрофлюидика устройство, которое может визуализировать небольшие количества РНК, например Bioanalyzer. Алиготе дополнительные 1 мкл в отдельную трубу для количественной оценки с комплектом количественного определения РНК высок чувствительности.
    1. Настроить эти шаги, по мере необходимости, чтобы получить достаточное количество РНК течению анализа (т.е., бассейн большее количество LCM шапки перед извлечение RNA).
  9. Магазин РНК-80 ° c до сбора достаточно образцов для анализа ниже по течению.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы сделали несколько улучшений в существующих протоколов, позволяющих коллекции относительно быстрое интестинальной ганглиев от человека кишечные образцов с помощью LCM, отвечающие стандартам для РНК-Seq. Во-первых мы оптимизировали быстрое замораживание кишечных тканей сегментов в больших базовой формы на поверхности навозной жижи сухого льда в 2 МБ (рис. 1Б). Успехов во время cryosectioning и последующие LCM был получен путем класть кишечны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта процедура позволяет эффективного сбора многочисленных кишечных ганглиев в качестве источника для получения РНК для РНК seq. Здесь мы ускорили процесс, изложенные в существующих протоколах, максимально сохраняя целостность РНК. Поскольку все шаги в этой процедуре являются взаимозависимыми, важно ликвидировать все вопросы с самого начала исследования и что все образцы подготавливаются как аналогично друг к другу как можно скорее, чтобы получить надежные РНК след

С самого начала процедуры РНК...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

Мы признательны донорам и их семей, которые сделали возможной эту работу. Мы также ценим помощь персонала в Международный Институт медицины и Теннесси доноров услуг для помогать координировать коллекции ткани, используемые в данном исследовании. Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья, низ OT2-OD023850 EMS2 и стипендиальной поддержки от НИЗ T32-DK007673 до AMZ. Мы благодарны сотрудникам Вандербильта трансляционная патологии общих ресурсов для доступа к LCM инструмент и консультации по подготовке ткани. Общий ресурс патологии Вандербильта ткани частично поддерживается NIH грантов P30-CA068485-14 и U24-DK059637-13. Мы благодарим генома центр технологий доступа в отдел генетики в Вашингтоне школы медицины университета за помощь с геномного анализа. GTAC частично поддерживается NCI рака центр поддержки Грант #P30 CA91842 в Siteman центр рака и ИКТ/CTSA #UL1TR002345 грант от национального центра для исследования ресурсов (NCRR), компонент национальных институтов здравоохранения (НИЗ) и низ Дорожная карта для медицинских исследований. Эта публикация является исключительно ответственности авторов и вовсе не обязательно отражает официальное мнение NCRR или низ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% нейтральный буферизованный формалинSigmaHT501128-4L
2-метилбутанFisherO3551-4
3-мл шприцBD309628
50-мл конические пробирки, полипропилен Corning05-526B
Базовые формы 37x24x5мм, одноразовыеЭлектронная микроскопия науки5025511
Belzer UW  Решение для холодильного храненияBridge to LifeN.A.
CapSure Macro LCM крышкиArcturus, ThermoFisherLCM0211
пищевая пленка, пресс n Seal     Глади   N.A. 
Крезил фиолетовый ацетатAcros OrganicsAC405760025
разделочной доскеЭлектронная микроскопия науки63308
Этанол, 190 пруфФармко-ААПЕР111000190
этанол, 200 пруфФармко-ААПЕР111000200
стекольные стекла микроскопаФишер12-550-343
Перчатки, удлиненная манжетаMicroflex 
Халаты, хирургически-одноразовыеKimberly-Clark 19-088-2116
Поднос, 20 л (большая полипропиленовая стерилизующая сковорода)Nalgene   1335920B
СалфеткиKimberly-Clark 34120
Кимвайпы (маленькие)Kimberly-Clark 34133
Система микродиссекции лазерного захвата (ArcturusXT)ThermoFisherN.A.
Leica Cryostat Chuck, большой,  40 мм Юго-восточная служба патологических инструментовN.A. 
Световой микроскопOlympusCX43
Объектив для микроскопа (20X)Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17N.A.
Объектив для микроскопа (10X)Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-N.A. 
Молекулярные ситаAcros OrganicsAC197255000
воды без нуклеазыAmbionAM9937
PicoPure RNA Extraction kitApplied Biosystems12204-01
Пеллетный пестикKimble Kontes4621973
PEN мембрана LCM слайдыArcturus, ThermoFisherLCM022
Пробирки без РНКазы, 1,5 млAmbionAM12400
РНКазеZAP НаборSigma-R2020
"A" (PicoPure)Набор для экстракцииApplied Biosystems12204-01
(RNeasy  Микронабор)Qiagen74004
Метод экстракции РНК "C" (ТРИзол)Invitrogen15596-026
Набор для экстракции РНК "D" (RNeasy PLUS Mini kit)Qiagen74134
Splash Shield, одноразовый лицевой щитокFisher17-310
Ножницы, хирургические, 14,5 см "острый-острый"Fine Science Tools14002-14
Фильтр для шприцев, ацетат целлюлозы (0,2 шт; m)Nalgene   190-2520
Среда для замораживания тканейОбщие данные ЗдравоохранениеTFM-5
КсилолыФишераX3P1GAL
19010144 для экстракции РНК Sigma РНК "B"

Ссылки

  1. Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226(2015).
  3. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36(2010).
  4. Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
  5. Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  6. Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276(2014).
  7. PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
  8. Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
  9. Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
  10. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  11. Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
  12. Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
  13. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42(2014).
  14. Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851(2014).
  15. Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
  16. Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
  17. Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17(2016).
  18. Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).
  19. Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  20. Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  21. Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575(2015).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

entericTFM
Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.