Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Здоровый мозг гипофизарной срезы для электрофизиологических исследований клеток гипофиза у костистых рыб

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57790

⸱

16 августа 2018 г.

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В статье описывается оптимизированный протокол для приготовления жизнеспособных ткани мозга гипофизарной ломтиками, используя костистых рыб оризии (Oryzias latipes), следуют электрофизиологических записи гипофиза клеток с использованием метода патча зажим с перфорированные патч конфигурации.

Аннотация

Электрофизиологические исследования гипофиза клеток были проведены в многочисленных видов позвоночных, но очень немногие костистых рыб. Среди них явное большинство выполнены на диссоциированных первичной клетки. Чтобы улучшить наше понимание как костистых клеток гипофиза, ведут себя в более биологически соответствующие среде, этот протокол показано, как подготовить жизнеспособных мозга гипофизарной фрагментов с помощью мелких пресноводных рыб оризии (Oryzias latipes). Делая срезы мозга гипофиза, pH и осмотического давления всех решений были скорректированы для значения, найденные в жидкостях организма пресноводных рыб, живущих в 25-28 ° C. После подготовки срез протокол демонстрирует проводить электрофизиологических записей с использованием метода перфорированные поклеточного патч зажим. Патч зажим техника является мощным инструментом с беспрецедентной временное разрешение и чувствительность, позволяя исследования электрических свойств от нетронутыми все клетки до одного ионных каналов. Перфорированные патч является уникальным в том, что он держит внутриклеточной среды, нетронутыми предотвращая будучи разбавленным раствором электрода пипеткой патч регуляторных элементов в цитозоль. В противоположность этому при выполнении традиционных поклеточного записи, было отмечено, что оризии гипофиза клетки быстро теряют способность огонь потенциалы действия. Среди различных имеющихся методов перфорации этот протокол демонстрирует достижения перфорация пропатчен мембраны, используя фунгицидом амфотерицин B.

Введение

Гипофиза является ключевым эндокринного органа в позвоночных расположен ниже гипоталамуса и кзади зрительных нервов. Она производит и выделяет гормоны, шесть-восемь из типов конкретных клеток. Гормоны гипофиза являются промежуточным между мозга и периферических органов и управлять широкий спектр основных физиологических процессов, включая рост, размножение и регуляции гомеостаза. Подобно нейронов, эндокринных клеток гипофиза электрически возбудимых с возможностью спонтанно огонь потенциалы действия 1. Роль этих действий потенциалов является зависимой ячейки. В нескольких типах клеток млекопитающих гипофиза потенциалы действия может поднять внутриклеточных Ca2 + достаточно для стабильного выпуска гормона 2. Кроме того гипофиза получает как стимулирующее, так и тормозящий информацию от головного мозга, которое затрагивает мембранного потенциала клеток 3,4,5,6. Как правило стимулирующее ввода увеличивает возбудимость и часто включает в себя выпуск Ca2 + от внутриклеточного магазинов а также увеличилась, выпустив частоты 7. Понимание как ячейка использует канал ионного состава и приспосабливается к этим входных сигналов от мозга является ключом к пониманию синтез гормонов и выпуска.

Патч зажим техника была разработана в конце 70-х годов Сакман и Неер 8,9,10 и дальнейшего улучшения Хэмилл 11и позволяет детальные исследования электрофизиологических свойств клеток вплоть до одного ионных каналов. Кроме того этот метод может использоваться для изучения тока и напряжения. Сегодня патч зажима является золотым стандартом для измерения электрофизиологических свойств ячейки. Четыре основных конфигураций герметичное уплотнение патч зажим техники были развитые 11; клетки придает, изнутри наружу, снаружи out и поклеточного патч. Три первых конфигурации обычно используются для одной ионного канала расследований. Четвертое, после придает ячейки конфигурации отверстие в клеточной мембраны производится с использованием югу атмосферного давления. Эта конфигурация также позволяет исследования ионного канала состава клеточных 12. Однако одним ограничением этой методики является, что цитоплазматических молекулы разводят патч пипеткой решение 13 (рис. 1А), влияя таким образом на электрических и физиологические реакции исследованных клеток. Действительно некоторые из этих молекул может играть важную роль в трансдукции сигнала или в регуляции различных ионных каналов. Чтобы избежать этого, Линдау и Фернандес 14 разработал метод где поры формирование соединения добавляется к патч пипеткой. После конфигурации придает ячейки соединение будет включать в плазматической мембраны под патч и медленно перфорировать мембраны, создание электрического контакта с цитозоле (рис. 1Б). Можно использовать несколько различных противогрибковые препараты, такие как нистатин 15 и амфотерицин B 16, или поверхностно-активных веществ, как сапонины бета эсцин 17,18 . Эти соединения создают поры достаточно большой, чтобы позволить моновалентной катиона и Cl– диффузии между цитозоле и патч пипеткой при сохранении цитозольной уровни макромолекул и больше ионов как Ca2 + 15, 16.

Проблема использования перфорированной патч является потенциально высокой серии сопротивление. Последовательное сопротивление (Rs) или доступ сопротивление является комбинированных сопротивления над патч пипеткой по отношению к земле. Во время записи патч зажим, Rs будет параллельно с мембраной сопротивления (Rm). M R и Rs в параллельной работы как Делитель напряжения. С высокой Rs, напряжение упадет Rs давая ошибки в записи. При больших токах Записанная ошибка станет больше. Кроме того делителя напряжения является частота зависит от создания НЧ-фильтр, таким образом затрагивающих временное разрешение. По сути перфорированные патч может не всегда позволяют записи крупных и быстрых течений как напряжение закрытого Na+ токи (более подробные показания см ссылку 19). Кроме того Rs может варьироваться во время записи патч зажим, снова ведет к изменениям в текущей записи. Таким образом ложных срабатываний может возникнуть в ситуациях, когда Rs изменения во время применения препарата.

Электрофизиологии на кусочки ткани был впервые представлен Андерсен лаборатории по изучению электрофизиологических характеристик нейронов в мозге 20. Техника проложили путь для подробного исследования одной клетки, а также связи и ячейки схемы ячеек в среде более нетронутыми. Подобный метод для изготовления гипофиза ломтики был представлен в 1998 году Guérineau et al. 21. Однако, он не был до 2005 года, что подготовка мозга гипофизарной срез был успешно используется для исследования патч зажим в костистых 22. В этом исследовании авторы также сообщили об использовании перфорированных патч зажим записей. Однако на сегодняшний день, большинство электрофизиологических исследований гипофиза клетки были проведены в млекопитающих и только горстка других позвоночных, включая костистых рыб 1,2,22,23 . В teleosts почти все исследования были проведены на первичной диссоциированных клетки 24,25,26,27,28,29,30 .

В настоящем документе мы наметим оптимизированный протокол для приготовления здорового мозга гипофизарной фрагментов из рыбы оризии модели. Этот подход представляет собой ряд преимуществ, по сравнению с первичной диссоциированных клеточных культур. Во-первых клетки, записываются в среде относительно сохранились, по сравнению с отделить условий культуры клеток. Во-вторых ломтик препараты позволяют нам учиться косвенных путей, посредничестве ячеек связи 22, что невозможно в условиях культуре диссоциированных клеток. Кроме того мы показали, как проводить электрофизиологических записей на ломтики полученные тканей, с использованием метода перфорированные поклеточного патч зажим с амфотерицин в качестве агента порами формирования.

Оризии является небольшой пресноводных рыб, родом из Азии, главным образом найдены в Японии. Физиологии, эмбриологии и генетики оризии были широко изучены для более чем 100 лет 31, и это часто используемые исследовательской модели во многих лабораториях. Особое значение для этого документа является организация различных морфологических гипоталамус гипофиз комплекса в костистых рыб: в то время как в млекопитающих и птиц нейронов гипоталамуса освободить их нейро гормоны, регулирующие гипофиза эндокринные клетки в систему портала средний возвышение существует прямой нервной проекции нейронов гипоталамуса на эндокринные клетки гипофиза в 32костистых рыб. Таким образом тщательно проведенных нарезки гипофиза мозга имеет особое значение в рыбе, что позволяет нам исследовать электрофизиологических характеристик гипофиза клетки в хорошо сохранившейся сети гипофиза мозга и в частности как гипофиза клетки контролировать их возбудимости и тем самым Ca2 + гомеостаза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные обработка была выполнена согласно рекомендации по уходу и благополучия животных исследования в Норвежском университете наук о жизни и под надзором уполномоченного следователей.

1. Подготовка документов и решений

Примечание: Все решения должны быть стерильными. Пристальное внимание должно уделяться pH и осмотического давления (osmol/кг воды) всех решений, которые должны быть тщательно адаптированы к внеклеточных среды изученных видов. pH и осмотического давления должна быть скорректирована с точного электронного оборудования как pH метр и замерзания осмометре соответственно.

  1. Сделать 500 мл раствора внеклеточных без Ca2 + (Ca2 + бесплатно EC): 150 мм NaCl, 5 мм KCl, 1.3 мм2MgCl глюкозы 4 мм, 10 мм Hepes.
    1. Распустить 4.38 г NaCl, 186.37 мг KCl, 61.89 мг MgCl2, 360.32 мг глюкозы и 1,19 г HEPES в 450 мл сверхчистого (0,055 США / см при 25 ° C, сопротивление 18.2 МОМ) H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
    2. Отрегулируйте пэ-аш до 7.75 с NaOH.
    3. Передача решения в объемный флакон 500 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 500 мл.
    4. Mix решение задолго до измерение осмотического давления. Приспособиться к 290-300 мОсм с маннитол. Фильтр стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения и 0,2 мкм фильтром.
  2. Сделать 500 мл раствора внеклеточных (EC): 150 мм NaCl, 1.3 мм MgCl2, 5 мм KCl, 2 мм2CaCl, глюкозы 4 мм, 10 мм Hepes.
    1. Растворите 4.38 г NaCl, 186.37 мг хлористого калия, 147.01 мг CaCl2, 61.89 мг MgCl2, 360.32 мг глюкозы и 1,19 г HEPES в 450 мл сверхчистого H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
    2. Отрегулируйте пэ-аш до 7.75 с NaOH.
    3. Передача решения в объемный флакон 500 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 500 мл.
    4. Mix решение задолго до измерение осмотического давления. Приспособиться к 290-300 мОсм с маннитол. Фильтр стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения и 0,2 мкм фильтром.
  3. Сделать 500 мл раствора внеклеточных с 0.1% бычьего сывороточного альбумина (EC с BSA): 150 мм NaCl, 1.3 мм MgCl2, 5 мм KCl, 2 мм2CaCl, глюкозы 4 мм, 10 мм Hepes.
    1. Растворите 4.38 г NaCl, 186.37 мг хлористого калия, 147.01 мг CaCl2, 61.89 мг MgCl2, 360.32 мг глюкозы и 1,19 г HEPES в 450 мл сверхчистого H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
    2. Отрегулируйте пэ-аш до 7.75 с NaOH.
    3. Передача решения в объемный флакон 500 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 500 мл.
    4. Mix решение задолго до измерение осмотического давления. Приспособиться к 290-300 мОсм с маннитол. Фильтр стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения и 0,2 мкм фильтром. Добавьте 50 мг BSA.
  4. Сделать 250 мл раствора внутриклеточных (IC): 110 мм Кох, 20 мм KCl, 10 мм Hepes, сахароза 20 мм.
    1. Растворите 1,54 g Кох, 327.75 мг хлористого калия, 595.75 мг HEPES и 1.712 г сахарозы в 450 мл сверхчистого H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
    2. Отрегулируйте pH 7.2 (N-Морфолино) этан сульфонольно кислотой (MES).
    3. Передача решения в объемный флакон 250 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 250 мл.
    4. Mix решение задолго до измерение осмотического давления. Приспособиться к мОсм (ниже, чем ЕС 10 мОсм) 280-290 с сахарозой. Фильтр стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения и 0,2 мкм фильтром.
  5. Сделать 100 мл раствора 2% низких плавления агарозы в Ca2 + и BSA бесплатно EC (2 g низких плавления агарозы в 100 мл Ca2 + бесплатно EC). Растворить с помощью микроволновой и место растопленным агарозы в водяной бане при 40 ° C. Дайте ему остыть, пока достигает 40 ° C перед использованием на ткани.
    Примечание: ЕС, Ca2 + бесплатные EC могут храниться при температуре 4 ° C на несколько недель, если стерильные и IC решений при-20 ° C, за несколько месяцев. Агарозы могут храниться на неделю на 4 ° C и может быть использовано 3 – 5 раз кратко микроволновой печи. Чрезмерного повторного приведет к испарения и переоборудование агарозы и концентрации соли и качества.
  6. Сделайте агар мост:
    1. Нагрейте 7,5 мм длиной боросиликатного стекла капилляров с внешним диаметром 2 мм (диаметр) и внутренний диаметр (и.д.) 1,16 мм, с помощью горелки Бунзена в фокальной точки около 1/3 от одного конца до тех пор, пока стекло начинает сгибаться. Извлеките стекло от пламени и позволяют стекла, чтобы согнуть с углом около 120 градусов (рисA).
    2. Растопите 2% агар в нормальных ЕС без глюкозы с помощью микроволновой, и хотя агарозы жидкой заливки, готовые стеклянный капилляр, используя капиллярности сил, поставив один из концов стекла в жидкость и ждать несколько минут. Хранить мостов до использования на 4 ° C в ЕС без глюкозы.
  7. Подготовьте боросиликатного стекла с накаливания патч пипетки с помощью подходящего пипеткой съемник. Обратитесь к руководству съемник пипетку для получения желаемого электрода сопротивления.
    Примечание: Конический пипеткой должно быть как можно более коротким. Короткие пипеткой конические достигается с помощью тягового шаги 4 – 6. Электрод сопротивление должно быть между 2 и 6 MΩ в зависимости от размера ячейки.
  8. Чтобы избежать движения ткани во время экспериментов патч зажим пальто поверхности записи камеры с 0,1% polyethylenimine (PEI) в буфере Борат.
    1. Подготовка 500 мл Борат буфера (25 мм):
      1. Растворяют 4.768 g Na2B4O710 H2O в 450 мл сверхчистого H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
      2. Отрегулируйте пэ-аш до 8,4 с HCl.
      3. Передача решения в объемный флакон 500 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 500 мл и 0,2 мкм фильтром стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения.
    2. Подготовьте раствор 1% Пей (1 мл 50% PEI буфер Борат 49 мл 25 мм) и 0.1% разбавления PEI путем разбавления 10 мкл Стоковый раствор 1% в 100 мкл буфера Борат для конечного использования.
    3. Добавить 2 мл 0,1% пей на стекло ломтик держателя и пусть покрытие инкубировать в течение 1 минуты. Затем кратко Мойте стекло дважды с 5 мл сверхчистого H2O и пусть воздух сухой до использования.
  9. Подготовьте амфотерицин B решения.
    1. Сделать Стоковый раствор 60 мг/мл 3 мг порошка амфотерицин в 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), растворяют в 1 мл, защищенном от света. Вихрь на максимальной скорости, для 30 s и sonicate за 15 мин до однородности. Хранить аликвоты в 3-5 трубок при-20 ° C и использовать один Алиготе в день.
      Примечание: Если амфотерицин B Стоковый раствор не ясно и желтый цвет, но Млечный (еще желтый) после 15 – 20 мин sonication сделать новый Стоковый раствор.
    2. Сделать IC решение с амфотерицином B, дозирования 2 мл IC в стакан чистой стекла с более чем 10 мл. 8 мкл Стоковый раствор амфотерицин в пипеткой раствор и смешивать, закупорить. Оберните стакан с алюминиевой фольгой и место на льду до использования и продлевать его каждые 3 ч.

2. Вскрытие и нарезки с Vibratome

  1. Подготовка рассечение инструменты перед рассечения, включая один острый и один сильный щипцы с ножницами. Чистые инструменты (держатель ткани, кисть, щипцы) с этанолом и убедитесь, что они используются только для целей рассечение и никогда при контакте с фиксированной тканей. Держите их в отдельном окне, чтобы избежать загрязнения.
  2. Усыпить рыбы в холодной воде льда за 1 мин.
  3. Следовать за последующие шаги, чтобы быстро анализировать оризии мозга и гипофиза с острыми щипцами (использовать не более 3 минут).
    1. Удерживая рыбу с сильным щипцами тяжелой два зрительных нервов позади глаз с ножницами или острые щипцы.
    2. Откройте спинной части черепа от задней к передней стороне, ломая кости черепа шаг за шагом с сильным щипцами.
    3. Отделите череп на одной стороне с сильным щипцами.
    4. Тяжелые спинного мозга с ножницами или острые щипцы.
    5. Осторожно захватить спинного мозга с щипцами, флип мозг от задней к передней и поместите его в блюдо с ледяной Ca2 + бесплатные ЕС.
  4. Заполните формы металла3 1,5 – 2 см с жидким агарозы и поместите его на льду.
  5. Непосредственно перед агарозы твердеет (на примерно 25 – 30 ° C), аккуратно захватить спинного мозга с щипцами, сухой щипцы с куском тонкой бумаги и положить ткани в агарозы. Быстро перемешайте агарозы для разбавления следы EC оставили вокруг ткани и ориентироваться ткани и пусть плесень на льду на несколько секунд, пока не затвердеет агарозы.
    Примечание: Важно для этот шаг, чтобы быть быстрым. Агарозы твердеет быстро как формы металла охлаждают льдом.
  6. Трим квадратный блок агарозы, содержащих ткани с лезвием скальпеля и приклейте его на vibratome держатель образца с помощью хирургии (нетоксичная) клея.
  7. Заполните кювета vibratome получения (мозг гипофиза) держатель образца с ледяной Ca2 + бесплатные EC.
  8. Поместите держатель образца в vibratome и вырезать агарозы блок сделать парасагиттальных разделы 150 мкм, с использованием высокой частоты и низкой скорости для разрезания. Собирать отдельные разделы и поместите их в камеру записи патч зажим с 3 мл ледяной Ca2 + бесплатные EC.
  9. Поместите сетку арфы (рис. 2B) в разделе ткани.
    Примечание: Арфа будет вместе с покрытием стабилизации ткани и не допустить его перемещение во время записи патч зажим.
  10. После арфы на месте, измените Ca2 + бесплатные EC среднего нормальной EC с Ca2 + и BSA. Пусть остальные ткани за 10 мин.

3. перфорированные патч зажим и электрофизиологические записей

  1. Перед началом эксперимента, хлорид серебра проволочные электроды, следующие шаги: во-первых, используйте тонкой шкуркой (p180) для очистки электродов серебряной проволокой. Во-вторых промойте с 2 мл, этанол 70%. В-третьих окуните провода в 2 мл, 2 – 5% хлора на 10 мин. Наконец промыть с 2 мл, сверхчистый H2O.
  2. Место записи камеры с срез мозга гипофиза в микроскопа и найдите целевой области (гипофиза) с помощью 10 X цели и проверки ячейки, используя 40 X цель.
    Примечание: Если подготовка является успешным, очень немногие круглые клетки должны быть видны. Эти круглые клетки, обычно поврежденные клетки, которые отсоединение от ткани.
  3. Место электрода заземления через мост 2% агар в ЕС ванну.
  4. Найдите здоровых клеток, используя 40 X цель.
    Примечание: Здоровых клеток должны быть прочно прикрепляются к кусочек ткани и не округляется до и отсоединяется от фрагмента.
  5. Установите усилитель в напряжения зажим (VC; Режим точки 1 рис. 4A ). Откройте печать теста окно и нажмите ванны конфигурации (Рисунок 4B точки 1 и 2. Используйте импульс 5-mV для мониторинга пипеткой сопротивления (Рисунок 4B . пункт 3).
  6. Засыпки кончиком пипетки патч противогрибковые бесплатные решения IC перед добавлением раствора IC с амфотерицином B, с помощью шприца микро наполнитель (см. рис. 3).
  7. Добавьте немного положительное давление воздуха в пипетку патч, используя шприц 1 мл.
    Примечание: Это делает небольшой поток жидкости из пипетки патч, избежать загрязнения кончика.
  8. Однажды в бане, оценить сопротивление пипеткой патч и убедитесь, что частицы не прикреплены к кончиком пипетки (рис. 4 c).
    Примечание: Небольшой кусок ленты прикрепляется на монитор отображения формы записи видео поле зрения. Это делает позиционирования патч пипеткой по отношению к ячейке легче, когда цель не упором на ячейку.
  9. Руководство патч пипетку до ячейки с помощью микроманипуляторов.
    Примечание: Убедитесь, что пипетку чистой ищет мелких частиц, которые могут прикреплены к кончику дозатор. Внезапные изменения в сопротивление может также быть результатом частиц, застрял в наконечник пипетки.
  10. Скорректировать пипетки, когда несколько микрон выше ячейки так, чтобы наконечник пипетки будет касаться 1/3 от середины клетки, клетки, как показано на рисунке 5. При прикосновении к ячейке, выпустить давление и применять нежные всасывания сделать печать.
    Примечание: Время от пипетки патч входит баня для успешной печати должны храниться как можно более коротким. Не более 1-1,5 мин во избежание амфотерицин B, достигнув кончика пипетки и утечки в ванну.
  11. Немедленно переключитесь в окно патч в программное обеспечение патч зажим (рис. 4 D точка 1) и имеют потенциал проведения между-50 и -60 МВ (точка 2на рисунке 4 d ). Ноль вне быстро емкость составляют стеклянной пипетки (точка 3Рисунок 4 d ).
  12. Перейдите в окно ячейка в патч зажим программного обеспечения (Рисунок 4E точки 1 и 2) и начать мониторинг доступа сопротивления, РА, отображается в окне. Обнулить мембраны емкость в усилитель программного обеспечения (Рисунок 4E точка 3) после достаточного доступа.
    Примечание: Достаточного доступа может занять 10-30 мин (Рисунок 4E пункт 2). Хороший доступ для текущей записи зажим должен быть ниже 20 М.
  13. Перейти к текущей зажим, IC, в окне программного обеспечения усилитель (Рисунок 4F пункт 1). Отрегулируйте быстро емкостных токов в окне зажим усилителя программного обеспечения (Рисунок 4F точки 2 и 3) и то же значение, как и 3.12. Проверьте мембранный потенциал (Рисунок 4F пункт 1).
    Примечание: Важно отметить, что если мембранного потенциала мелких (типичный выше -35 mV) ячейка может быть поврежден. Отменить запись и найти новую ячейку.
  14. После нахождения здоровых клеток (прочно прикреплены к ткани с мембранного потенциала ниже -40 МВ), начать экспериментальный записи как подробно указано в производителя протокол 33,34.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол свидетельствует протокол шаг за шагом о том, как добиться надежной электрофизиологических записей из гипофиза (gonadotrope) клеток, используя оризии трансгенные линии [тг (lhb- hrGfpII)], где целевые клетки (Lh производители гонадотропины) помечены Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП).

Первоначально электрофизиологические исследования проводились с использованием поклеточного конфигурации. Однако спонтанное...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Электрофизиологические записей с использованием метода патча зажим на срезах головного мозга гипофизарной требуют тщательной оптимизации. Хорошо оптимизированный протоколы для проведения расследований клеток специально в teleosts ограничены, с большинством публикаций с помощью протоколов, основанных на системах млекопитающих. В этой связи важно быть осознает тот факт, что несколько физиологических параметров как pH и осмотического давления не только видов зависимой, но также очень много зависит ли рассматриваемое организ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Мы благодарим г-жа Тан G LourdesCarreon за ее помощь, поддержание объекте оризии и Энтони Пельтье для иллюстративных цифр. Эта работа финансировалась путем NMBU и исследовательский совет Норвегии, номера грантов 244461 (аквакультуры программы) и 248828 (Цифровая жизнь Норвегии программа).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ВибратомныйLeicaVT1000 S
Хирургический клейWPIVETBOND3M Vetbond Тканевый клей
Лезвия из нержавеющей сталиCampden Instruments752-1-SS
металлические формыSAKURA4122
стальная арфаWarner Instruments64-1417
PBSSIGMAD8537
Сверхчистый LMP agaroseinvitrogen166520-100
патч-пипеткиSutter InstrumentBF150-110-10HPБоросиликат с нитью накала Наружный диаметр: 1,5 мм, внутренний диаметр: 1,10 мм
Микроскоп SlicescopeScientificapro6000
P-Clamp10Молекулярные приборы#1-2500-0180sofware
Дигитайзер Digidata 1550A1Молекулярные приборыDD1550
Усилитель Multiclap 700B Headstage CV-7BМолекулярные приборы1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-Glu-His-Trp-Ser-his-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH трифторацетатная соль 
съемник пипеткиSutter InstrumentP-1000
амфотерицин BSIGMAA9528порообразующий антибиотик
полиэтиленимин SIGMAP314350% раствор PEI
микрофилатор шприцWPIMF28/g67-5
стекло для агарового мостаSutter InstrumentBF200-116-15Боросиликат с нитью накала Наружный диаметр: 2,0 мм, внутренний диаметр: 1,16 мм Огневарный полированный
Micro-Manager Программное обеспечениемикроскопии с открытым исходным кодом Программное обеспечение
optiMOS sCMOS камераQimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
ультразвуковой аппаратElmaD-7700 singen
NaClSiGMAS3014
KClSiGMAP9541
MgCl2SiGMAM8266
D-глюкозаSiGMAG5400
HepesSiGMAH4034
CaCl< sub>2SiGMAC8106
СахарозаSiGMA84097
D-маннитSiGMA63565
MES-кислотаSIGMAM0895
BSASIGMAA2153
для

Ссылки

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613(1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12(2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

BOryzias latipes
Здоровый мозг гипофизарной срезы для электрофизиологических исследований клеток гипофиза у костистых рыб
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.