Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка сопротивления ингибитора киназы тирозина путем допроса сигнальных путей, антитела массивы

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57779

⸱

19 сентября 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Lawrence J. Ellison Institute for Transformative Medicine, Center for Applied Molecular Medicine, University of Southern California

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для массивов антитела для выявления изменений в сигнальных путей в различных клеточных моделях. Эти изменения вызваны наркотики/гипоксии/ультра-violet свет/излучения, или гиперэкспрессия Даунрегуляция эффект просвечивания, имеют важное значение для различных моделей болезни и может указать ли терапия будет эффективным или можно определить механизмы наркотиков сопротивление.

Аннотация

Онкологических больных с аномальным регулирование сетей фосфорилирование белков часто относятся с ингибитора киназы тирозина. Приближается к 85% респондентов являются общими. К сожалению пациенты часто становятся огнеупорной лечения, изменяя их сигнальных путей. Реализацию профилирования выражение с microarrays можно определить изменения общего уровня мРНК, и протеомики можно определить общие изменения в уровни белка или можно определить белков, участвующих, но деятельность трансдукции сигнала пути может быть создана только путем опрашивания столб-поступательные изменения белков. В результате способность определить ли медикаментозное лечение успешным или возникает сопротивление, или возможность охарактеризовать любые изменения в сигнальных путей, является важной клинической проблемой. Здесь мы предоставляем подробное объяснение антитела массивы как инструмент, который может идентифицировать изменения всей системы в различных столб-поступательные изменения (например, фосфорилирование). Одним из преимуществ использования антитела массивов включает в себя их доступности (массив не требует либо экспертом в области протеомики или дорогостоящего оборудования) и скорость. Основным ограничением является наличие массивов ориентации сочетание столб-поступательные изменения. Кроме того объективные подходы (phosphoproteomics) может быть более подходящим для новых открытий, в то время как антитела массивы идеально подходят для наиболее широко характеризуется целей.

Введение

Клинические осуществление целенаправленных тирозин киназы ингибиторов (тки) превратил лечения рака, предоставляя врачам с эффективными инструментами для специфических белков неопластической трансформации этого диска. Эти соединения тормозить или блокировать фосфорилирование белков, мишенью тирозин киназы1,2. TKIs были разработаны отчасти потому, что генетические изменения в различных ключевых сигнализации гены являются достаточными для начала рака диск и прогрессии [например, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), киназа тирозина протеина протоонкоген Src (SRC), BCR-ABL и человеческого эпидермального фактора роста рецепторов 2 (HER2)]3,4. Влияние TKIs на клеточный цикл5 и молекулярные сигнальные пути6 представляет преобразование от нецелевого для лечения рака молекулярно гидом. Основным преимуществом TKIs против химиотерапии является увеличение ответов и низкий риск токсичности для здоровых клеток7. В результате повышенное внимание на исследования и разработки романа TKIs.

Доступ к результатам геномные последовательности начал с проекта генома человека8,9,10 и продолжается и сегодня с различными следующего поколения (NextGen) рака последовательности усилий [например, геном рака Атлас (TCGA)11,12]. Это вдохновило многих экспериментальных методологий, которые обеспечивают одновременное информацию на тысячи генов и/или обеспечить непредвзятый снимки генов или белки, модулированные биологических возмущений13. Поскольку регулирование клеточной функции происходит на нескольких уровнях, от транскрипцию генов столб-поступательные изменения белков и их деятельности, полного понимания событий, контролируя сотовой функция будет в конечном счете, требуют интеграции данных из различных биологических отсчетов. Возможность контролировать уровни матричная РНК (мРНК) тысячи генов с разрешением одноклеточных гена возросла способность делать выводы о функции гена и взаимодействия в масштабах всего генома. Однако, интерпретации ген выражение массивов всегда будет неизбежно неполным без интеграции других уровней регулирования: а именно, уровнях выражения протеина, государства модификация белков и столб-поступательные белка модификации (фосфорилирование, ubiquitylation, метилирование, и т.д.). Здесь мы описываем полезность антитела массивов в качестве средства допросить столб-поступательные изменения важных сигнальных компонентов в зависимости от различных условий в одном эксперименте14,15, 16.

Массивы фосфо антитела могут быть использованы для отличать и анализировать изменения в пути трансдукции сигнала16. Они могут возникнуть от генетической модификации или лечения клеточных линий с ингибитора киназы, химиотерапевтические, стресса, вызванного голода лишения, гипоксия или сыворотке глюкозы. Примечание, лекарственной устойчивости или конкретный ген вверх - или Даунрегуляция также могут вызвать изменения в пути трансдукции сигнала17.

Лекарственной устойчивости, например, могут возникнуть в результате мутации в наркотиков цель, чтобы избежать чувствительности. В рак легких, известный EGFR мутации визуализации рака невосприимчивы к некоторым TKIs, но более восприимчивы к другим. Альтернатива, сигнальные пути может быть активирован при мутации17. Как более широкое применение для идентификации сигнальных путей участвующих в сопротивление и гипоксии и др.фосфо антитела массивы обеспечивают более глубокое, и понять, следовательно, механизмов участвует.

Технологии, которые позволяют оценить изменения белка являются важным компонентом биологии, потому что они часто служат нормативные функции, такие как модулирует активность фермента или физических взаимодействий между белками. Важность столб-поступательные изменения проиллюстрирована роль фосфорилирование белков в почти всех внеклеточного сработал сигнал трансдукции пути18. Традиционно выявление киназ или статуса фосфорилирование белков может также быть определяется Западный анализ помаркой, особенно если исследователь заинтересован в только 1 – 5 целей. Однако западных помарках очень избирательно и могут быть смещены в сторону предварительного знания и может пропустить важные цели в результате. Антитело массивы обеспечивают средне-пропускная способность считывания нескольких целей путем внедрения различных антител захвата [Пан конкретных фосфорилированных tyrosine(s), анти убиквитин и т.д.] на прочную матрицу (например, стекла или нитроцеллюлозы). Вторичные антитела предоставить информацию о специфических белков в формате на основе сэндвич ELISA (рис. 1). Этот assay становится более мощной и соответствующих как более целей представляют интерес или предварительного знания ограничены15. Фосфо массивы являются более широко трудоспособные, как они могут сравнить фосфорилирование, а также общее количество белка более широкий спектр целей в одном эксперименте и обеспечивают значительно улучшить количественное определение масс-спектрометрии. Этот метод не применяется для выявления новых или ранее неизвестные фосфорилирование сайтов.

Крупномасштабные массы на основе спектрометрии протеомики могут быть использованы для выявления сайты конкретных фосфорилирование белков19. Хотя этот метод может перечислить тысячи столб-поступательные событий, он требует дорогостоящей аппаратуры, посвященный экспериментальных трубопроводов и вычислительные знания, которые являются недоступными для большинства исследователей.

Антитело массивы обеспечивают Одновременная индикация показаний различных белков16. Это могут быть изменения в ubiquitylation белка (убиквитин массива) или фосфорилирования. Ключевым преимуществом этой технологии массив является, что она обеспечивает важную обратную связь на биологическое состояние различных биологических пути, связанные с параметрами важные ячейки (протеин 53 кДа, p53, рецепторов тирозин киназы и внутриклеточных пути) одновременно. Кроме того можно комбинировать различные типы массивов увеличить проникновение assay (например, апоптоз и убиквитин и фосфорилирование). Эта способность объединять несколько массивов для оценки различных столб-поступательные изменения в нескольких пробах одновременно в времени и экономичным способом, который не требует конкретных приборов или экспертизы имеет значительное преимущество в случае антитело массивов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. белки добыча

  1. Пластина 5 х 106 клеток на 10 мм культуры ткани пластины (или настой) в культуре ткани капюшоном. Подсчитать ячейки в то время обшивки с счетчик автоматическое клеток или Горяева. Кроме того оцените число ячеек.
  2. Промойте клетки, выращенных на 10 мм пластины (или настой) тщательно 3 x с 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) (рН = 7,4). Убедитесь в том удалить все PBS перед добавлением буфера lysis.
    Примечание: Литического буфера обычно предоставляется с комплектом. Если нет, воспользуйтесь буфером пробирного radioimmunoprecipitation (RIPA) или любой другой буфер lysis клетки содержащий коктейль ингибиторов протеаз и фосфатазы.
  3. Лизируйте 1 x 107 кл/мл в буфере lysis клеток, добавив нужное количество буфера в клетки и соскоб клеток с скребок ячейки в буфер lysis. (например, для НеЬа клетки и MiaPaCa-2, используйте 600 мкл на 10 см пластины).
  4. Пипетка lysate вверх и вниз (приблизительно 10 x) и передать его на новой 1,5 мл трубки.
  5. Инкубируйте лизатов 30 мин при 4 ° C, предпочтительно на Рокер/шейкер. Нажмите lysate через шприц с иглой 27 G для 10 x для обеспечения надлежащего нарушение cell membrane(s). Кроме того sonicate лизатных. Хранить лизатов при-20 ° C, или использовать их немедленно.
  6. Центрифуга lysate в 14.000 x g при 4 ° C на 15 мин и передачи супернатант чистой 1,5 мл.
  7. Quantitate количество общего белка bicinchoninic кислоты пробирного (BCA)20 или эквивалент Лоури или Брэдфорд и продолжать по меньшей мере 50 – 400 мкг. Использование белков немедленно или Алиготе и замораживания/хранить их при-70 ° C (Избегайте несколько циклов замораживания оттаивания).

2. человека Phosphokinase массив

  1. Довести все реагенты до комнатной температуры перед началом (для примерно 1 час).
    Примечание: Все реагенты и пластиковые износ включены в комплект.
  2. Подготовить все свежие реагенты (массив буферов) до начала процедуры после инструкции производителя (в зависимости от выбора целей/массивов, инструкции могут незначительно отличаться).
  3. Воссоздания обнаружения антител коктейли в 100 мкл деионизованной воды или следовать инструкциям производителя должны они отличаются для 1.5 мл пробирка предусмотрено.
  4. Подготовить 1 x мыть буфера путем разбавления 40 мл 25 x мыть буфера в 960 мл деионизированной воды и смешайте их переворачивать.
    Примечание: Кристаллы растворяют при комнатной температуре. Буфер может желтеют со временем, но все равно будет работать.
  5. Пипетка 1 мл буфера 1 массив в каждой скважине 8-Ну мульти лоток (или 2 мл в нескольких лоток 4-ну).
  6. С плоским наконечник пинцеты удалить массив мембраны между защитные листы и поместите их в скважинах. Убедитесь, что цифры на мембране обращены вверх.
    Примечание: После погружения, исчезнут красителя на мембране.
  7. Обложка лоток с крышкой и инкубировать на качающейся платформе шейкер для 60 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Это мембрана блокировки шаг.
  8. Инкубационный период подготовьте образцы протеина. Добавьте 50 – 100 мкг общего белка. Разбавьте lysate, имеющий максимальный объем 334 мкл, с буфера lysis окончательный объемом 1 мл.
    Примечание: 50-100 мкг общего белка обычно достаточно.
  9. Аспирационная буфер массива 1 тщательно и инкубации мембран с 1 мл образцов ночлег в 2-8 ° C на качалки платформе шейкера.
    Примечание: Не сенсорный/нуля мембраны.
  10. Следующий день, промойте массив тщательно удалив каждый массив и поместив его в индивидуальные пластиковые контейнеры (примерно 8 x 11 см2) 20 мл 1 x мыть буфера. Вымойте мембраны 3 x 10 мин на качающейся платформе в 1 x отмывающего буфера при комнатной температуре.
  11. Пипетка 20 мкл восстановленный антитела коктейль от 2.3 до 1 мл 1 x буфер массива 2 шаг. Добавьте 1 мл этого раствора в каждый 8-Ну использоваться.
  12. Осторожно удалите мембраны из лотков мыть. Пятно нижнего края на бумажные полотенца для удаления любой избыток мыть буфер и перенести их обратно в лоток, содержащий антитела коктейли. Обложка лоток с крышкой и проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре на качающейся платформе. Тщательно промойте используемые поддоны с dH2O и высушите их для последующего использования.
  13. Тщательно удалите каждый массив и поместите их обратно в чистые индивидуальные пластиковые контейнеры (примерно 8 x 11 см2) с 20 мл 1 x мыть буфера. Мойте их 3 x 10 мин с буфером мыть на качающейся платформе при комнатной температуре.
  14. Разбавьте стрептавидина-ПХ (прилагаются в комплекте) или 1:1,000 стрептавидина Люминесцентная краска (для более количественного обнаружения) в 1 x буфера массив 2 в 15 мл пробирку.
  15. Вернуть мембраны в 8-Ну блюда, содержащие решения HP и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре на качающейся платформе (если использование флюоресценции, оберните лоток в алюминиевой фольгой, чтобы избежать любой освещенности).
  16. Удалите избыток буфера, поместив мембрану между 2 шт 5 мм 3 M бумаги. Для изображений с рентгеновской пленки/хемилюминесцентный тепловизор, инкубировать сушеные мембраны с решением обнаружения HRP (смесь двух хемилюминесцентный решения 1:1) 3 мин и мембраны в прозрачных пластиковых листов протектор.
    Примечание: Сушеные membrane(s) также могут быть помещены в флуоресцентные тепловизор для выявления флуоресцентного сигнала; сведения к минимуму воздействия света мембраны перед изображений. Для количественной оценки рентгеновской пленки или тепловизор файлов Избегайте передержки. Большинство хемилюминесцентный/флуоресцентный тепловизоры имеют функцию, чтобы избежать насыщения сигнала.

3. анализ данных

  1. Скачать ImageJ, программа21, обработки изображений и установить программное обеспечение.
  2. ImageJ открыть, дважды щелкнув «ImageJ значок». Выберите изображение для анализа, нажав кнопку «Файл» в меню, затем выберите «Открыть» из раскрывающегося меню и просматривать файлы компьютера для изображения интерес. Щелкните файл, чтобы открыть его.
  3. Инвертируйте изображение для анализа (черные пятна на белом фоне с белыми пятнами на черном фоне), нажав кнопку «Редактировать» в строке меню и выбрав «Инвертировать» из раскрывающегося меню.
  4. Выберите значок «овал» на панели инструментов (второй параметр в панели инструментов ImageJ). Нарисуйте круг/овал, нажав на картинку (черный крест) и перемещения мыши. Отрегулируйте размер/форму круга/овальные окружить точек на дот-блот.
  5. Нажмите кнопку «Анализировать» в строке меню и затем выберите «Мера» из раскрывающегося меню, чтобы автоматически открыть новое окно со значениями выбранной области (области, среднее, минимум и максимум).
  6. Переместить круговой области путем перетаскивания круг из центра (поставить точку стрелка вправо в середине) и поместите его вокруг области следующего измерения (точка). Мера всех мест интереса, положительный контроль, отрицательный контроль и фон для анализа.
    Примечание: Отрицательный контроль является PBS, фон является частью мембрана без каких-либо пятна (любой части будет делать), и позитивным является элементом управления, предоставляемых производителем.
  7. Выберите PBS отрицательный контроль пятна и вычесть значение из каждого места. Средняя интенсивность для каждой пары дубликатов пятна, представляющие каждый рецептор тирозинкиназы (РТК). Каждый средней интенсивности могут быть связаны с элементом управления для расчета изменения раза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы исследовать эффект тки сопротивления на сигнальных путей в клеточных линий, были проанализированы четыре образца. Один контрольный образец (H3255r1) и 3 тки устойчивые клеточные линии (H3255r2-4) (рис. 2) были связаны с пятно антитела шаблон (рис. 3). Все 4 образцы были подготовлены с использованием этого протокола. Шесть фосфолипопротеиновый с дифференциальной деятельности были выбраны для демонстрации анализа антител масс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Подходы, которые сочетают в себе многие биологические показаний являются по своей природе более точные представления клеточными эксперимента осуществляется в. Появление фосфо антитела массивов позволяет быстрое характеристика шаблон изменения, которые могут быть более информативным, чем статус изменения любого одного белка. Общий рабочий процесс для применения фосфо антитела массивов основан на изменения в Серин, треонина и тирозина. В этом примере сосредоточена на характеризующих изменения, связанные с устойчивостью к т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы признательны за щедрую финансовую поддержку из Лоуренс J. Эллисон института трансформативных медицины ОСК (подарок Дэвид Агус). Мы ценим поддержку осень Бумер и Лиза Flashner, которые приводят к генерации и публикации этой рукописи. Мы благодарим Лаура нг за ее административной поддержки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Odysee SA ImagerLi-Cor BiosciencesФлуоресцентный имиджер
1,5 мл TubeEppendorf22363212
Скребокдля клеток Falkon (Corning)353085
Dulbeco's Phosphate Buffered (PBS)Corning21-031-CVпромывочный буфер для экстракции белка
Чашка для культуры тканей 100 ммTRP93100
ICC Инсулиновый шприц U100Becton Dickinson32941227 G5/8,  1 мл для игольчатой обработки белковых образцов
Protein Profiler ARRAY НИР DARY003Bчеловеческого фосфо MAPK Array
ARRAY НИР DARY002BМатрица фосфокиназы человека
Центрифуга Eppendorf 5430REppendorfНастольная центрифуга
Набор для анализа белка BCA Pierce ThermoFisher23225
SpectraMAX M2Molecular DevicesАбсорбционный считыватель для количественного определения белка
IRDye 800CW StreptavidinLi-Cor Biosciences925-32230Стрептавидиновый конъюгат для обнаружения флуоресценции
LabGard ES Class II, Type A2 шкаф биобезопасностиNuAireNU-425-400Капюшон для культуры тканей
TC20 автоматизированный счетчик клетокBio-Rad1450102Счетчик клеток
Halt Protease & Коктейль ингибитора фосфатазы (100x)Thermo Fisher78446
RIPA буферSigmaR0278
Sonic DismembratorFisher ScientificF60sonicator
Качающаяся платформа шейкерVWR10860-780
ImageJNIH открытый исходный кодhttps://imagej.net/Welcome
SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-разрядная версия)Майкрософт
Профилировщик белка

Ссылки

  1. Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
  2. Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
  3. Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
  4. Maguire, H. C., Greene, M. I. The neu (c-erbB-2) oncogene. Seminars in Oncology. 16 (2), 148-155 (1989).
  5. Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
  6. Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
  7. Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
  8. Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
  9. Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103(1988).
  10. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  11. McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
  12. Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  13. Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
  14. Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
  15. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
  16. Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
  17. Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
  18. Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
  19. Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
  20. Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
  21. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  22. Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
  23. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  24. Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
  25. Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
  26. McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Анализ фосфорилированияпосттрансляционные модификациирезистентность к ракуподготовка лизата белковинкубация мембранпротокол промывочного буфераанализ обработки изображений
Оценка сопротивления ингибитора киназы тирозина путем допроса сигнальных путей, антитела массивы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.