Анализ одной ячейки иммунофенотип и производство цитокинов в периферической крови в целом через массовые цитометрии

Summary

Здесь мы описываем одноклеточных proteomic подход к оценке иммунной фенотипических и функциональных (внутриклеточных цитокинов индукции) изменения в периферической крови в целом проб, анализируется через массовые цитометрии.

Abstract

Цитокины играют ключевую роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Таким образом измерение уровни цитокина был в центре внимания многочисленных исследований в попытке понять, четкие механизмы, которые приводят к распаду self-tolerance и последующих аутоиммунных заболеваний. Подходы до настоящего времени были основаны на изучении одного конкретного аспекта иммунной системы (один или несколько типов клеток или цитокинов) и не предложить глобальной оценки сложных аутоиммунных заболеваний. В то время как пациента на основе сыворотки исследования предоставили важные идеи в аутоиммунных заболеваний, они не источником конкретных клеточных цитокинов dysregulated обнаружено. Всеобъемлющий подход одной ячейки для оценки производство цитокинов в нескольких подмножеств иммунных клеток, в контексте «встроенных» пациент конкретных плазмы, циркулирующих факторы, описано здесь. Этот подход позволяет осуществлять мониторинг пациента специфические иммунные фенотип (поверхностных маркеров) и функции (цитокинов), либо в своей родной «внутренних патогенных «болезни штата, или в присутствии терапевтических агентов (в естественных условиях или ex vivo).

Introduction

Аутоиммунные заболевания являются одной из основных причин заболеваемости и смертности, влияющих на 3-8% населения. В Соединенных Штатах, аутоиммунные заболевания являются одной из ведущих причин смерти среди женщин молодого и среднего возраста (возраст < 65 лет)^1,2. Аутоиммунные расстройства характеризуются гетерогенных клинической картины и различных базовых иммунологических процессов. Спектр гетерогенности хорошо представлены на различных расстройств, таких как совместное участие в ревматоидный артрит (РА) и неврологические заболевания в рассеянным склерозом (MS). Однако, этот уровень гетерогенности проявля....

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены в Колорадо несколько институционального обзора Совет (COMIRB) из университета Колорадо. Все описанные ниже процедуры должны выполняться в стерильных культуры ткани капюшоном, если не указано иное, с отфильтрованной наконечники, и фильтровать все реагенты.

1. Подготовка реагентов для обработки периферийных цельной крови

1. Подготовка ruxolitinib запасов аликвоты (10 – 15 мкл/флакон для одноместного размещения) на 10 мм путем разбавления лиофилизированные реагента в ДМСО в соответствии с инструкциями производителя (магазин-80 ° c). Держите концентрации ДМСО в всех анализов, включая кератоз конт....

Results

Рисунок 1 демонстрирует процесс для стимуляции и обработки образцов периферической крови, включая выделение крови образца аликвоты, сроки добавлением стимуляции агентов, белок транспорт ингибитор коктейль и инкубации времен до Лизис эритроцитов (РБК) и фиксации. Выбор стимулирования агентов будет зависеть от сигнализации и цитокина пути, которые предназначены для оценки. Например в протоколе, описанные здесь, агонисты TLR используются для оценки врожденные им.......

Discussion

Здесь мы описываем, Роман, одноклеточных, proteomic подход к одновременно оценить несколько типов иммунных клеток и обнаружить их различных цитокинов возмущений в окружении пациента «патогенных» периферийные плазмы крови циркулирующей факторов. Этот метод использует периферической крови в целом в качестве аналитической транспортное средство и массового цитометрии как инструмент для оценки иммунных сотовой фенотипических и функциональных нарушений. Метод легко применяется к мышей и человека исследования^2.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Руксолитиниб	Santa Cruz	SC-364729A	Stock Conc: 10 мМ; Итоговый конк: 5 μ M
R848	Invivogen	tlrl-R848-5	Стоковый конц: 1 μ g/μ L; Итоговая конуссия: 1 μ g/ml
lps-ek	Invivogen	tlrl-eklps	Stock Conc: 1 μ g/μ L; Итоговая конуссия: 0,1 μ г/мл
стерильный PBS	Lonza	17-516F
Lyse/Fix Buffer	BD Biosciences	558049	Stock Conc: 5X; Окончательный конц: 1X (разбавлен в ddH2O)
BD Фосфлоу для перма/промывки буфер I	BD бионауки	557885	Стоковый конц: 10X; Конечная конусность: 1:10 (разбавленный в ddH2O)
RPMI	Gibco	21870-076
Азид натрия (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Стоковая конуссия: >99,9%; Окончательный конек: 0,0002
Ингибитор транспорта белка (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	Стоковый конц: 500X; Окончательный конц: 1X
интеркалятор ДНК	Fluidigm	201192B	Стоковый конц: 500 μ M; Итоговая конуссия: 0,1 μ
M Cell Staining Media (CSM)			PBS + 0,5% BSA, 0,02% NaN3
MaxPar Штрих-код Perm Buffer	Fluidigm	201057	Stock Conc: 10X; Окончательный конц: 1X
20-plex Pd Barcode Set	Fluidigm	S0014	Stock Conc: н/д; Окончательный конц: н/д
эквалайзер TM четырехэлементные калибровочные бусины	Fluidigm	201078	стоковый конц: 10X; Окончательный конц: 1X
16% раствор формальдегида без MeOH	Thermo	28908	Стоковый конц: 16% (мас./об.); Конечный конц: 1,6% (по объему)
Стерильные полистирольные трубки с круглым дном	VWR	60818-496	Исходный конц: н/д; Окончательный конц: н/д
Полипропиленовые кластерные трубки	Light Labs	A-9001	Stock Conc: н/д; Окончательный результат: н/а
Гелиос CyTOF прибор	Fluidigm	Helios	Все растворы, используемые в анализе CyTOF, должны быть свободны от металлических загрязнений. ddH2O используется при приготовлении любых растворов, которые должны иметь удельное сопротивление не менее 18,0 MΩ. ddH2O и любые самостоятельно приготовленные растворы следует хранить в новых пластиковых или стеклянных бутылках, которые никогда не подвергались автоклавированию.
Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
Антитела, используемые для массовой цитометрии>
Поверхностные маркеры
CD1c	Biolegend	L161	Масса: 161
CD3	BD	UCHT1	Масса: 144
CD4	Biolegend	SK3	Масса: 174
CD7	BD	M-T701	Масса: 149
CD8	Biolegend	SK1	Масса: 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Масса: 209
CD11c	BD	B-ly6	Масса: 152
CD15	BD	HI98	Масса: 115
CD14	Biolegend	M5E2	Масса: 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Масса: 165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	Масса: 163
CD21	Biolegend	Bu32	Масса: 141
CD27	BD	L128	Масса: 155
CD38	Fluidigm	HIT2	Масса: 172
CD45 всего	Biolegend	HI30	Масса: 89
CD45RA	Biolegend	HI100	Масса: 153
CD56	Miltenyi	REA196	Масса: 168
CD66	BD	B1.1/CD66	Масса: 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Масса: 150
CD123	Fluidigm	6H6	Масса: 143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	Масса: 156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	Масса: 162
IgD	Biolegend	IA6-2	Масса: 146
IgM	Biolegend	MHM-88	Масса: 151
CXCR5	BD	RF8B2	Масса: 173
HLADR	Biolegend	L243	Масса: 167
<сильные>цитокины
Ил-1&альфа;	Biolegend	364-3B3-14	Масса: 147
ИЛ-1&бета;	Биолегенда	H1b-98	Масса: 169
ИЛ-1RA	Санта-Круз	AS17	Масса: 157
ИЛ-6 Biolegend		MQ2-13A5	Масса: 164
IL-8	BD	E8N1	Масса: 160
IL-12/IL-23p40	Biolegend	C8.6	Масса: 171
Ил-17А	Биолегенда	BL168	Масса: 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Масса: 176
MIP1β	BD	D21-1351	Масса: 158
MCP1	BD	5D3-F7	Масса: 170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	Масса: 175
ИФН&гамма;	Биолегенда	4S. B3	Масса: 165
PTEN	BD	A2B1	Масса: 159
TNF&альфа;	Biolegend	Mab11	Масса: 166
Note: Если производитель указан как Fluidigm, это антитело было приобретено у Fluidigm с предварительно конъюгированным металлом. Если производитель указан как отличный от Fluidigm, то это антитело было самоконъюгировано с использованием MaxPar Multi-Metal Labeling  Комплект (Fluidigm Cat: 201300) в соответствии с протоколом производителя.