Методическая статья

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

DOI:

10.3791/57763

⸱

10 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

* These authors contributed equally

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для визуализации разработки сердца в zebrafish в 4-измерениях (4-D). 4-D изображений, через свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM), занимает 3-мерных изображений (3-D) со временем, чтобы реконструировать развивающихся сердца. Мы покажем, и количественно и качественно, касательное напряжение активирует эндокарда Notch сигнализации во время разработки камеры, которая способствует сердечной trabeculation.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гемодинамические силы сталкиваются сердце влияние сердца развития, особенно trabeculation, который образует сеть ветвления наросты от миокарда. Генетическая программа дефекты в паз, сигнальный Каскад занимаются такие левого желудочка Non-уплотнение кардиомиопатия или синдром сердца гипоплазии левого желудочков дефекты. Используя этот протокол, можно определить, что касательное напряжение инициативе trabeculation и Notch сигнализации связаны друг с другом. С помощью микроскопии флуоресцирования свет лист, Визуализация развивающихся данио рерио сердца было возможно. В этой рукописи, она оценивалась ли гемодинамики силы модулировать начало trabeculation через выемку сигнализации и таким образом, влияние сократительной функции происходит. Для качественного и количественного сдвига стресс анализ, 4-D (3-D + время) изображения были приобретены во время данио рерио сердца морфогенеза и комплексной света лист флуоресцентной микроскопии с 4-D синхронизации захватили желудочков движения. Вязкость крови был сокращен через gata1a- Морфолино олигонуклеотиды (MO) микро инъекции для уменьшения напряжения сдвига, тем самым, вниз регулирующие выемку сигнализации и смягчающих trabeculation. Совместное инъекций Nrg1 мРНК с gata1a MO спасли Notch связанных генов для восстановления trabeculation. Для подтверждения инициативе Notch сигнализации при сдвиге влияния trabeculation, сокращение cardiomyocyte далее был арестован через tnnt2a-MO для уменьшения гемодинамики силы, тем самым, вниз регулирующие выемку целевых генов для разработки не trabeculated миокард. Наконец подтверждения, выражений шаблонов касательное напряжение отзывчивым Notch генов было проведено подвергать пульсирующего потока эндотелиальных клеток. Таким образом микроскопия свет лист 4-D непокрытый гемодинамики силы лежащие в основе Notch сигнализации и trabeculation с клинической значимости для не уплотнение кардиомиопатии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биомеханические сил, например гемодинамики при сдвиге, тесно вовлечены в сердечной морфогенеза. В ответ на гемодинамические сдвига миокарда гребней и пазов развиваются в волнообразных трабекулярной сети в соответствие с направлением касательное напряжение через предсердно (AV) клапан1. Сердца trabeculation необходимо увеличить сократительной функции и миокарда массовые2. Мутации в паз, сигнальные пути привести врожденных пороков сердца в организме человека и других позвоночных3. Например было показано, уменьшить эритропоэза, эритропоэтин (ЭПО) мРНК6 и7 Isoproterenol (ISO) увеличение красных кровяных gata1a4 и tnnt2a5 Морфолино олигонуклеотиды (MO) клетки и сердечного ритма соответственно и поэтому стены касательное напряжение (WSS). Кроме того ErbB2 сигнализации, вниз по течению выемки, способствует cardiomyocyte пролиферации и дифференцировки сформировать сократительной силы, которая в свою очередь активирует Notch сигнализации8,9. Он предложил что касательное напряжение регулирует Notch сигнализации приводом trabeculation желудочков развития. В настоящее время, существует множество исследований, которые пытаются понять генетического программирования событий, приведших к сердца врожденные дефекты (CHD)10,11,12, но очень мало изучают как формируя сердце влияние механических сил.

Для того чтобы расследовать механических сил, действующих на эндокарда, тщательное наблюдение в период развития должна осуществляться. Однако это является сложной задачей для получения хорошего качества изображения в vivo избиение образцы из-за наследования традиционных микроскопии13. Для того, чтобы наблюдать за развитием со временем в рамках выборки, физические секционирование и окрашивание, поэтому, должны произойти13,14,15. Хотя конфокальная микроскопия широко используется для изображения 3-D структуры образцов14,16, приобретение этих тепловизионных систем по-прежнему ограничивается медленной скорости сканирования.

Свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) это уникальный изображений техника, которая позволяет визуализировать в естественных условиях динамических событий с длиной рабочей расстояние13. Этот метод использует свет лист флуоресцентной микроскопии для оптически раздел пример17. Из-за освещения только тонкого листа света на образце является снижение отбеливание фото и фото токсичности13,18. Большое поле зрения и рабочим расстоянием позволяет для больших образцов остаются нетронутыми, поскольку они фотосъемка13,14,17. Низкий масштаб позволяет для большей площади для записи образа, а длинный рабочее расстояние позволяет толще образцов для записи образа без ущерба для отношение сигнал шум. Многие группы использовали LSFM для изображения, все эмбрионы17, мозги14,18, мышц и сердца19 среди других тканей, показаны различные виды образцов, которые могут быть образы.

Хотя предыдущие исследования показали снижение гемодинамического поперечной силы поглощения приток или отток треков сердца данио рерио, информация является исключительно качественные. Это приводит к ненормальной третьей камеры, снижение сердечного цикла и нарушением клапан формирования20. 4-D LSFM изображения дают новую перспективу в гемодинамических сдвига силы влияют на путь развития сердечной ткани. Эти механических сил может активировать силы чувствительных сигнальных молекул и стимулировать формирование трабекулярной хребтов. Из-за добавленного времени аспект 4-D изображений одна способна отслеживать изменения в развитии в режиме реального времени, что может привести к новые откровения, которые ранее незамеченным. Данио рерио является идеальной моделью для визуализации потому, что ученые могут наблюдать весь позвоночных животных против только ячеек взаимодействий. Кислород может также диффузных через весь эмбриона, который позволяет развитие происходит без зависимости от сосудистой системы, в отличие от млекопитающих развития. Даже несмотря на то, что сердце данио рерио не хватает легких органов, которые требуют четыре-сердце, существует большое количество сердца генов, которые сохраняются между21данио рерио и людей.

В этой рукописи мы опишем, как использовать свет лист флуоресцентной микроскопии для изображения развивающихся трабекулы в zebrafish сердца при различных обстоятельствах. Во-первых инъекции gata1a4 или tnnt2a5 MOs были использованы для ниже вязкости крови и поэтому WSS. Морфологии сердца, затем был записан. В отдельную группу рыб мы увеличилось WSS управляющими ЕПВ мРНК6 или isoproterenol7 и отметила результаты. Мы также провели исследование клеток с различными пульсирующего или колебательных расхода. После визуализации каждой группы, мы обнаружили, что WSS воспринимается эндокарда через выемку сигнализации начинает trabeculation.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие методы были исполнены в соответствии с протоколами Ута и UCLA IACUC. Эти экспериментальные группы были использованы с трансгенных Tg(cmlc2:gfp), wea (слабый Атриум) или clo (cloche) мутантов: управления () одичал тип (WT), (b) gata1a MO и (c) tnnt2a MO инъекции (Таблица 1).

МодельИмяИзмененные геныФенотипСсылка
УправленияДикого типаНетН/Д
TG(cmlc2:GFP)Легкие цепи миозина сердцаЗеленый flourescence, конкретно выражена в миокарде34
Снижение стены касательное напряжениеМутант слабые Атриум (wea)Heacy цепи миозина Атриум конкретныхАтриум не контракт, компактный желудочка, толстые стенки миокарда, узкий просвет, dialated Атриум,37
Мутант Cloche (clo)Н/ДПолное удаление эндокарда, unaturally большой атриум с малого желудочка, несуществующие сердечной cushins41
gata1a MO gata1a Анемия из-за отсутствия красных кровяных клеток4
tnnt2a MOtnnt2a39
Увеличение стены касательное напряжение ЕПВ мРНКНетТяжелые полицитемией, увеличение количества циркулирующих клеток крови, увеличение вязкости6
IsoprotenerolНетУвеличение сердечного ритма7

Таблица 1: Данио рерио описания. Определения и описания данио рерио, используемых в экспериментах.

1. исследование установки

  1. Подготовьте Nrg1 и ЕПВ мРНК для спасения trabeculation.
    1. Получить людей Nrg1 cDNA и усилить от доноров плазмиды.
      Примечание: CDNA человека Nrg1 был подарен от Уильям Талбот от Стэнфордского университета.
      1. Вывезти необходимые реактивы и материалы, а именно ПЦР mastermix (хранится в-20 ° C), грунты (см. таблицу 2) (хранится в-20 ° C), ПЦР-планшете (хранится при комнатной температуре) и 20 мкл пипетки (хранится при комнатной температуре). Таблица материалов для примера продуктов.
        figure-protocol-1
        Таблица 2: Праймеры для клонирования человека Nrg1 .
      2. Подготовьте mastermix для каждого праймера, в трех экземплярах с помощью пипетки 20 мкл. 1 набор triplicates используйте 37,5 мкл mastermix, 3 мкл ДНК свободной воды, 4,5 мкл праймера. Для более triplicates просто умножьте на количество выборок.
      3. Разбавьте рабочий раствор человеческого Nrg1 cDNA (20 нг/мкг концентрации) в полосе грунт с ДНК свободной воды, так что есть 10 мкл всего за хорошо на сэмпл.
        Примечание: Убедитесь, что каждое решение под шаг 1.1.1 равномерно распределены. Сделать это путем смешивания каждого решения, закупорить вверх и вниз. Для предотвращения перекрестного загрязнения, используйте один наконечник пипетки для только одного образца.
      4. Алиготе Nrg1 cDNA с 10 мкл многоканальные пипетки желаемого скважин в ПЦР-планшете.
      5. Добавьте 14,5 мкл mastermix cDNA в скважинах. Применять липкие Обложка к пластине ПЦР для герметизации скважин и место в машину ПЦР.
      6. Запустите машину ПЦР и гарантировать, что цикл достигает соответствующей температуры согласно ферментов и грунтовки используется.
    2. Клонировать Nrg1 cDNA в плазмиду pCS2+ на BamHI и EcoRI участках, с использованием избыточного ферменты BamHI и EcoRI для обеспечения cDNA перевязано в всех плазмид.
      1. Смешать Nrg1 cDNA с донором плазмида pCS2+, коммерчески доступных мастер смешать раствор и грунтовки (Таблица 2).
        Примечание: Общая реакция объем должен быть 50 мкл с 25 мкл мастер смеси, 3 мкл праймеров и 1 мкл 20 нг/мкл доноров плазмида с Nrg1 cDNA.
      2. Поместите смесь из шага 1.1.2.1 в машину ПЦР и установите параметры для удовлетворения следующих спецификаций: 98 ° C 10 s, 55 ° C за 5 или 15 s и 72 ° C для 5 s/КБ.
      3. Очищайте продукт PCR, используя набор для очистки следуя инструкциям производителя. Элюировать продукта в 50 мкл буфера.
      4. Дайджест очищенный продукт PCR и 5 мкг pCS2+ с BamHI и EcoRI отдельно при 37 ° C на 2 ч в объеме 200 мкл реакции. Очистить результате пищеварения с комплектом коммерческих и элюировать в 20 мкл и 100 мкл трис-HCl (рН 8,5), соответственно.
      5. Перевязать 4 мкл Nrg1 cDNA и 2 мкл усваивается pCS2+ плазмид в 25 мкл реакции с 1 мкл лигаза катализатора на 16 ° C на ночь.
        Примечание: Процедура может быть остановлено здесь на ночь инкубации.
      6. Используйте 2 мкл лигирование решения из шага 1.1.2.5 и преобразование в 50 мкл клеток бактерий E. coli подходит для клонирования (см. Таблицу материалы).
    3. Убедитесь, что преобразование имело место, скрининг, что Nrg1 cDNA клоны с помощью ПЦР. Выберите клоны наугад и добавить в решение конкретных грунты, полимеразы и deoxyribonucleotide трифосфаты (дНТФ).
      Примечание: Элементы управления были вектор (pCS2+) и без вставки (человека cDNA). Не выбрать слишком большой колонии, потому что чрезмерное бактерий может ингибировать ПЦР.
      1. Выберите 8 колоний от преобразования и экран pCS2+-Nrg1 клоны, используя праймеры PCR из таблицы 2.
      2. Культура один клон с Nrg1 cDNA изолировать pCS2+-Nrg1 плазмидной ДНК. Прививать с 100 мкл бактерий кишечной палочки с pCS2+-Nrg1 плазмида в 100 мл LB СМИ и культуры путем встряхивания (160-225 RPM) при 37 ° C.
    4. Transfect очищенный pCS2+-Nrg1 плазмида в ГЭС-293-клеток в 6-ну пластину, используя коммерческие трансфекции реагент следуя инструкциям производителя.
    5. 24 ч после трансфекции, Лизируйте клетки с помощью буфера lysis и запустить через геля SDS-PAGE, передать гель мембраны и затем пятно с анти-Nrg1 антитела22. Проверка Nrg1 выражения протеина используя Вестерн блоттинга.
      Примечание: Элемент управления является пустым pCS2+ плазмиды. Может быть приостановлена здесь если гель мембраны передача происходит в одночасье.
    6. Синтезировать Nrg1 мРНК с помощью коммерческого продукта аналогична в Таблице материалов и следуйте инструкциям производителя.
      1. Возьмите 5 мкл pCS2+-Nrg1 ДНК от культуры бактерий изолированные и дайджест с Ноти в 200 мкл реакции втечение 2 ч при 37 ° C для линеаризации плазмиды.
      2. Очистить линеаризованного плазмида с комплектом коммерческих и элюировать в 20 мкл трис-HCl (рН 8,5).
      3. Проведение в vitro транскрипция с комплектом изоляции коммерческих РНК в 20 мкл реакции с использованием 5 мкл линеаризованного плазмида следуя инструкциям производителя.
      4. Добавить в vitro расшифрованный Nrg1 350 мкл буфера lysis РНК и затем очистить комплект изоляции РНК. Элюировать РНК в 60 мкл трис-HCl (рН 8,5).
      5. Измерение концентрации РНК и хранить при температуре-80 ° C для использования в будущем.
    7. Выполните шаги 1.1.6.1 - 1.1.6.5 выше для ЕПВ cDNA и мРНК подготовки, но также клона cDNA в плазмиду pCS2 + EcoRI и XhoI сайтов вместо.
  2. Придать Морфолино данио рерио
    1. Дизайн23 MO инъекции, используя онлайн инструмент (Таблица материалов) против ГПТ последовательность gata1a4 (5 ' CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) и tnnt2a5 (5 ' CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
    2. Добавьте gata1a и tnnt2a MO отдельно от нуклеиназы свободной воды, чтобы сделать окончательный концентрации 8 нг/nL и 4 нг/nL, соответственно. Повторите с ЕПВ мРНК с конечной концентрации 20 ПГ/nL. Убедитесь, что конечный объем 1 мл.
    3. Придать 1 nL 8 нг/nL gata1a MO и 1 nL 4 нг/nL tnnt2a MO в отдельные данио рерио эмбрионов на 1 до стадии 4-секционный для сокращения желудочков стены касательное напряжение (WSS)24. Чтобы увеличить WSS, придать 1 nL 20 ПГ/nL ЕПВ мРНК6 в zebrafish эмбрионы на стадии 1 - 4-клеток.
  3. Химически лечения данио рерио ингибировать trabeculation
    1. С помощью пипетки 20 мл, разбавить 10 мг/мл AG1478 в 1% ДМСО в E3 среднего до конечной концентрации 5 мкм 30 ФВЧ в 15 мл трубку. Как элемент управления рассматривать каждую рыбу с только 1% ДМСО.
    2. Добавить N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t бутилового эфира (DAPT) в 1% ДМСО (100 мкм) средний E3 в 15 мл трубки для ингибирования Notch сигнализации на 40 hpf аналогичным образом. Как элемент управления лечить с только 1% ДМСО.

2. изображений техники

  1. 4-D сердечной LSFM изображений с алгоритм синхронизации
    1. Захватить изображения 2-D эмбриона всю рыбу несколько сердечных, победив циклов, используя шаги ниже (рис. 1). Убедитесь, что свет лист толщиной около 5 мкм. Взять 1 мкм для потерь цифровой выборки согласно принципу проб Найквиста25500 x-y кадров с выдержка 10 г-жа набор z сканирование.
      1. Создайте гель агарозы 1% (w/v), добавив 1 g агарозы в 100 мл и Отопление, до тех пор, пока все агарозы растворяется. Загрузить небольшой пластиковой трубки с эмбриона и агарозы с помощью пипетки 20 мкл и закрепите его на сцене.
      2. Открыть изображение просмотра программного обеспечения и нажмите кнопку Live чтобы увидеть живой вид образца. Отрегулируйте цели, используя регулятор, так что образец находится в фокусе. Аналогичным образом переместите сцену, чтобы жить образца отображаются в верхней части зародыша.
      3. Возьмите изображения 500 раз за 5 сек при 10-кратном с помощью микроскопа программного обеспечения26.
      4. Переместить стадии, используя двигатель на новый слой (1 мкм в оси z) и повторите процедуру визуализации.
      5. Повторите вышеуказанные 2 шага до тех пор, пока весь сердце полностью отражаться.
    2. Обеспечить целостность данных, игнорируя изображения первого и последнего сердечного цикла. Найти период сердечного цикла, сопоставляя фотографии, которые были приняты в один и тот же момент времени сердечного цикла, но в разные периоды. Используйте следующее уравнение, который был разработан, чтобы найти в период:
      figure-protocol-2(1)
      где D -это стоимость функция, используемая для установки периода гипотеза, яm образа, τ' время, образ был захвачен, zk z направлении индекс изображения, xm является вектор пиксель индекса, и Т ' периодических гипотеза.
    3. Для поиска относительный переход между двумя изображениями в аналогичных этапов используется следующее уравнение:
      figure-protocol-3(2)
      где Qk', k обозначает стоимость функция для относительного сдвига, R — возможные пространственных окрестности, L является общее время захвата изображения, x является пиксель индекс, zk и zk' являются первый и второй z направлении ломтиками, t — время и s является гипотеза относительный сдвиг.
    4. Преобразовать относительный сдвиг в абсолютный сдвиг в отношении первое изображение и решить линейное уравнение с помощью псевдо-обратный подход, чтобы найти абсолютное отношение для выравнивания в следующем разделе изображений как описано27.
    5. Окончательный 4-D изображения были обработаны с помощью программного обеспечения для обработки изображений (Таблица материалов).
      1. Укладка изображения 2-D в 3-D
        1. Откройте Коммерческая обработки изображений программное обеспечение.
        2. Нажмите кнопку открыть данные.
        3. Выберите все изображения, чтобы быть уложены в 3-D > нажмите кнопку Load.
        4. Добавить в размере voxel 0,65 x 0.65 x 1 > нажмите кнопку ОК.
        5. Щелкните поле Зрения Multi-Planar для визуализации 3-D изображения.
        6. Щелкните правой кнопкой мыши поле синий slice_1.tiff > выберите дисплея > выберите Volren.
        7. Нажмите кнопку изменить > выберите функции > выберите редактировать Colormap.
        8. Настройка цвета с помощью поля красным > нажмите кнопку ОК.
      2. Преобразование 3-D в 4-D
        1. Нажмите кнопку «файл > открыть данных временных рядов.
        2. Выберите 3-D ссоры, которые были только что сделаны > нажмите кнопку Load.
        3. Введите же размера voxel, как раньше.
        4. Щелкните правой кнопкой мыши поле синий slice_1.tiff > выберите «экран» > выберите Volren.
        5. Нажмите кнопку изменить > выберите функции > выберите редактировать Colormap. Настройка цвета с помощью поля > нажмите кнопку ОК.
        6. Щелкните правой кнопкой мыши Время серии управления > выберите киностудия > нажмите кнопку Play для того, чтобы смотреть фильм.
        7. Добавьте имя файла, размер кадра, частоту кадров, качество, равным 1, тип стереокартинки > нажмите кнопку Применить
        8. Экспорт видео. Откройте видео в соответствующее программное обеспечение.

3. qRT ПЦР-анализа

  1. Данио рерио сердца РНК изоляции для количественного определения Notch лигандов, рецепторы и целевых генов выражения
    1. Пожертвуйте данио рерио, подвергая их передозировки tricaine Метилат28,29. С помощью описанных протокол30, данио рерио сердца были подакцизным и подготовлен для изоляции РНК.
    2. Изолировать всего РНК и синтез cDNA, используя комплект для синтеза cDNA следуя инструкциям производителя.
    3. Дизайн праймеры PCR для лигандов паз Jag1, Jag2, Dll4, рецептор Notch1bи сигнализации связанных генов ErbB2и Nrg1 . Смотрите таблицу 3 грунты, которые мы использовали.
    4. Добавьте грунты из шага 3.1.3, изолированные mRNA от шага 3.1.2 и коммерческих mastermix ПЦР-планшете. Запустите qRT ПЦР в соответствующей температуры и время согласно ферментов, используемых. Нормализовать результаты данио рерио α-миозина.
      Примечание: Это будет рассчитать уровни выражения для каждого лигандов, рецепторы и генов.

4. в vitro эксперименты человека аорты эндотелиальных клеток (HAEC)

  1. Модель динамического напряжения сдвига
    1. Культура клетки HAEC с HAEC культуры средств массовой информации. После того, как полностью вырожденная, разоблачить клетки для ламинарного потока и пульсирующего потока 23 х 10-5 N со скоростью 1 Гц за 24 ч.
      1. Разминка EC СМИ/DMEM 10% FBS в воде ванна 20 мин.
      2. Извлечение HAEC клетки из бака жидким азотом и поместите ампулу в водяной бане до растаял.
      3. С помощью пипетки 1000 мкл, удаление талой клетки и положил их в 15 мл с 3-5 мл средства массовой информации. Центрифуга клетки решение на 53 g x 3 мин.
      4. Аспирационная решение покинуть и добавить достаточно СМИ за общим объемом 10 мл. Добавить решение клеток в стерильную колбу T75, крышка колбу и распространять ячейки равномерно на нижней пластине.
      5. Марк колбу с инициалами, Дата, тип ячейки и номер прохода. Инкубируйте настой при 37 ° C, 5% CO2, до тех пор, пока клетки являются 80% притока. Не забудьте изменить СМИ каждые 2-3 дня.
      6. Использование коммерческих насос, прикрепите трубы колбу и задайте параметры, упомянутые выше в шаге 4.1.131,,3233.
    2. Добавьте GI254023X в 50 мл HAEC среды в конечной концентрации 5 мкм, 30 мин.
    3. С предварительно смешанные GI254023X ADAM10 ингибитор, который подавляет Notch сигнализации, проведение же ламинарного потока или потока ударные эксперименты как 4.1.1.
    4. Количественно лигандов паз (Jag1, Jag2 и Dll4) и паз целевых генов (волосатые и усилитель Сплит [ГЭС]) с помощью qRT ПЦР для четырех групп HAEC образцов (ламинарного потока, ламинарные + GI254023X, пульсирующего потока, пульсирующего потока + GI254023X) описано выше32.

5. спасение и Гиперэкспрессия Notch сигнализации

  1. Придать 1 nL подготовленный Nrg1 мРНК в концентрации 5 ПГ/nL (от шага 1.1.6) на стадии 1-4-клеток с gata1a MO для того, чтобы overexpress Notch целевых генов24.
  2. Придать 1 nL Nrg1 мРНК в wea мутант в аналогичный способ24.
  3. Двойной концентрации мРНК Nrg1 (10 ПГ/nL) и придать24 1 nL в zebrafish соблюдать желудочков морфологии.
  4. Придать 1 nL 20 ПГ/nL ЕПВ мРНК6 в zebrafish эмбрионы на стадии 1-4-секционный дополнить кроветворения увеличить желудочков WSS как ранее показанный24.
  5. Придать 1 nL 50 мкм Isoproterenol7, который увеличивает скорость сократимости, E3 средний за 24 часа при данио рерио культивировали как ранее показанного24.
  6. Выполните 4-D LSFM изображений для каждой группы. Следуйте инструкциям шагов 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. Количественная оценка фракционного сокращения и объем изменений с течением времени

  1. Выполнение визуализации LSFM 4-D для каждой группы в 50, 75 и 100 hpf. Следуйте инструкциям шагов 2.1.1-2.1.5.2.8. Разделите каждое изображение так, что каждый имеет 600 узлов для репликации движения сердца стены.
  2. Измерить изменение в диаметре желудочка во время диастола и систолы, по следующей формуле:
    figure-protocol-4(3)
    Загрузить 3-D желудочков изображения на каждый 0,1 s с программного обеспечения визуализации и измерения объема.
  3. Участок изменения объема со временем для каждой экспериментальной группы в 75 hpf и 100 hpf.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM был использован в этой рукописи для того, чтобы приобрести 2-D и 3-D изображений с высоким разрешением. Как видно на рисунке 1A и 1B, освещение объектива направляет свет лист на образец. Из-за тонкости света листа горит только одной плоскости. Линза обнаружения устанавливается перпендикулярно к освещенности объектива и сосредоточена на световые плоскости (рис. 1B). Затем свет лист от освещенности объектива с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы показали, что 4-D изображений может использоваться для отслеживания развития трабекулярной сети в ответ на изменения в биомеханических сил. В частности касательное напряжение опытных эндотелиальных клеток инициирует паз, сигнальный Каскад, который в свою очередь способствует trabeculation. В этой рукописи мы показали, что (1) gata1a MO инъекций снизилась кроветворения и поэтому она сократила стены касательное напряжение, (2) tnnt2a MO инъекции тормозится желудочков сократительной фун...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить благодарность Уильям Талбот Стэнфордского университета для предоставления человека Nrg1 cDNA и Дебора Yelon от UCSD для обеспечения WEA мутантов. Авторы хотели бы также поблагодарить за помощь с приобретением изображений Синтия Чэнь. Это исследование было поддержано грантов низ HL118650 (к Hsiai т.к.), HL083015 (к Hsiai т.к.), HD069305 (чтобы оплата Чи и т.к. Hsiai.), HL111437 (к Hsiai т.к. и оплата Чи), HL129727 (к Hsiai т.к.), T32HL007895 (для р.р. Севак Packard), 134613 HL (чтобы V. Мессершмидта) и Университет Техаса системы звезды финансирования (Джей ли).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Clontech Hifi PCR pre-mix Такара 639298PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Человеческий Nrg1 кДНКПодарок от Уильяма Талбота, Стэнфордский университет, Стэнфорд, Калифорния, СШАН/ДИспользуется для спасения трабекуляции
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Система обнаружения ПЦР в реальном времениBio-Rad1855201PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+GE HealthPlasmid, используемая для синтеза мРНК
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Набор для очистки нуклеоспинов   Clontech740609.25Очистка ДНК
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 ДНК-лигаза Clontech2011APCR Ligation solution
1.1.2.5
Звездные компетентные клеткиClontech636763E. coli клетки, используемые для трансформации
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Липофектамин 2000 реагент для трансфекцииLife Technologies11668027Реагент для трансфекции
1.1.4
набор mMessage SP6InvitrogenAM1340Набор, используемый для синтеза мРНК
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820очищает РНК 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8GeneToolsN/AПрограммное обеспечение для дизайна праймеров
1.2.1, 3.1.3
EPO кДНКCreative BiogeneCDFH006026увеличивает WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich T4182Ингибитор ErbB
1.3.1
СредаДля выращивания эмбрионов
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich D5942&ингибитор гамма-секретазы
1.3.2
Агароза Сигма-Олдрич A9539Используется для монтирования эмбрионов
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT  Цифровая CMOS-камераHamamatsu PhotonicsC11440-42UИспользуется для захвата изображений
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira SoftwareFEI SoftwareN/AВизуализированные и проанализированные изображения в 3D, и 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Трикаон мезилат Сигма-Олдрич 886-86-2Используется для гуманного успокоения или жертвоприношения эмбрионов
3.1.1
iScript набор для синтеза кДНКBio-Rad1708890Синтезирует кДНК
3.1.2
Микроцентрифуга Eppendorf 5424 МикроцентрифугаEppendorf05-400-005Микроцентрифуга
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich 260264-93-5Ингибитор ADAM10
4.1.2, 4.1.3 
Изопреналина гидрохлоридSigma-Aldrich I5627Изопротеренол повышает WSS
5.1.5
MATLABMathworksN/AАнализ механики сердца
E3

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662(2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718(2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520(2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060(2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818(2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65(2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081(2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923(2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007(2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489(2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165(2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121(2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109(2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Теги

Notch4DGata1aNrg1Tnnt2a

Похожие статьи