Обнаружение антител, которые нейтрализуют клеточного поглощения фермента терапии с Cell-based Assay

Краткое содержание

Здесь мы представляем цитометрии метод на основе ячеек потока для обнаружения нейтрализующих антител или других факторов, которые мешают клеточного поглощения фермента терапии в матрице человека, например спинномозговой жидкости (CSF) или сыворотку крови человека.

Аннотация

Администрация фермента терапии (ГЭР) и другие биологические терапии пациентам может вызывают иммунный ответ против наркотиков. Характеристика этих антител против наркотиков (ADA), особенно те, которые могут нейтрализовать биологической активности препарата, называют нейтрализующих антител (NAbs), имеет решающее значение в понимании последствий этих антител на препарат фармакологических профиль. Этот протокол описывает метод цитометрии потока на базе клетки для выявления факторов, которые нейтрализуют клеточного поглощения представитель лизосомальных ERT человеческой матрицы. Протокол состоит из трех процедур: скрининг, подтверждающего шаг и титр анализов для выявления, идентификации и установить относительный уровень нейтрализации титр антител в теме образцы.

В этом методе, образцы являются сначала смешивают с продуктом ERT конъюгированных Флюорофор, а затем инкубировали с клетками [например, человеческий Т-лимфоцитов (Jurkat клетки)], которые выражают рецептор 6-фосфата маннозы катион независимые клетк поверхности (CI-M6PR), и Наконец проанализированы с проточный цитометр. Пример без NAbs приведет к поглощение конъюгированных Флюорофор ГЭР продукта через CI-M6PR, в то время как присутствие NAbs будет привязать к препарату и вмешиваться в CI-M6PR привязки и поглощения. Количество конъюгированных Флюорофор ГЭР внутреннюю Jurkat клеток измеряется проточной цитометрии и оцениваются как ингибирование сигнала в процентах (%), по сравнению с ответ, получены в присутствии представителя наркотиков наивно матрицы. В подтверждающих шаг образцы предварительно инкубируют с конъюгированных ERT магнитные бусы, разрушают наркотиков специфические факторы, которые связывают к препарату (например NAbs) до инкубации клеток. Образцы, которые экран и подтверждают положительные для конкретных наркотиков NAbs в assay затем серийно разводили сформировать титр антител. Титры полуколичественного антитела могут быть соотнесены с измерениями безопасности лекарственных средств и эффективности.

Введение

Оценка иммуногенности является важной частью безопасности и эффективности программа для любых биологических терапевтических продукта, включая Эртц мониторинг. Пациентов может развиться иммунный ответ, который может непосредственно повлиять на безопасность препарата, эффективность и фармакокинетические/фармакодинамические профили. Подмножество этих ADA, называется NAbs, могут препятствовать эффективности ERT двумя способами: путем ингибирования ERT поглощения в целевой ячейке или запрещая ERT каталитической активности. Представленные здесь метод предназначен для измерения NAbs, которые мешают ERT поглощения в клетки. Полностью контролировать безопасность и эффективность терапевтических ERT, постоянный мониторинг NAbs имеет решающее значение для выяснения любых потенциальных корреляции с клинических исходов или фармакодинамические эффекты¹.

Платформы для оценки NAbs против белков терапии включают на основе ячеек, Ферментативная активность и Связывание лиганда анализов¹. Оптимальное пробирного платформа выбирается на основании различных критериев: механизм действия терапевтических продуктов, пробирного платформы чувствительность, избирательности, точность, и главное, его способность имитировать ингибирующее действие NAbs в естественных условиях . Лиганд привязки анализов может быть уместным в некоторых случаях (например, когда соответствующие ячейки строки не могут быть идентифицированы или если соответствующие чувствительность не может быть достигнута на основе ячеек пробирного). Однако в 2016 проект FDA руководства для документа промышленности и другие отрасли приняли официальные документы, на основе ячеек NAb, анализов, рекомендуется, потому что они могут лучше отражать биологический механизм наркотиков в естественных условиях^{1,2 , 3}.

Критические компоненты для разработки пробирного NAb потока на основе ячеек цитометрии включают подходящих клеточная линия, которая реагирует на препарат стимуляции, положительный контроль суррогатной NAb, который нейтрализует ГЭР, конъюгированных Флюорофор ГЭР и биологических видов испытаний Матрица^4,5,6. Выбор линии клетки зависит от ERT механизм действия и несколько клеточных линий должна оцениваться в ходе анализа развития³. В метод, описанный здесь клетки человека Jurkat T были отобраны для их эндогенных CI-M6PR выражение на поверхности клеток и отсутствие антител фрагмент рецепторов (FcRs), которые неизбирательно связывают регион ФК большинства антитела^7,8 . В ходе анализа развития важно установить отрицательный контроль для проверки исследований и образце пациента, тестирование, например сыворотки пула от лиц, которые не были обработаны с тест статьи¹. Линии клетки также должны терпеть соответствующих матриц из разных видов для непрерывности через стадии доклинических, клинических и пост маркетинга развития наркотиков¹. Другим компонентом является выбор позитивные пробирного управления. Положительный контроль для поглощения assay клетки ERT был выбран на основе своей способности связывать терапевтического и нейтрализовать поглощение через CI-M6PR^9,1. Часто бывает трудно получить полезные или устойчивого количество нейтрализации антисыворотками от человеческих субъектов для использования в качестве пробирного управления, особенно в популяциях пациентов редкие болезни². Альтернативы включают в себя антисыворотками от гипер иммунизированных животных, или очищенного сродство моноклональных и поликлональных антител, шипами в Пробирной соответствующих матрица¹. При использовании вегетационных матрицы, вполне возможно, что ингибирующее факторы помимо антител в матрице может тормозить ERT поглощения. Другим важным компонентом assay является конъюгированных Флюорофор ГЭР. Выбор Флюорофор для сопряжения ERT должен вычисляться для каждого ERT, на основе анализа потребности для яркости, рН стабильности и потенциальных спектрального наложения в другие каналы на проточный цитометр.

Assay, описанные здесь является примером для измерения NAb в терапевтических белка, такие как ERT, в которые входит ячейка через CI-M6PR. Несколько ГЭР, предназначенные для лечения расстройств лизосомальных хранения (ЗПУ), используют этот путь для поглощения клеток и лизосомальных таргетинга, включая elosulfase альфа для синдром Моркио A, cerliponase альфа болезни Баттена CLN2, agalsidase альфа болезнь Фабри, и Alglucosidase альфа Pompe болезни^10,11. Этот метод предназначен для измерения относительных уровней NAbs, которые мешают наркотиков привязки и интернализации через CI-M6PR. Это выполняется в многоуровневых скрининг, подтверждающего и титр шаги³. Образцы сначала проверяется на NAb позитивность и затем подтвердил позитивного подтверждающего шаге. Наконец образцы, которые подтверждают положительные и экранов может серийно разводили сформировать титр антител¹. Этот assay поглощения наркотиков цитометрии потока на основе клеток обеспечивает чувствительных и механически соответствующим в vitro метод измерения NAbs конкретных наркотиков, которые могут повлиять на фармакологические профилей наркотиков. Ранее мы проверить метод и протестировать клинических образцов, с использованием этой платформы для препарата альфа elosulfase⁸. Здесь мы описываем подробные пошаговые протокол, который может применяться для других терапевтических белков или ГЭР.

Протокол

Человеческой матрицы были приобретены из коммерческих источников с одобрения от их институционального обзора (КИБ), но должны рассматриваться как потенциально инфекционными. Убедитесь, что лабораторные среды используется поддерживает культуру безопасности¹².

1. перед началом Assay

1. Подготовьте конъюгированных ERT стрептавидина магнитные бусы согласно инструкции производителя¹³.
2. Подготовка образцов для контроля качества (бок): Спайк положительный контроль антитела (PC) (например, NAb) в матрице вегетационных (например, пула спинномозговой жидкости или сыворотки).
   Примечание: FDA и EMA руководство рекомендует подготовку высокого и низкого качества для проверки пробирного и процедуру тестирования^1,14.
   1. Например чтобы получить КК на 10 мкг/мл, добавьте 10 мкл запасов позитивного управления 1 мг/мл в 990 мкл соответствующей матрицы (например, СМЖ) для суммарный объем 1000 мкл.
   2. Аликвота КК образцы в томе подходит для одного использования (например, 50 мкл) и заморозить аликвоты на -60-80 ° C¹.
   3. Алиготе вырезать точки контроля (CC), поставляемому матрицы, не получавших тест статьи (например, пула спинномозговой жидкости или сыворотки) для одного использования (например, 50 мкл) и заморозить аликвоты на -60-80 ° C¹.
3. Выполните сопряжение реакции между Флюорофор и ГЭР, используя набор белков маркировки согласно производителя протокол¹⁵. Аликвота образца в объеме, подходящие для одного использования (например, 50 мкл) и заморозить аликвоты на -60-80 ° c.

2. день 1: Обшивка клеток и подготовка образца

1. Подготовка клетки пластины
   1. Использование культуры ткани капюшоном и поддержание асептических условий для следующих шагов. Спрей каждый объект, который будет помещен в капот с 70% этанола и поддерживать чистую окружающую среду^16,17,18.
   2. Теплые среднего роста клеток (например, RPMI 1640 с 10% плода bovine сыворотки и 1% пенициллин стрептомицина) в ванну воду или шарик при 37 ° C¹⁹.
   3. Количество человека T лимфоциты Jurkat клетки и пластины 100 мкл в скважине на 7,5 x 10⁵ клеток/мл в 96-луночных раунд дно клетки культуры плита пригодна для использования на проточный цитометр оснащен плита погрузчик.
      1. Например используйте Горяева или автоматизированные ячейки счетчик для подсчета клеток^20,21.
      2. Убедитесь, что клетки имеют по крайней мере 70% жизнеспособность прежде чем продолжить эксперимент (например, оценки жизнеспособности с Трипановый синий окрашивание)¹⁷.
   4. Инкубируйте клетки в 37 ° C инкубатор с CO₂ и 95% влажности 5% ночь для 14 – 20 ч.
2. Подготовка образца скрининг
   1. Разбавить тему или пробирного управления образцы с использованием сыворотки свободных средств массовой информации (например, RPMI 1640). В примере метод здесь развести образцы подаются в RPMI 1640, добавив 60 мкл пример 90 мкл сыворотки свободных средств массовой информации. (например, 8-газа трубы). Перейдите к шагу 3.1 для процедуры анализа подготовить Флюорофор меченых ERT.
      Примечание: Разбавление подаются экспериментально определены и является оптимальным для метода, представленные здесь. Оптимальный образец разведений должна определяться для каждого метода, который разрабатывается.
3. Подтверждающий шарик и образца подготовка
   1. Рассчитайте количество конъюгированных ERT бусы, необходимые для подтверждения образцов.
      1. Для 10 образцов, например, использовать 10 мкл образцы x 100 конъюгированных ERT бусы за образец + 30% дополнительно компенсировать любые потери во время стирки шаг = 1300 мкл конъюгированных ERT бусины.
   2. Вихревой бисер тщательно. Добавьте расчетное количество бисера в 15 мл Конические трубки для стирки.
   3. Вымойте конъюгированных ERT магнитные бусы, добавив 1300 мкл буфера муфты или как предлагается заводом-изготовителем (например, с фосфат амортизированное saline с 0.1% Полисорбат 20) следующие шаги ниже¹³.
   4. Вихревой трубе тщательно. Поместите трубку в стойку магнитные трубки на 2 мин. Не нарушая бисер, тщательно аспирационная и удалить супернатант.
      Примечание: Решение будет поворот от темно-коричневого до ясно когда бусы извлекаются магнитом.
   5. Ресуспензируйте бусины с 1300 мкл муфты буфера. Повторите шаги мыть для в общей сложности четыре смывки.
   6. После окончательной стирки приостановите бисер в 1300 мкл муфты буфера (ранее рассчитанные на шаге 2.3.1.1). 100 мкл на хорошо 96-луночных, белый, раунд-дно, полипропиленовые пластины обязательной согласно табличке карты (например, подтверждающего хорошо за образец или КК; образца будет разделить на дубликаты при инкубировали с надписью Флюорофор ГЭР).
   7. Место пластину на 96-луночных обходили стороной магнит и позволяют бусины сформировать лепешки. Тщательно аспирационная ясно супернатант и выбросьте его.
      Примечание: Решение будет поворот от темно коричневого до ясно после примерно 1 – 2 мин на магните обходили стороной. Полученные шарики, называются «сухой» бусины.
   8. Если образцы показан положительный и в настоящее время подтверждено, добавьте 100 мкл каждого образца с и без конъюгированных ERT бусины в соответствующих/назначение хорошо. Печать пластины с пластиковой пленкой и встряхните его по крайней мере 60 мин на роторный шейкер на приблизительно 800 об/мин при комнатной температуре (RT).
      Примечание: Ранее подготовленных и замороженных положительные и отрицательные бок и КС следует включить на каждой табличке.
   9. После инкубации поместите подтверждающего пластину на 96-луночных обогнул Сторона магнита и позволяют бусины сформировать лепешки.
4. Подготовка серии разрежения титр
   1. Подготовить серию титр, серийно разбавления образца в пуле матрица достаточное количество раз, чтобы пересечь заранее титр разрезать точку¹.
   2. Например Смешайте 30 мкл образца до 60 мкл пуле матрицы в серии разбавления 1:3 для в общей сложности 8 разведений (например, 8-газа трубы). Перейдите к шагу 3.1 для процедуры анализа подготовить Флюорофор меченых ERT.

3. день 1: Assay процедура

1. Подготовьте Флюорофор меченых ГЭР в сыворотке бесплатно среде (например, 60 мкл в колодец, или примерно 6 мл/плита).
   1. Например, чтобы подготовить 10 мл 1 мкг/мл Флюорофор меченых ERT, 10 мкл штока 1 мг/мл Флюорофор меченых ERT 9,99 мл сыворотки свободных средств массовой информации (например, RPMI 1640).
2. Плиты (например, 96-луночных, белый, раунд снизу, обязательной полипропиленовые плиты), добавьте в новый инкубационный подготовлены образцы от шаг 2.2, 2.3, или 2.4 и Флюорофор меченых ERT в смесь 1:1 в повторяющихся скважин (например, передача 60 мкл каждого подготовил образец и 60 мкл Флюорофор меченых ERT за хорошо).
   Примечание: Пример эксперимент пластины карты приводится на рисунке 1.

Рисунок 1: Пример макета пластины эксперимент. Образцы и Флюорофор меченых ERT инкубировали ночь на 2-8 ° C. Элементы управления, например высокого качества управления (HQC), низкого качества управления (LQC) и отрицательный контроль качества (NQC) были экранированные и подтверждено на противоположных углах пластины для оценки единообразия пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. Смешайте образцы и Флюорофор меченых ERT, закупорить вверх и вниз несколько раз с многоканальные пипетки. Оберните пластины в фольгу и инкубировать их на ночь на 2-8 ° C 14 – 20 ч.

4. день 2: Добавление подготовлены образцы клетки

1. Удаление знаке инкубации образца от инкубации при температуре 2-8 ° C и теплый пластины, помещая их в ванну шарик при 37 ° C 10 – 15 мин.
2. Удаление ячеек из инкубатора CO₂ . Выполните проверку визуального покрытием клеток с помощью инвертированного микроскопа для обеспечения что клетки появляются здоровые и равномерно через колодцы^17,19.
3. Добавьте 100 мкл ранее смешанных образцов и Флюорофор меченых ERT клетки пластины согласно карте экспериментальной пластины.
4. Место пластину ячейки с добавлены образцы обратно в CO₂ инкубатора 37 ° c. Инкубировать пластину для 3 h и ± 15 мин.
   Примечание: На этот раз был создан в лаборатории как оптимальный для ответа сигнала к шуму в assay.
5. Центрифуга пластину ячейки 6 мин на 320 x g в настольной центрифуги на 14-18 ° C. Подтвердите наличие клеток Пелле в нижней части тарелка скважин.
6. Держите пластины под углом 30 – 45°. Осторожно удалите супернатант из каждой скважины не нарушая Пелле ячейки. 200 мкл 1 x DPBS на Пелле ячейки, в каждой скважине Ресуспензируйте клетки.
7. Повторите клеток, мытье шаги для в общей сложности 3 стирок. Немедленно приступить к шаг 5 для окрашивания жизнеспособность клеток.

5. день 2: Сотовый жизнеспособности пятнать

1. С помощью многоканальных дозаторов, добавьте 100 мкл рабочего раствора 1 x Live/мертвые пятна в каждой скважине, отобранных для длина волны излучения отличаются от Флюорофор меченых ERT и подготовлен в соответствии с инструкциями изготовителя²².
2. Инкубируйте пластину для 15 мин на RT в темноте. Центрифуга пластину для 6 мин на 320 x g в настольной центрифуги на 14-18 ° C.
3. Осторожно удалите супернатант из каждой скважины не нарушая Пелле ячейки. Вымыть клетки 1 x с 1 x DPBS.

6. день 2: Исправление клетки с 1% параформальдегид

1. С помощью многоканальных дозаторов, лунки 100 мкл охлажденные (при 2-8 ° C) 1% параформальдегида (PFA) в каждой скважине.
2. Уплотнение пластины и аккуратно пульс вихревой смешивать. Оберните пластину в фольгу и поместите его на 2-8 ° C по меньшей мере 10 мин для фиксации.
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать разбрызгивания на прокладку пластины.
3. Добавьте 50 мкл 1 x DPBS в каждой скважины с помощью многоканальных дозаторов вверх и вниз до анализа.

7. проточной цитометрии

1. Поместите пластины на проточный цитометр с загрузчиком пластины и запускать их.
2. Приобретать и записывать измеренные средний флуоресценции интенсивности (MFI) с помощью программного обеспечения цитометрия потоков (см. Таблицу материалы).
   Примечание: В качестве примера для настройки загрузчика рис. Расхода потока проб, объем образца, смешивания объем, смешивая скорость и количество смеси оптимизированы для этот assay. Эти критерии могут быть отрегулированы с помощью кнопки «стрелки вверх» или «вниз» рядом с числами для каждого критерия, в зависимости от потока цитометрии приобретения программного обеспечения²³.

Рисунок 2: пример настроек загрузчика потока цитометр. Параметры загрузчика должны быть оптимизированы для калибровочных, что разрабатывается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. Создайте цитометр анализ/ворота/участки как показано на рисунке 3.
   Примечание: Ворота создания и применения могут отличаться для каждого потока цитометрии программного обеспечения²³.

Рисунок 3: проточная цитометрия стробирования стратегии. Jurkat клетки были отделены от всего событий и собранные вперед точечной (FSC) vs. стороне точечной (SSC) каналы черчения и рисования ворот вокруг целевой популяции. Майки (одной клетки) были отделены от Дуплеты или больших клеток агрегатов с помощью области FSC (FSC-A) и FSC (FSC-высота) каналы. Живые клетки были выбраны стробирования на синглетно клетки негативные для жизнеспособности пятно. Средний флуоресценции интенсивности (MFI) была измерена в единый, живой клетки Jurkat и выводится в виде гистограммы. МФО значений ячеек с наркотиками поглощение заблокирован (например, HQC) и клеток с управления указаны объемы поглощения (красный и синий, соответственно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. Исключить из анализа отмершие клетки и записать приблизительно 10 000 событий²³.

8. анализ данных

1. Экспорт данных (сырые MFI) программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалы).
   Примечание: В зависимости от анализа необходимо, приводимый ниже анализ данных может выполняться с помощью программного обеспечения для анализа.
2. Вычислите среднее МФО повторяющихся скважин (бок и образцы) и коэффициент вариации (% CV) для оценки изменчивости распространения дубликатов из виду.
   
   
   
3. Для образцов и бок, которые были проверены в assay, вычислить процент сигнала торможения (% SI) относительно среднего МФО из пула матрицы бок CC.
   
4. При необходимости, рассчитайте коэффициенты восстановления (РРП) для подтвержденных бок и образцы относительно значения соответствующих экрана.
   

Результаты

В первый день метода замороженные Алиготе Jurkat клеток было растаяло и покрытием, и образцы были подготовлены. Рисунок 1 показывает пример карты пластины. На второй день образцы были смешанные с Jurkat клетками и инкубировали при 37 ° C для примерно 3 ч. и 15 мин. Клетки были затем промывают, фиксированной с PFA и проанализированы на проточный цитометр. На рисунке 2 показан пример потока цитометр настройки.

Проточной цитометрии стробирования стратегия была разработана для измерения дозы конъюгированных Флюорофор препарата в живой единый Jurkat клетки²⁴ (рис. 3). Клетки были отделены от мусора, нарисовав ворота, что исключает сотовой мусора [как правило, низкая вперед точечной (FSC)] и мертвые клетки [как правило, высокой стороне разброса (SSC)], оставив только живые клетки для анализа²⁵. Отдельные клетки затем были отделены от кластеры клеток путем рисования ворота, что исключает районе высокий FSC и низкая высота FSC²⁶. Клетки обрабатывали жизнеспособности пятно, что помечены любой мёртвых или нездоровых клеток без нетронутыми мембраны, и дополнительные ворота был создан, чтобы исключить мертвые клетки²². МФО живой единичных клеток был использован для анализа конъюгированных Флюорофор ГЭР поглощения. В качестве примера скрининг результаты анализа потенциала матрица, шипами с высокое количество суррогатных антинаркотических антитела положительных управления [например, высокое качество управления (HQC)] тормозится конъюгированных Флюорофор ГЭР поглощения излучения, что приводит к низкой МФО из около 300 (рис. 3). В отличие от клетки инкубировали с матрицей в отсутствие антител положительный контроль должен иметь высокий МФО (МРИ = 37,830, на рис. 3), демонстрируя поглощение конъюгированных Флюорофор ГЭР.

Нейтрализации положительный контроль антитела для примера здесь был выбран на основе механизма действия препарата (например, поглощение ERT через CI-M6PR). Группа флуорофоров также протестированы и сравнении для оптимального пробирного чувствительность и динамический диапазон¹. Сайфер 5e был протестирован благодаря своей повышенной флуоресценции в кислой рН, которые могут иметь отношение к некоторых ГЭР в качестве дополнительной меры лизосомальных таргетинга наркотиков²⁷. Зеленый флуоресцентный краситель (например, Alexa Fluor 488) и far-red флуоресцентные краски (например, Alexa Fluor 647) были также изучены. Пример того, как различные флуорофоров может выполнять представлены в рисунке 4a и 4b. В этом примере Alexa Fluor 647 ERT имел лучшую производительность благодаря своей превосходной чувствительности (например, высокий % SI на низкие концентрации PC) и широкий динамический диапазон (~ 3 порядков).

Рисунок 4: пример результатов из различных Флюорофор ERT конъюгатов. (A) во время анализа развития, должны оцениваться кривой разрежения положительный контроль (PC), с использованием различных конъюгированных Флюорофор ГЭР. В примере, показанном здесь, два конъюгированных Флюорофор ГЭР (Alexa Fluor 488 и CypHer 5e) на 6,25 мкг/мл и ярче конъюгированных Флюорофор ГЭР (Alexa Fluor 647) на 1,56 мкг/мл были протестированы присутствии повышения концентрации NAbs положительных управления. (B) Эта панель показывает кривые от группы A графике, используя МФО чтобы показать значительное увеличение в динамический диапазон, используя Alexa Fluor 647-конъюгированных ERT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Метод, описанный является многоуровневый подход для обнаружения, подтверждающие и интерполяции квази количественный уровень NAb титр³. Чтобы установить assay готова для проверки, включая анализа чувствительности, точность, избирательности, специфичность, наркотиков толерантность, устойчивость, параметры и сократить точки должны оцениваться согласно таковыми guidances^1,3 .

Образцы были рассмотрены потенциально позитивные в этот assay, когда были получены значения % SI, больше, чем проверки сократить точки (SCP). ПКПП было установлено статистически путем испытания образцов наркотиков наивно от представителя населения и измерения относительное снижение интенсивности (SI) сигнала³. Руководство (например по FDA) рекомендуем ПКПП устанавливается 95^ой персентили нормально распределенных данных набора, и методы расчета ПКПП были подробно описаны в других местах¹. Любой образец, что уменьшение пробирного сигнал (измеряется как увеличение % SI) или выше ПКПП был полон решимости быть потенциально позитивной и образцы с результаты выше, чем ПКПП (с без изменить или уменьшить в % SI) считается отрицательным.

Проведены испытания образцов, которые показан положительный (% SI выше ПКПП) в подтверждающих assay определить специфику NAbs для ГЭР. Подтверждающих пробирного была выполнена заранее инкубации пробы с конъюгированных ERT магнитные бусы для удаления наркотиков специфические антитела или ингибирующих факторов. RR (соотношение подтверждающего МФО скрининг МФО) оценивали определить количество NAbs удалены из образца. Выше, чем рассчитанные порог позитивность [т.е., подтверждающего точкой разреза (CCP)] указано наличие антинаркотических NAbs RR. Как и отбора пробы следует сначала CCP путем оценки лечения наивно образцы от представителя населения в подтверждающих assay. CCP была основана на статистически определяется показатель ложно положительных 1% и был порог назначение положительно подтвержденных образца (рис. 5)³.

Образцы, которые проверены и подтверждены позитивные были серийно разбавленный и испытаны в титре пробу для определения относительного уровня или титр NAbs в каждом образце. Высокого разрежения, на котором образец положительный, когда он пересек установленного порога [например, титр, сократить точки (TCP)] это образец титр (рис. 5)^1,3.

Рисунок 5: пример результатов тестирования. Эти панели показывают примеры образцов, которые испытаны положительный или отрицательный, скрининг выше или ниже SCP 17.51% SI. Позитивные примеры затем были протестированы в подтверждающих assay, использованием наркотиков конъюгированных магнитные бусы истощать наркотиков специфические антитела от образцов до тестирования в assay. Образцы с коэффициентом восстановления (ОР) больше, чем подтверждающего точкой разреза (т.е., ОР = 1.315) были рассмотрены будет подтверждено положительное. Образцы, которые подтвердили положительные разводили до тех пор, пока сигнал пересекли титр, сократить точки (TCP), чтобы установить титр (коэффициент разрежения), на котором образца результат равен титр сократить точки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Анализ повторяемости и изменчивости были протестированы в течение нескольких дней и с более чем один аналитик. Бок были первоначально подготовлены в одном пакете и суб aliquoted для использования 1 x. В течение 3 d два аналитики выполняется проба с несколькими наборами бок продемонстрировать точность assay. В примере данных показано % CV, Интер - и внутри анализа Анализ точности для бок находятся менее чем FDA руководства рекомендации % CV < 20% (рис. 6)¹.

Рисунок 6: пример КК точности данных, полученных в течение трех дней с двумя аналитиками. Точность данных были рассчитаны путем дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием формулы, представленные в DeSilva et al. ²⁸. интра пакета (работает) и Интер партии (между запусками) статистические данные помечаются как % CV. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Нейтрализующие антитела или других факторов, которые мешают ERT поглощение через CI-M6PR имеют потенциал, чтобы повлиять на безопасность или эффективность ERT¹. Таким образом важно оценить NAbs в образцах субъекта, используя надежную модель отношение к механизм действия препарата. Мы и другие обнаружили, что производительность некоторых биопроб форматов (например, рецептор димеризации, Люцифераза выражения и т.д.) не согласуются с рекомендациями органа здравоохранения для анализа точности, воспроизводимости и чувствительность ²⁹. в методе биопроб, описанный здесь, Jurkat клетки, которые выражают эндогенного CI-M6PR используются для мониторинга NAbs специфичные для лизосомных ERT поглощения. В сочетании с индикация цитометрия потоков, этот assay использует физиологические ячеечная модель с подходящим пробирного точность, чувствительность, воспроизводимость и высокая производительность. Наб обнаружения с потоком цитометрии индикации также был применен к другим показаниям. Например были разработаны методы для выявления существующих антител против гепатита Е и аденоассоциированный вирус (AAV)^30,31.

Важнейшие шаги в протоколе включают в себя выбор подходящего Флюорофор, включающий LQC мониторы анализа чувствительности, обеспечивая достаточный уровень жизнеспособности клеток и поддержание строгого соблюдения инкубации раз. В этом примере, представленные здесь флуорофоров (например, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 и CypHer 5e), конъюгированных лизосомальных ERT, характеризуются значительными различиями в их исполнении. Alexa Fluor 647, который также был ярким Флюорофор испытания³², был выбран для дальнейшего анализа развития. Мы рекомендуем, что несколько флуорофоров оцениваться на ранней стадии в развитии assay предоставлять наилучшую чувствительность и динамический диапазон. Анализ чувствительности во время тестирования образца должно контролироваться включая LQC, это достаточно близко к предел чувствительности, что он будет не в 1% от тестирования работает¹. Вместе с HQC LQC также выступает в качестве системы пригодности КК для мониторинга пробирного дрейфа на протяжении времени³. Оптимальное ячейки жизнеспособности и производительности достигается путем подготовки ячейки банка одноразовые аликвоты и квалификации в новой ячейки банков на основе сопоставимых QC результаты^3,18. Ячейки и инкубации раз конъюгированных Флюорофор наркотиков также центральное значение для последовательного анализа производительности поскольку поглощения наркотиков увеличивается количество времени, которое препарат инкубировали с ячейками. Чтобы свести к минимуму повседневной изменчивость потребления наркотиков, образец данных могут быть нормированы пуле матрица управления образцы на каждой табличке (например, образцы управления точкой разреза в методе выше). Еще одним важным фактором в производстве последовательных данных с помощью этого метода является контролировать пластине равномерности и свести к минимуму возможные эффекты краев. Начальный эксперимент может включать выполнение анализа, с помощью единого КК через целую тарелку, а может быть более надежным эксперименты во время анализа проверки (например, точности и точности)¹. Это свидетельствует о важности макет карты пластина³³. Как показано в примере карта пластины, контроль качества образцов размещены по обе стороны пластины монитора единообразия, которые могут быть отслежены с течением времени с Levey-Дженнингс диаграммы³⁴.

Хотя этот assay контролирует NAbs и другие факторы, которые могут препятствовать лизосомальных ERT поглощения, дополнительные эксперименты могут проводиться для подтверждения ингибитирование поглощение за счет антител. Одним из вариантов является для лечения образцы с белком А/Г/Л, в которой неспецифически связывается иммуноглобулина³⁵. Если образцы продолжают испытывать положительные после протеина A/G/L истощение, тормозящий фактор-антитела могут отвечать за блокирования поглощения наркотиков. Метод, описанный здесь был разработан для измерения ингибитирование антитела опосредованной поглощения и положительный контроль и другие assay который параметры должны быть пересмотрены, если высокий процент тема образцов с ингибирующих факторов-антитела найдены.

Assay может также далее характеризоваться продемонстрировать Флюорофор меченых наркотиков трафика в соответствующие сотовой отделение, на основе механизма действия препарата. Ожидается, что в этом примере, представленные здесь, ERT привязать CI-M6PR на поверхности клеток и трафика его Лизосома. Мы сообщалось ранее результаты нескольких экспериментов, показывая, что почти все из флуоресцентного сигнала, наблюдаемые в результаты метода от Флюорофор меченых ERT Лизосома⁸. Мы обнаружили, что сигнала ГЭР Флюорофор меченых выбыл после лечения клеток с cytochalasin B, который разрушает интернализации через ингибирование актина реорганизации. Кроме того эксперименты, которые закалка с Трипановый синий, или замедление интернализации внешних Флюорофор, поместив клетки на 4 ° C, показывают, что Флюорофор меченых ERT быстро внедрено и очень мало флуоресценции объясняется ERT связаны на поверхности клеток. Лизосомальных ориентации было подтверждено визуализации Сопредседатель локализации рН чувствительных lysotracker краска с конъюгированных Флюорофор наркотиков с помощью конфокальной микроскопии. Специфика поглощения через CI-M6PR может быть также проверена с помощью экзогенных M6P конкурировать с метками препараты для связывания рецептора. Подобные эксперименты следует выполнять для проверки поглощение кинетики и клеточной локализации препаратов конъюгированных Флюорофор в других анализов.

Эта платформа на основе ячеек пробирного был использован для изучения NAbs для лекарственных средств, которые используют CI-M6PR рецептор опосредованный эндоцитоз. Недавно мы сообщили о результатах, с помощью этой платформы пробирного, которая продемонстрировала никакой корреляции между развитием NAb и наркотиков эффективность для elosulfase альфа^36,37. Для проверки assay для клинических образцов, тестирование, параметры, включая анализа чувствительности, точность, избирательности, специфичность, наркотиков толерантность, надежности и сократить пунктов, должны оцениваться согласно установленным guidances^{3, 4}. Следует также отметить, для лизосомных ГЭР, что NAbs может развиться с потенциалом вмешиваться с наркотиками деятельности посредством привязки вблизи фермента каталитического сайта. В целом мы считаем, мониторинг этот тип NAb имеет более низкий приоритет, так как суровых условиях кислой и протеолитических лизосомальных не является благоприятным для антител ERT взаимодействий^2,,3940. Однако вполне возможно, что протеолитических стойкие NAbs существуют и могут препятствовать стимулирующую часть наркотиков⁴⁰. Этот пробирного мониторов Флюорофор меченых ERT поглощения Лизосома, и ограничение анализа является неспособность контролировать протеолитических стойкие NAbs. Если этот тип NAb подозревается, основанные на безопасность или эффективность данных, assay который контролирует деятельность ERT следует разработать и использовать для тестирования образцов.

Оценка иммуногенности имеет важное значение для понимания воздействия NAbs на эффективность и безопасность препарата. Идентификация NAbs способных ингибирования в vitro препарат поглощение через CI-M6PR предоставляет возможность для понимания деятельности NAb в естественных условиях. Представленные здесь метод использует линию клеток человека, которая выражает CI-M6PR для измерения вмешательства конъюгированных Флюорофор лизосомальных ERT клеточного поглощения. Этот метод уже использовался для отслеживания NAbs несколько ГЭР, предназначенные для лечения заболеваний лизосомальных хранения. Эта платформа пробирного могут обращаться другие методы для изучения воздействия NAbs на биологическая терапия которые требуют сотовой интернализации для их правильной работы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,22 & микро; m фильтрующий блок, 500 мл колбы с вакуумным фильтром	Corning	CLS430769
Круглое дно 96-луночные культуральные планшеты	Thermo-Nunclon	163320
Стерильные резервуары для реагентов	VistaLab	3054-1004
96 лунок белый круглое дно полистирольная микропластина	Corning	3605
96-луночные полипропиленовые трубки, 8-луночные полоски	Corning	4408
Магнитный штатив для труб для разделителя шариков	V& P Scientific, Inc	VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3
DynaMag -2 Магнит	Thermo Fisher Scientific	12321D
DynaMag -96 Магнит с боковой юбкой	Thermo Fisher Scientific	12027
BD FACSCanto II Проточный цитометр	BD Biosciences
BD Высокопроизводительный пробоотборник (HTS)	BD Biosciences
BioRad TC20 Автоматический счетчик клеток	BioRad	1450103
Шейкер для микропланшетов	VWR	12620-928
Galaxy MiniStar Микроцентрифуга	VWR	C1413
культура тканей CO2 инкубатор	Nuaire	NU-4750
Шкаф биобезопасности	Labcono	Очиститель Cell Logic +
Jurkat Cell Line	ATCC	TIB152&торговля;
Alexa Fluor 647 Набор для маркировки белка	Thermo Fisher Scientific	A20173
Dynabeads M270 Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	65306
EZ-Link NHS-LC-LC-BIOTIN	Thermo Fisher Scientific	21343
RPMI-1640 1x Medium	Life Technologies	A10491-01-500mL
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	ATCC	30-2020
Pen-Strep (100x) жидкая формула	Corning	30-002-CI
1x DPBS без кальция и магния	Corning	21-031-CV
4% Параформальдегид	Электронная микроскопия Наука	15735-85
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания фиолетовых мертвых клеток, для возбуждения 405 нм	Life Technologies	L34955
Tween 20	Sigma	P1379-100mL
Бычья сыворотка Альбумин	Sigma	3059
Объединенная человеческая матрица (e. человеческая сыворотка или спинномозговая жидкость)	Bioreclamation IVT	запросить цену на веб-сайте
VWR Полиэфирная пластинчатая пленка	VWR	60941
Seal & Образец алюминиевой фольги	Beckman Coulter	538619