Методическая статья

Анализ одной ячейки иммунофенотип и производство цитокинов в периферической крови в целом через массовые цитометрии

DOI:

10.3791/57780

⸱

26 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем одноклеточных proteomic подход к оценке иммунной фенотипических и функциональных (внутриклеточных цитокинов индукции) изменения в периферической крови в целом проб, анализируется через массовые цитометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цитокины играют ключевую роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Таким образом измерение уровни цитокина был в центре внимания многочисленных исследований в попытке понять, четкие механизмы, которые приводят к распаду self-tolerance и последующих аутоиммунных заболеваний. Подходы до настоящего времени были основаны на изучении одного конкретного аспекта иммунной системы (один или несколько типов клеток или цитокинов) и не предложить глобальной оценки сложных аутоиммунных заболеваний. В то время как пациента на основе сыворотки исследования предоставили важные идеи в аутоиммунных заболеваний, они не источником конкретных клеточных цитокинов dysregulated обнаружено. Всеобъемлющий подход одной ячейки для оценки производство цитокинов в нескольких подмножеств иммунных клеток, в контексте «встроенных» пациент конкретных плазмы, циркулирующих факторы, описано здесь. Этот подход позволяет осуществлять мониторинг пациента специфические иммунные фенотип (поверхностных маркеров) и функции (цитокинов), либо в своей родной «внутренних патогенных «болезни штата, или в присутствии терапевтических агентов (в естественных условиях или ex vivo).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутоиммунные заболевания являются одной из основных причин заболеваемости и смертности, влияющих на 3-8% населения. В Соединенных Штатах, аутоиммунные заболевания являются одной из ведущих причин смерти среди женщин молодого и среднего возраста (возраст < 65 лет)1,2. Аутоиммунные расстройства характеризуются гетерогенных клинической картины и различных базовых иммунологических процессов. Спектр гетерогенности хорошо представлены на различных расстройств, таких как совместное участие в ревматоидный артрит (РА) и неврологические заболевания в рассеянным склерозом (MS). Однако, этот уровень гетерогенности проявляется также в пределах одной расстройства, такие как системная красная волчанка (СКВ): у некоторых больных может представлять с почечной патологией, в то время как другие страдают от гематологические или совместного участия3.

Основные иммунопатогенезе аутоиммунных расстройств зеркала клиническая неоднородность, с участием авто - и гипер активации нескольких подмножеств врожденного и адаптивного иммунных клеток, и сопутствующих dysregulated цитокина производства. В то время как цитокинов играют ключевую роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, понимание их конкретная роль в механизме заболевания оказалась сложной. Цитокины характеризуются Плейотропия (один цитокинов может иметь несколько эффектов на различных типов клеток), избыточности (несколько цитокины могут иметь тот же эффект), двойственность (один цитокинов может иметь про - или анти - противовоспалительное воздействие в различных условиях), и пластичности (цитокинов можно формовать в роль отличается от его «оригинал», в зависимости от окружающей среды)4,5,6. Следовательно уровень населения методы не может различать гетерогенных клеточных реакций на же «цитокинового окружение». Аналогично, исследование образцов, которые сосредоточены на одном конкретном аспекте иммунной системы (типа одну ячейку или цитокинов), не предлагают глобальной оценки всех элементов, участвующих в сложных аутоиммунных заболеваний. В то время как пациента на основе сыворотки исследования предоставили важные идеи в аутоиммунных заболеваний, они не источником конкретных клеточных цитокинов dysregulated обнаружено.

Недавно мы разработали одноклеточных proteomic подход к одновременно оценить несколько типов иммунных клеток и обнаружить их различных цитокинов возмущений в окружении пациента «патогенных» периферийные плазмы крови циркулирующей факторов. Рабочий процесс описан здесь характеризуется использованием образцов нетронутыми периферической крови в целом, в отличие от изолированных периферической крови мононуклеаров (получения). Периферической крови в целом представляет собой наиболее физиологически соответствующих транспортных средств для изучения системных заболеваний иммунной системы, включая 1) не мононуклеарных клеток крови часто участвующих в аутоиммунных заболеваний (то есть, нейтрофилов, тромбоцитов) и 2) плазмы циркулирующих факторы, такие как нуклеиновые кислоты, иммунных комплексов и цитокинов, которые имеют иммунной активации роли. Для захвата «встроенные патогенных «dysregulated цитокина производства, периферической крови, образцы обрабатываются сразу же после ничьей крови (T0, время ноль) и через 6 ч инкубации при 37 ° C (температура тела физиологических) с транспортом белка ингибитор в отсутствие каких-либо экзогенных стимулирования состояния (T6, время 6 ч), обнаружить цитокина производства (накопление, T6-T0), который будет отражать состояние «встроенных» болезнь (рис. 1). Для изучения dysregulated процессы, которые отражают над или под активации сигнальные пути, участвующих в иммунной реакции, отношение к болезни, образцы периферической крови лечение (6 ч инкубации при 37 ° C с ингибитор транспортного белка) с внешними стимулирование условие, которое отражает патогенез болезни, такие как агонисты Toll-как-рецептор (TLR) в случае СКВ (T6 + R848, время 6 часов с 1 мкг/мл R848), для обнаружения цитокина производства, который отражал бы ответ на нуклеиновые кислоты (сравнение T0 против T6 против T6 + R848, рис. 1). Для изучения иммуномодулирующие эффекты доступны терапии ex vivo, как они относятся к точной иммунной dysregulated процессов для конкретных пациентов, образцы периферической крови лечатся ингибитор Як на соответствующих терапевтических концентрация (здесь, 5 мкм ruxolitinib; T6 + 5R, время 6 h 5 мкм ruxolitinib), чтобы обнаружить изменения в состоянии «встроенных» болезнь в ответ наркотиков (T0 против T6 против T6 + 5R, рис. 1). Ингибитор Як был выбран для этого исследования, потому что JAK ингибиторов было показано, чтобы быть успешным в лечении аутоиммунных расстройств, таких как РА.

Одновременно оценить процессы dysregulated, описанные выше в нескольких подмножеств иммунных клеток, образцы периферической крови от СКВ больных и здоровых элементов управления были обработаны как описано выше и проанализированы массового цитометрии. Массовые цитометрии, также известный как цитометрии-время-из-полет, предлагает одноклеточных анализ более чем 40 параметров без вопросов спектральных перекрываются7,8,9. Этот метод использует редкоземельных металлов изотопов в виде растворимых ионов металлов как теги, обязан антител, вместо флуорофоров10. Дополнительные подробности относительно массового цитометрии технологической платформы (то есть, тюнинг и калибровки, приобретение образца) можно найти в Leipold et al. и Маккарти и др. 11 , 12 высокой размерность массового цитометрии позволяет одновременное измерение нескольких цитокинов всей подмножеств врожденного и адаптивного иммунных клеток с одной ячейкой детализации (Таблица материалов).

Текущий обычных клинических и лабораторных параметров часто не чувствительной или достаточно конкретными для обнаружения текущей болезни активности или ответ на конкретные иммуномодуляторы13, отражающие необходимость лучше очертить основные иммунной изменения, которые привод вспышки. Учитывая распространенность цитокиновой регуляции в аутоиммунных заболеваний, имеют множество подходов к лечению, которые используют антитела или небольшой молекулярной ингибиторы ориентации цитокинов или сигнализации белков, участвует в регуляции цитокиновой продукции Недавно появились. В своей основной формат периферической крови аналитический подход, описанный здесь обеспечивает платформу для определения подмножества клеток пациента специфических dysregulated и их аномальные цитокина производства в аутоиммунных заболеваний с системными проявлениями. Эта методология позволяет для персонализации терапевтического выбора конкретных dysregulated цитокины могут быть определены, а специфическое лечение, варианты могут быть испытаны ex vivo для оценки их способности Миллиметроволновая пациента конкретных болезней процесс.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь были одобрены в Колорадо несколько институционального обзора Совет (COMIRB) из университета Колорадо. Все описанные ниже процедуры должны выполняться в стерильных культуры ткани капюшоном, если не указано иное, с отфильтрованной наконечники, и фильтровать все реагенты.

1. Подготовка реагентов для обработки периферийных цельной крови

  1. Подготовка ruxolitinib запасов аликвоты (10 – 15 мкл/флакон для одноместного размещения) на 10 мм путем разбавления лиофилизированные реагента в ДМСО в соответствии с инструкциями производителя (магазин-80 ° c). Держите концентрации ДМСО в всех анализов, включая кератоз контроль ниже 0,2% (vol/vol).
  2. Подготовка R848 запасов аликвоты (10 – 15 мкл/флакон для одноместного размещения) (resiquimod) на 1 мкг/мкл путем разбавления лиофилизированные реагента в стерильной воде как в инструкции производителя. Хранить при температуре-80 ° C.
  3. Подготовьте липополисахарида (LPS) акций аликвоты (5 мкл на флакон для одноразового использования только) на 1 мкг/мкл путем разбавления лиофилизированные реагента в стерильной воде в соответствии с инструкциями производителя. Хранить при температуре-80 ° C.
  4. Подготовка клетки пятнать СМИ (CSM) с помощью PBS, 0,5% BSA и 0,02% НАН3.
  5. Приобретать и хранить готовый коктейль ингибитора (ПТО) транспортного белка (Таблица материалов).
  6. Размораживание и разбавленных ruxolitinib запасов флакона (10 мм) 1:10 в стерильных PBS (1 мм). Отложите в культуре ткани капюшоном при комнатной температуре.
  7. Размораживание и разбавленных R848 запасов флакона (1 мкг/мкл) 1:10 в стерильных PBS (0,1 мкг/мкл). Отложите в культуре ткани капюшоном при комнатной температуре.
  8. Оттепель и разбавить 1: 100 (1 мкг/мкл) запасов флакон LPS в стерильных PBS (0,01 мкг/мкл). Отложите в культуре ткани капюшоном при комнатной температуре.
  9. Предварительно теплые стерильные RPMI (не L-глютамин) в водяной бане стандартной 37 ° C (для по крайней мере 10 мин).
  10. Разбавьте lyse Фикс буфер 1:5 в отфильтрованных ddH2O (Рабочая концентрация) на benchtop (не нужно быть стерильными).
    Примечание: 1 мл цельной крови требует 20 мл рабочей концентрации лизируют Фикс буфера.
    1. Сделайте буфер лизируют Фикс для 5 условий 1 мл цельной крови каждый (по крайней мере 100 мл). Аликвота 20 мл рабочей концентрации lyse Фикс буфера в 50 мл конические трубы на миллилитр цельной крови (держать lyse/решения при 37 ° C, пока они не понадобятся). Обозначить условия на конической пробирки, содержащие буфера лизируют/исправить следующим образом: T0 T6 (время ноль), + 5R (время 6 h 5 мкм ruxolitinib) T6 + R848 (время 6 h с 1 мкг/мл R848), T6 + ПЛАСТИНОК (время 6 h с ПЛАСТИНОК 0,1 мкг/мл), T6 (время 6 h).
  11. Лейбл раунд 1 мл microcentrifuge трубы с той же номенклатуры как шаг 1.10 и нижней стерильные полистирола труб колпачками.

2. стимуляция и обработка периферической крови в целом (рис. 1)

  1. Место помечены вокруг нижней полистирола трубы от шага 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) на стойку.
    Примечание: Все следующие шаги выполняются в этот тип трубки, если не указано иное. Крышка трубки при передаче между культуры ткани капот и инкубатор для поддержания стерильности.
  2. Добавьте 1 mL 37 ° C RPMI (не L-глютамин) для каждой из трубок (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Инвертировать пробирка несколько раз, добавьте 1 мл цельной крови к каждой пробке и Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы тщательно перемешать с RPMI (разрежения с RPMI предотвращает слипания крови в инкубационный период 6 h).
  3. Добавить 10 мкл 1:10 ruxolitinib T6 + 5R. Тщательно перемешать с P1000 пипетки. Установите решетку труб в инкубаторе при 37 ° C и начать сроки инкубации (T = 0).
  4. Процесс T0 пример следующим образом.
    1. Пипетка все содержимое трубки T0 в обозначенные конические трубка, содержащая 20 мл 37 ° C Рабочая концентрация лизируют Фикс буфера. Для оптимизации восстановления клеток, Промойте трубку с рабочей концентрации лизируют Фикс буфера. Смешайте инвертирование Конические трубки.
    2. Инкубируйте при 37 ° C 15 мин для лизиса и фиксации. После фиксации выполняют все последующие шаги на benchtop. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин при комнатной температуре.
    3. Декант супернатант. Ресуспензируйте клеток в 1 мл холодного льда PBS с распадаются гранулы, а затем заполнить коническая на том 15 мл с PBS.
    4. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин при комнатной температуре. Декант супернатант. Если гранулы являются красный, повторите PBS мыть (шаги 2.4.3–2.4.4). Ресуспензируйте клеток в 1 мл CSM разрушить гранулы, а затем передать помечены microcentrifuge трубки (шаг 1.11) для пятнать антитела. Возьмите 10 мкл пример подсчитать ячейки, используя счетчик автоматизированных клеток или Горяева.
      Примечание: Поскольку все клетки являются фиксированными на данный момент, нет необходимости включать жизнеспособности пятно.
    5. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная супернатанта, оставляя гранулы в ~ 60 мкл остаточного объема. Держите этот гранул на льду до завершения обработки образцов из других условий.
  5. При T = 30 мин, перемещения трубы стойки (шаг 2.3) на культуре ткани капот и выполните следующие действия.
    1. Добавить 10 мкл 0,1 мкг/мкл R848 T6 + R848. Тщательно перемешать с P1000 пипетки.
    2. Добавьте 10 мкл 0,01 мкг/мкл LPS T6 + ПЛАСТИНОК. Тщательно перемешать с P1000 пипетки.
    3. Добавьте 4 мкл ингибитора транспортных белков (запасов на 500 X) T6, T6 + 5R и T6 + ПЛАСТИНОК (но не T6 + R848) и возвращение образцов для инкубатора до T = 6 х. смесь тщательно с пипеткой P1000 каждые 2 ч.
      Примечание: R848 является эндоплазматического TLR агониста и поэтому требует временной задержки в добавлением ингибитора транспортного белка для получения доступа к своей целевой рецептора.
  6. При T = 2 h, добавить 4 мкл ингибитора белков транспорт коктейль (запасов на 500 X) T6 + R848 трубки. Смешайте все образцы с пипеткой P1000 и вернуть инкубатора стойки до T = 6 h.
  7. Смешать образцы с P1000 еще один раз при T = 4 h.
  8. T = 6 часов, обрабатывать T6, T6 + LPS, T6 + R848 и T6 + 5R крови пробоотборные трубки, как описано в разделе Шаг 2.4 для образца T0.
  9. Храните клетки окатышей в остаточный объем CSM-80 ° C для обработки на будущую дату. Кроме того приступить к штрихового кодирования и антитело пятная без сохранения.

3. штрих лизированы/фиксированные клетки крови

  1. Оттепель образцы клетки лизированы/фиксированные от-80 ° C хранения медленно на льду; максимум 20 образцов могут быть помечены с уникальным штрих-кодов и объединить с использованием этой системы. Разбавить 10 X barcoding Пермь буфер 1:10 с PBS; Сделайте достаточно буфера для ~ 3 мл на сэмпл.
  2. Заполните один нестерильные корыто с CSM и один с 1 X barcoding Пермь буфера. Добавьте 1 mL лед холодной CSM для свежей талой образцы, тщательно перемешать с пипеткой и передать соответствующие предварительно помечены полипропиленовые кластера трубы.
  3. Возьмите 10 мкл пример подсчитать ячейки, используя счетчик автоматизированных клеток или Горяева. Нормализовать клеток до 1,5 – 2 x 106 клеток на сэмпл в каждой тюбике кластера: снимите и выбросьте объем избыточного клеток выше 2 x 106 клеток.
  4. Центрифуга клетки на 600 g x 5 мин при комнатной температуре. Ресуспензируйте клеток в 1 мл раствора 1 X barcoding Пермь буфера с многоканальные пипетки и центрифуги на 600 x g 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная покинуть супернатант.
  5. Выстроить кластера трубы на стойке в том же порядке, как указано на штрих-код ключа, так что пример совпадает с его штрих. Добавьте 800 мкл 1 X штриховое кодирование Пермь буфера, многоканальные пипетки для всех образцов в пробирках кластера без касатьться клетки лепешка с пипеткой советы (не смешивая) для уменьшения ячейка потерь. Отложите стойки с трубками кластера.
  6. Удаление 20-plex Pd штриховое кодирование Kit трубки полоски от-20 ° C и разморозить при комнатной температуре. Добавить 100 мкл 1 X barcoding Пермь буфера, тщательно перемешать и передачи 120 мкл смеси ресуспензированы штрих-код в соответствующие образцы клетки в кластер трубы.
  7. Тщательно перемешать, многоканальные пипетки, так что нет никакого загрязнения между индивидуально перепутываются образцы. Инкубируйте кластера трубы для 30 мин при комнатной температуре, чтобы позволить штрих-кода на этикетке клетки.
  8. Центрифуга на 600 g x 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная супернатанта, а затем Ресуспензируйте в 1 мл CSM.
  9. Центрифуга и Ресуспензируйте в CSM снова, как в шаге 3.8.
    Примечание: Каждый образец теперь помечены с уникальным штрих-код, и образцы готовы объединить.
  10. Центрифуга на 600 g x 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. С одной пипетки и используя тот же Совет, передачи всех клеток окатышей в ~ 70-80 мкл остаточный объем в одной из полистирола трубы. Не извлечь наконечник пипетки; Отложите одной пипетки с этой подсказки.
  11. Многоканальные пипетки и новые советы добавьте ~ 100 мкл CSM для каждого исходного кластера трубки для максимального восстановления клеток. С одной пипетки с наконечником, который был отведен передать все ячейки окатышей в ~ 100 мкл остаточный объем же полистирола трубки.
  12. Добавьте CSM довершение полистирола трубки (~ 3 мл). Граф и запись ячейки количество пуле штрих набор. Центрифуга на 600 g x 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Перейти к пятнать перепутываются образцы в тот же день.
    Примечание: Это нормально ожидать ~ 20-30% ячейка потерь в процессе штриховое кодирование.

4. Окрашивание перепутываются лизированы/фиксированные клетки крови и подготовки для анализа на инструмент массового цитометрии

Примечание: Каждый 1 X титр Пятнать антитела (1 мкл антител на 100 мкл, окрашивание реакции), обычно может испачкать 3 – 4 х 106 клеток. Поэтому когда все образцы перепутываются объединяются в одну трубу, количество антител необходимо активизировать. Если 20 перепутываются образцы размер 30 х 106 клеток, и каждый титр 1 X может испачкать 3 – 4 х 106 клеток, перепутываются образца требует только 10 X титр, в отличие от пятнать каждый образец индивидуально, что потребует 20 X количество антител (1 X на отдельные трубки). Концентрация антител в камере номер должен тщательно титруют для каждого индивидуального антитела коктейль (здесь не обсуждаются).

  1. Пятно клетки, с использованием антител (Таблица материалов) для поверхности окраски и цитокина индукции.
    1. Сделать окрашивание поверхности коктейль путем расчета суммы будет добавлен и учета для дозирования ошибка (т.е., если окрашивание 20 образцов перепутываются 2 х 106 клеток в каждой пробе, 10 X титр пятно требуется; для окончательного объема вычислений, компенсировать дозирования ошибку, сделав 10.5 X окончательной окраски раствора).
    2. Добавьте 10 X стоит поверхности пятнать объем перепутываются клеток Пелле. Чтобы уменьшить потери клеток, с же кончика, смешать и измерить объем поверхностных пятен и Пелле клеток.
    3. Исходя из объема клеток и пятнать коктейль, добавьте CSM окончательный пятная объемом 50 мкл на количество клеток выборок (т.е., если выполняется набор 20 образцов, 50 мкл X 20 = 1 мл). Инкубируйте 30 мин при 4 ° C. Агитируйте образец каждые 15 мин для содействия даже пятнать.
    4. Во время инкубации поверхности пятен Подготовьте Пермь/мыть буфера (Таблица материалов) путем разбавления 1:10 с отфильтрованной ddH2O. Подготовка тома 2 мл раствора для permeabilization, и 5 мл для стирки. Храните при 4 ° C или на льду.
    5. Топ с поверхности окраски труб с CSM, и центрифуги на 600 x g при 4 ° C за 5 мин аспирационная супернатант. Ресуспензируйте перепутываются образца в 2 мл 4 ° C, 1:10 Пермь/мыть буфером для разбавления проб. Инкубируйте на 4 ° C на 20-30 мин до полного разрушения клеток.
    6. Центрифуга на 600 x g при 4 ° C на 5 мин и удалить супернатант.
    7. Для внутриклеточного пятнать, выполните аналогичные шаги окрашивание (что касается поверхности окрашивание). Однако, используйте 4 ° C, 1:10 Пермь/мыть буфером для разбавления проб вместо CSM сделать всего, окрашивание объем, так что клетки остаются в permeabilizing среде на протяжении внутриклеточных пятнать.
    8. Добавьте внутриклеточных антитела коктейль на поверхность окрашенных и permeabilized клеток Пелле (шаги 4.1.2–4.1.17). Составило в общей сложности, окрашивание объем 50 мкл на количество клеток образцов. Инкубируйте 60 мин при 4 ° C. Агитируйте образец каждые 15 мин для обеспечения даже пятнать.
    9. В ходе внутриклеточной окрашивание, подготовить решение intercalator: 900 мкл отфильтрованных PBS + 100 мкл отфильтрованных 16% PFA (конечная концентрация 1,6% PFA) + 0.2 мкл 500 мкм intercalator краситель (Таблица материалов).
    10. Топ покинуть ячейку Пелле + внутриклеточных антитела коктейль с холодной 1:10 Пермь/мыть буфера.
    11. Центрифуга на 600 x g при 4 ° C за 5 мин и удалить супернатант. Довершение окрашивание трубка с CSM. Граф и записать номер ячейки. Центрифуга на 600 x g при 4 ° C за 5 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте клеток в 1 мл intercalator раствора из шага 4.9. Инкубируйте по крайней мере 20 минут при комнатной температуре для полного интеркаляции, или на ночь при 4 ° C (образцы в intercalator растворе могут остановиться в 4 ° C на срок до 1 недели перед запуском их на инструмент массового цитометрии).
  2. Подготовка клетки для инструмента массового цитометрии.
    1. Топ покинуть трубу с 3 мл отфильтрованных ddH2O и центрифуги на 600 x g 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте клетки в 3 мл отфильтрованных ddH2O. пройти этот подвеска через 100 мкм фильтр для удаления любой мусор или агрегатов, которые потенциально могут засорить инструмент массового цитометрии.
    2. Граф и запись ячейки номер после фильтрации. Центрифуга на 600 x g 5 минут при температуре 4 ° C
  3. Приготовляют раствор шарик калибровки (Таблица материалов) путем разбавления 1:10 в отфильтрованных ddH2O.
  4. Ресуспензируйте окрашенных клеток в необходимый объем 1:10 разбавленный калибровки бусины решение достичь концентрации клеток ~ 1 х 106 клеток/мл.
    Примечание: Для CyTOF1 в 45 мкл/мин, рекомендуемое оптимальное — 5 x 105 клеток/мл; для Helios в 30 мкл/мин, 7,5 x 105 клеток/мл.
  5. Продолжить выполнение образца на инструмент массового цитометрии9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 демонстрирует процесс для стимуляции и обработки образцов периферической крови, включая выделение крови образца аликвоты, сроки добавлением стимуляции агентов, белок транспорт ингибитор коктейль и инкубации времен до Лизис эритроцитов (РБК) и фиксации. Выбор стимулирования агентов будет зависеть от сигнализации и цитокина пути, которые предназначены для оценки. Например в протоколе, описанные здесь, агонисты TLR используются для оценки врожденные им...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем, Роман, одноклеточных, proteomic подход к одновременно оценить несколько типов иммунных клеток и обнаружить их различных цитокинов возмущений в окружении пациента «патогенных» периферийные плазмы крови циркулирующей факторов. Этот метод использует периферической крови в целом в качестве аналитической транспортное средство и массового цитометрии как инструмент для оценки иммунных сотовой фенотипических и функциональных нарушений. Метод легко применяется к мышей и человека исследования2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Aimee Пью-Бернар за ее интеллектуальный вклад и полезные замечания. Эта работа была поддержана Боттчер фонд Уэбб-Уоринг биомедицинских исследований премии и премии число K23-1K23AR070897 из низ Елена W.Y. Hsieh. Она также была поддержана премии количество K12-HD000850 от Юнис Кеннеди Шрайвер национального института здоровья ребенка и развития человеческого потенциала и Люсиль Паккард для здоровья детей, Стэнфорд CTSA УЛ1 TR001085 и исследование здоровья ребенка Институт Стэнфордского университета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
РуксолитинибSanta CruzSC-364729AStock Conc: 10 мМ; Итоговый конк: 5 μ M
R848Invivogentlrl-R848-5Стоковый конц: 1 μ g/μ L; Итоговая конуссия: 1 μ g/ml
lps-ekInvivogentlrl-eklpsStock Conc: 1 μ g/μ L; Итоговая конуссия: 0,1 μ г/мл
стерильный PBSLonza17-516F
Lyse/Fix BufferBD Biosciences558049Stock Conc: 5X; Окончательный конц: 1X (разбавлен в ddH2O)
BD Фосфлоу для перма/промывки буфер IBD бионауки557885Стоковый конц: 10X; Конечная конусность: 1:10 (разбавленный в ddH2O)
RPMIGibco21870-076
Азид натрия (NaN3)Sigma-AldrichS-8032Стоковая конуссия: >99,9%; Окончательный конек: 0,0002
Ингибитор транспорта белка (PTI)eBiosciences00-4980-93Стоковый конц: 500X; Окончательный конц: 1X
интеркалятор ДНКFluidigm201192BСтоковый конц: 500 μ M; Итоговая конуссия: 0,1 μ
M Cell Staining Media (CSM)PBS + 0,5% BSA, 0,02% NaN3
MaxPar Штрих-код Perm BufferFluidigm201057Stock Conc: 10X; Окончательный конц: 1X
20-plex Pd Barcode SetFluidigmS0014Stock Conc: н/д; Окончательный конц: н/д
эквалайзер TM четырехэлементные калибровочные бусиныFluidigm201078стоковый конц: 10X; Окончательный конц: 1X
16% раствор формальдегида без MeOHThermo28908Стоковый конц: 16% (мас./об.); Конечный конц: 1,6% (по объему)
Стерильные полистирольные трубки с круглым дномVWR60818-496Исходный конц: н/д; Окончательный конц: н/д
Полипропиленовые кластерные трубкиLight LabsA-9001Stock Conc: н/д; Окончательный результат: н/а
Гелиос CyTOF приборFluidigmHeliosВсе растворы, используемые в анализе CyTOF, должны быть свободны от металлических загрязнений. ddH2O используется при приготовлении любых растворов, которые должны иметь удельное сопротивление не менее 18,0 MΩ. ddH2O и любые самостоятельно приготовленные растворы следует хранить в новых пластиковых или стеклянных бутылках, которые никогда не подвергались автоклавированию.
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Антитела, используемые для массовой цитометрии>
Поверхностные маркеры
CD1cBiolegendL161Масса: 161
CD3BDUCHT1Масса: 144
CD4BiolegendSK3Масса: 174
CD7BDM-T701Масса: 149
CD8BiolegendSK1Масса: 142
CD11bFluidigmICRF44Масса: 209
CD11cBDB-ly6Масса: 152
CD15BDHI98Масса: 115
CD14BiolegendM5E2Масса: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1Масса: 165
CD19Santa CruzSJ25C1Масса: 163
CD21BiolegendBu32Масса: 141
CD27BDL128Масса: 155
CD38FluidigmHIT2Масса: 172
CD45 всегоBiolegendHI30Масса: 89
CD45RABiolegendHI100Масса: 153
CD56MiltenyiREA196Масса: 168
CD66BDB1.1/CD66Масса: 113
CD86FluidigmIT2.2Масса: 150
CD123Fluidigm6H6Масса: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4AМасса: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7Масса: 162
IgDBiolegendIA6-2Масса: 146
IgMBiolegendMHM-88Масса: 151
CXCR5BDRF8B2Масса: 173
HLADRBiolegendL243Масса: 167
<сильные>цитокины
Ил-1&альфа;Biolegend364-3B3-14Масса: 147
ИЛ-1&бета;Биолегенда H1b-98Масса: 169
ИЛ-1RAСанта-Круз AS17Масса: 157
ИЛ-6 BiolegendMQ2-13A5Масса: 164
IL-8BDE8N1Масса: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6Масса: 171
Ил-17АБиолегенда BL168Масса: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdpМасса: 176
MIP1βBDD21-1351Масса: 158
MCP1BD5D3-F7Масса: 170
IFNαMiltenyi LT27:295Масса: 175
ИФН&гамма;Биолегенда4S. B3Масса: 165
PTENBDA2B1Масса: 159
TNF&альфа;BiolegendMab11Масса: 166
Note: Если производитель указан как Fluidigm, это антитело было приобретено у Fluidigm с предварительно конъюгированным металлом. Если производитель указан как отличный от Fluidigm, то это антитело было самоконъюгировано с использованием MaxPar Multi-Metal Labeling  Комплект (Fluidigm Cat: 201300) в соответствии с протоколом производителя.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
  3. Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039(2016).
  4. Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257(2009).
  5. Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
  6. Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
  7. Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
  8. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  9. Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  10. Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398(2012).
  12. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
  13. Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
  14. O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
  15. O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
  16. Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
  17. Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
  18. Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
  19. Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  20. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
  21. Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425(2015).
  22. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  23. Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
  24. Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  25. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
  26. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  27. Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  28. Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Mass CytometryPeripheral BloodCytokine ProductionImmunophenotype AnalysisAutoimmune DiseaseSingle cell AnalysisBlood StimulationBarcoding ProtocolCell Surface MarkersProtein Transport Inhibitor

Похожие статьи