Методическая статья

Быстрая, масштабируемая Ассамблеи и загрузка биоактивные белков и Иммуностимуляторы в разнообразных синтетических Nanocarriers через флэш-Nanoprecipitation

DOI:

10.3791/57793

⸱

11 августа 2018 г.

 ,  , 
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наноматериалы обеспечивают универсальный механизмы терапевтического контролируемых поставок как фундаментальной науки, так и трансляционная приложений, но их изготовления часто требует опыта, который недоступен в наиболее биомедицинских лабораториях. Здесь мы представляем протоколы для масштабируемых изготовления и терапевтические загрузки разнообразных собственн-собранные nanocarriers с использованием флэш-nanoprecipitation.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наноматериалы представляют широкий спектр опций для настройки контролируемые поставки одного и комбинированных молекулярной полезных для терапевтических и визуализации приложений. Это увеличение специфичность может иметь значительные клинические последствия, включая снижение побочных эффектов и более низкие дозы с высшей потенции. Кроме того в situ ориентации и управляемой модуляции подмножества определенных ячеек можно повысить в пробирке и в vivo исследования основных биологических явлений и зонд функции клеток. К сожалению, необходимый опыт в наноразмерных науки, химия и машиностроение часто запрещают лаборатории без опыта в этих областях изготовления и настройки наноматериалы как инструменты для их расследования или транспортных средств для их терапевтические стратегии. Здесь мы предоставляем протоколы для синтеза и масштабируемых Ассамблея поддаются снисходительный формирования системы сополимер универсальный блок не токсичен и загрузки транспортных средств наноразмерных для биомедицинских приложений. Флэш-nanoprecipitation представлен как методологии для быстрого изготовления различных nanocarriers от poly(ethylene glycol) -bl-сополимеры поли (пропилен сероводорода). Эти протоколы позволит лаборатории с широкий спектр опыта и ресурсов для легко и можно воспроизвести изготовить передовых nanocarrier систем доставки для их приложений. Проектирование и строительство автоматизированного инструмента, который использует высокоскоростной шприцевый насос для облегчения флэш-nanoprecipitation процесс и чтобы усиление контроля над однородности, является размер, морфология и загрузка polymersome nanocarriers описал.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocarriers позволяют контролируемые поставки груза малого и высокомолекулярных соединений, включая активных субъектов, что, если не инкапсулированные, будет весьма разложению и/или слишком гидрофобные для администрации в естественных условиях. Nanocarrier морфологии регулярно сфабрикованы полимерные везикулы аналогично липосомы (также называемый polymersomes) предлагают возможность одновременно загружать гидрофильные и гидрофобные грузовой1,2. Несмотря на их перспективные преимущества polymersomes все еще редки в клинических приложений вследствие, в частности, несколько ключевых проблем в их производстве. Для клинического применения polymersome составов должны быть сделаны в крупномасштабных, стерильные и последовательных партий.

Целый ряд методов может использоваться для формы polymersomes из диблок сополимера, например poly(ethylene glycol) -блок-поли (пропилен сульфидные) (PEG -bl- PPS), которые включают растворителей дисперсии3, тонкопленочных регидратации1 , 4, микрофлюидика 5,6и7прямых гидратации. Растворителя дисперсии предполагает длительный инкубационный раз в присутствии органических растворителей, которые может денатурировать некоторые биоактивные полезных нагрузок, как белки. Тонкопленочных регидратации не предложить контроль над полиизопрена сформированных polymersomes, часто требующие дорогим и трудоемким экструзии методы для достижения приемлемого монодисперсность. Кроме того как microfluids, так и прямых увлажнение трудны для масштаба вверх для больших объемов производства. Из методов изготовления различных nanocarrier флэш-nanoprecipitation (ППП) предлагает возможность сделать крупномасштабные и воспроизводимые формулировки8,9,10. Хотя FNP ранее был зарезервирован для разработки твердых ядро наночастиц, нашей лаборатории недавно расширил использование FNP включать последовательное формирование разнообразных PEG -bl- PPS наноструктурированных морфологии11, 12, включая polymersomes11 и bicontinuous nanospheres12. Мы обнаружили, что FNP был способен формирования составов монодисперсных polymersomes без необходимости для экструзии, что приводит к превосходной полиизопрена значения индекса по сравнению с не экструдированный polymersomes, образованный тонкопленочных регидратации и растворителя дисперсия 11. Bicontinuous nanospheres, с их большими гидрофобные доменов, не смогли быть сформирован тонкопленочных регидратации, несмотря на формирование под количество растворителя условий с FNP12.

Здесь мы предоставляем подробное описание для синтеза PEG -bl- PPS диблок сополимера, используемых в формировании polymersome, замкнутых покушение струй (CIJ) Смеситель для ППП, FNP протокол и осуществления автоматизированной системы снизить изменчивость пользователя. Включена информация о том, как для стерилизации системы достаточно производить бесплатно эндотоксина составов для использования в естественных условияхи репрезентативных данных, касающихся характеристика polymersomes, образованный FNP. С этой информацией читатели с интересом в использовании polymersomes in vitro и in vivo работы смогут изготовить их собственных стерильные, монодисперсных формулировок. Читатели с опытом работы в nanocarrier составов и с опытом синтеза полимерных будет возможность быстро проверить свои собственные полимерных систем, используя FNP в качестве потенциальной альтернативы их текущих методов разработки. Кроме того протоколы, описанные здесь, могут использоваться как образовательные инструменты для разработки nanocarriers курсы лаборатории нанотехнологий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. синтез Poly(Ethylene GLYCOL) -блок-поли (пропилен сульфидные)-тиоловых

  1. Синтезировать метокси poly(ethylene glycol) мезилата (Mn: 750) (Мео-PEG17-Ms, я).
    1. Растворите 10 g Мео-PEG17- ой в 200 мл 100% толуола в течение 3-шеи круглым дном колбу (РБФ) под магнитной перемешивания на 600 об/мин.
    2. Подключите 3-шеи RBF аппарат Дина-Старка, сам прилагается к конденсатору, держать всю систему в атмосфере инертного газа, азота или аргона.
    3. Место 3-шеи RBF в масляной ванне, тепла до 165 ° C помешивая на 600 об/мин.
    4. Удаление трассировки воды и 100 мл толуола, используя азеотропная дистилляция.
    5. Снять 3-шеи RBF от нефти, отсоединить аппарат Дина-Старка при сохранении условий инертного газа и охладите до комнатной температуры.
    6. Добавьте 5,6 мл 100% триэтиламина (3 экв. молярная) и 300 мл безводного 100% толуола Мео-PEG17-OH решение помешивая на 600 об/мин.
    7. Переместить 3-шеи RBF ледяной ванне, сохранить помешивая на 600 об/мин и условий инертного газа.
    8. Разбавить 3.1 мл хлорида methanesulfonyl 100% (3 экв. молярная) в 30 мл 100% толуола, медленно добавить 3-шеи RBF через воронку дополнение помешивая на 600 об/мин.
    9. Движение на ночь, на 600 об/мин при комнатной температуре в инертной условиях.
    10. Фильтр раствор через воронку Buchner упакованы с кизельгур (см. Таблицу материалы) для удаления солей.
    11. Удаление толуол через роторный испаритель с водяной бани, равным 40 ° C, вращение при 120 об/мин, давление равным между 50-100 миллибар.
    12. Повторно растворять продукт в 200 мл 100% Дихлорметан (DCM) и процеживают через воронку Бухнер, Упакованные с кизельгур (см. Таблицу материалы).
    13. Удаление DCM через роторный испаритель с водяной бани, равным 40 ° C, вращение при 120 об/мин и давлением равным между 450-600 миллибар.
    14. Умеренно повторно растворять продукт в 100% DCM и медленно осадка продукта, добавив его каплям (через пипетку Pasteur) 500 мл ледяной 100% диэтиловом эфире. Сохранить помешивая на 300 об/мин.
    15. Декант или удалить для удаления диэтиловый эфир из осажденного продукта, Мео-PEG17- Mesylate и хранить всю ночь в вакуумного эксикатора полностью высохнуть.
    16. Сразу использовать изделие, или храните в атмосфере инертного газа при-20 ° C в течение нескольких месяцев.
  2. Синтезировать метокси poly(ethylene glycol) thioacetate (Мео-PEG17-TA, II).
    1. Растворяют 5 g Мео-PEG17-МС (I) в 200 мл 100% безводный диметилформамид (DMF) в 3-шея RBF, движение на 600 об/мин при комнатной температуре в атмосфере инертного газа.
    2. Добавьте 2.5 g 100% калия карбонат (3 экв. молярная) перемешивания раствора.
      Примечание: карбонат калия не растворится полностью в растворе.
    3. Разбавить 1,3 мл 100% thioacetic кислоты (3 экв. молярная) в 100 мл 100% безводный ДМФ и добавить каплям раствора через воронку сложения.
      Примечание: Thioacetic кислота имеет сильный, неприятный запах. Необходимо позаботиться о том, чтобы сохранить все загрязненные объекты внутри химического Зонта на ночь до удаления или очистки.
    4. Размешивать энергично (об/мин, 600 или больше) на ночь при комнатной температуре.
      Примечание: Солеобразования легко может нарушить перемешивание этого решения. Необходимо позаботиться о том, сохранить помешивая на ночь.
    5. Фильтр раствор через воронку Buchner упакованы с кизельгур (см. Таблицу материалы).
    6. Удаление функции DMF через роторный испаритель с водяной бани, равным 60 ° C, вращение при 120 об/мин и давлением, установленным между 5-15 миллибар.
    7. Растворять продукт в 100 мл 100% тетрагидрофуран (THF) и добавить столбец, Упакованные с нейтральным глинозема для удаления примесей цветных красный/оранжевый.
    8. Удаление ТГФ через роторный испаритель с водяной бани, равным 40 ° C, вращение при 120 об/мин и давлением равным между 200-300 миллибар.
    9. Умеренно повторно Растворите продукт в 100% DCM. Если соль преципитат формы, фильтр решение через 6 мкм поры размер фильтра бумаги с помощью воронки по Buchner.
    10. Медленно осадка продукта каплям добавляя через пипетку Pasteur в 500 мл ледяной 100% диэтиловым эфиром, помешивая на 300 об/мин. Диэтиловый эфир может потребоваться быть далее охлажденным до-20 ° C в морозильник взрывозащищенные для нескольких часов если осадок не врезаться из раствора при 4 ° C.
    11. Декант или удалить для удаления диэтиловый эфир из осажденного продукта, Мео-PEG17-Thioacetate. Хранить продукт на ночь в вакуумный сушильный шкаф, а затем в атмосфере инертного газа при-20 ° C.
  3. Синтезировать диблок сополимер poly(ethylene glycol) -блок -poly(propylene sulfide) тиоловых (PEG17-bl- PPS35-SH, III).
    1. Растворяют в 10 мл на 100% Мео-PEG17-TA (II) безводный ДМФ в колбе Шленк под аргоном, помешивая на 400 об/мин в ванне с водой комнатной температуры.
    2. Добавьте 1.1 Молярная eq метоксида натрия (0,5 М раствора в метаноле), позволяют перемешать на 400 об/мин за 5 минут.
    3. Добавьте 35 Молярная eq 100% пропилена сульфида, быстро, решение. Позволяет перемешивать на 400 об/мин в течение 10 минут.
    4. Добавить 10 Молярная eq 100% уксусной кислоты кристаллизированной, позволяют перемешать на 400 об/мин за 5 минут.
    5. Удаление функции DMF через роторный испаритель с водяной бани, равным 60 ° C, вращение при 120 об/мин и давлением, установленным между 5-15 миллибар.
    6. Повторно растворять продукт экономно в 100% DCM, осадок в 80 мл 100% метанола, раскол между двумя 50 мл конические пробирок.
    7. Конические пробирок на 7500 g x 5 минут при 4 ° C. Аспирационная прочь супернатант.
    8. Хранить продукт, PEG17-bl- PPS35-SH, ночевка в вакуумный сушильный шкаф, а затем в атмосфере инертного газа при-20 ° C.

2. Соберите PEG -bl -PPS Nanocarriers через Hand-Powered флэш-Nanoprecipitation

  1. (Необязательно) Стерилизуйте смеситель струй (CIJ) ограничивается покушение.
    1. В рамках биологической безопасности кабинета (BSC) опускайте миксер со всеми частями, разобран в пределах 0,1 М NaOH на ночь.
    2. Соберите смеситель CIJ и поток через эндотоксинов свободной воды с помощью шприцах luer-lock.
    3. Проверить рН воды и продолжать потока воды через до рН регистров как нейтральные.
  2. Распустить PEG17-bl- PPS35-ш полимерные и гидрофобных грузов в ТГФ (раствор 1 покушение).
    1. Вес 20 мг PEG17-bl- PPS35-SH в 1,5 мл трубку.
    2. Добавить гидрофобные красители (например,дии, ГСИ), лекарств (например,rapamycin), или другого груза.
      Примечание: Груз может быть сухой, или растворенных в воде смешивается растворитель, предпочтительно ТГФ. Если груз нерастворимый в ТГФ или функцию DMF, другой воды водорастворимых растворителей может использоваться, но редко, как полимер, вряд ли будет растворимые. Количество груза, который может быть загружен зависит от свойств груза себя (например, молекулярная масса, гидрофобность, их пространственной соображения) и следует изучить на основе case-by-case11,12.
    3. Добавьте 500 мкл, 100% ТГФ полимера и грузов, вихревой энергично распустить.
  3. Растворите гидрофильные грузов в водном буфера (решение 2 покушение). Для этого Растворите гидрофильные грузов загружаться в полимерные везикулы в 500 мкл водный буфера (например, фосфат амортизированное saline, чистая вода и т.д.), при необходимости.
  4. Добавьте буфер в водохранилище.
    1. Добавьте 2,5 мл водного буфера (например, 1 x фосфатный буфер) выбора подходящего размера водохранилище (например, флакон сцинтилляционные стекла 20 мл). Место водохранилище под смеситель CIJ, таким образом, что отток из смесителя непосредственно входит в водохранилище.
  5. Загрузить покушение решений в отдельных 1 мл пластиковых одноразовых шприцев.
  6. Затрагивают решения друг против друга одновременно формирования наноструктур и загрузить их с полезными данными.
    1. Вставьте Luer-lock адаптеры в верхней части смесителя CIJ шприцы.
    2. В единый, гладкая и быстрое движение отпустите обе шприцы одновременно и с одинаковой силой.
      Примечание: Если выполнение нескольких последовательных impingements, сначала собирают отток в пустое водохранилище.
    3. (Необязательно) Выполните несколько impingements. Нарождающейся наноструктурированных разделенной между двумя шприцы и повторите шаги 2.6.1-2.6.2 до 4 раз.
    4. Собирать отток в водные заполненные буфера водохранилище, подготовленный в 2.4.1 и осторожно перемешать, чтобы обеспечить смешивания.
  7. Удаление выгрузке груза и органических растворителей.
    1. (Вариант 1) Dialyze nanocarrier формулировка же водный буфер, используемый для ударов и в резервуаре, с помощью трубы соответствующие МВт отсечки для по крайней мере 24 часа с по крайней мере 2 буфера изменений. Это может быть выполнено при комнатной температуре.
      Примечание: Nanocarriers будет удерживаться трубки с МВт отсечки < 100000 кДа и потенциально могут быть сохранены, а выше предохранители. Этот параметр сохраняет стерильность при выполнении в BSC, с использованием стерильных буфера.
    2. (Вариант 2) Фильтр разработки через размер исключение или обессоливания/буфера обмена столбца (например, Sepharose 6B) с помощью 1 x PBS как водный буфера.
      Примечание: Этот вариант сохраняет стерильность при выполнении в BSC со столбцом, который был тщательно стерилизованные.
    3. (Вариант 3) Удаление летучих органических растворителей, с использованием вакуумной сушки на ночь.
    4. (Вариант 4) Фильтр разработки, с помощью системы фильтрации тангенциальном потоке с помощью фильтра 50-100 кДа на 20-60 мл/мин скорость потока для 15 минут до 1 часа, в зависимости от молекулярной массой том груза очищенного от (больших грузов займет больше времени).
  8. (Необязательно) Концентрат nanocarrier разработке.
    1. (Вариант 1) Концентрат с помощью системы концентратор спин (например, спина столбец с МВт отсечки > 100000), которые используются как описано изготовителем.
      Примечание: Nanocarriers может потребоваться высокомобильна между спинами и могут потребовать количество спинов сконцентрировать вплоть до нужного тома. Концентрация спин может уменьшить стерильности nanocarrier составов.
    2. (Вариант 2) Уменьшите громкость с помощью вакуумной сушки.
      Примечание: Изменение объема трудно контролировать в этих условиях, и необходимо позаботиться о том, поддерживать осмолярности до и после концентрации.
  9. Хранить nanocarriers на 4 ° C для недель до месяцев. До использования после хранения, кратко Вортекс nanocarrier составов.

3. охарактеризовать Nanocarrier составов

  1. Измерить эффективность загрузки
    1. Если груз флуоресцентные или сильно поглощает при данной длине волны за пределами 260-450 Нм, измерения флуоресценции/поглощения с использованием fluorimeter/спектрофотометра.
      Примечание: PEG -bl- PPS сильно поглощает из 260-310 Нм и polymersome составов поглощать из 310-450 Нм, которые могут осложнить количественного определения грузов, который поглощает на аналогичные волны.
    2. Если груз поглощает в диапазоне 260-450 нм и гидрофильные, нарушить PEG -bl- PPS наноструктур, добавив 25 мкл формулировки равным объемом 1% H2O2 или 1% тритон X-100 и впоследствии разделения и различия груза от поглощения полимера через высокопроизводительный жидкостной хроматографии (HPLC) с помощью столбца размер исключения совместимы с водной буферов (например, столбец Sepharose 6B) 11.
    3. Если груз поглощает в диапазоне 260-450 нм и растворяется в ТГФ или функцию DMF, lyophilize разработки путем замораживания 100 мкл в пластиковую трубку 1,5 мл-80 ° c на ночь. Затем поместите трубку в стеклянные вакуумные контейнер и место на лиофилизатор. Позвольте 24 часа для лиофилизации происходят и впоследствии повторно растворяют в 50 мкл до разделения и обнаружения через ВЭЖХ ДМФ или ТГФ.
  2. Мера nanocarrier размер и морфология
    1. Используйте динамическое рассеяние света (DLS)11 или наночастиц, отслеживания анализа13 измерить размер nanocarrier.
      Примечание: Nanocarriers формируется от PEG17-bl- PPS35-SH ожидается имеют средний диаметр между 100-200 Нм, с полиизопрена индекс < 0,3.
    2. Определите nanocarrier морфологию с использованием криогенных передачи электронной микроскопии (cryoTEM)14.
      Примечание: Nanocarriers формируется от PEG17-bl- PPS35-SH ожидается полимер везикулы (polymersomes) с четко заметной полимерные мембраны и основном сферической формы.
  3. (Необязательно) Испытания составов для эндотоксинов
    1. (Вариант 1) Использовать на основе ячеек пробирного наличие эндотоксинов, например, НЕОБРАБОТАННЫЕ синие клетки или клетки голубой TLR4 ГЭС (см. Таблицу материалы), как описано изготовителем, в либо количественные или качественные assay для липополисахаридов (LPS)13 .
    2. (Вариант 2) Используйте комплект пробирного15 Limulus Lysate амебоцит (Лал), как описано изготовителем.

4. Изготовление высокоскоростной шприцевый насос для ППП

  1. Изготовления компонентов пользовательского инструмента.
    Примечание: 3D модели для обработки всех пользовательских частей приводятся в дополнительных материалах.
    1. Машины многослойный инструмент шасси с ¾" акриловые листы и собрать (см. Дополнительные файлы 1-5).
      Примечание: Акрил имеет плохой химической стойкостью. Если инструмент будет использоваться с суровой растворители, машина базы из металла, считается подходящим для приложения.
    2. 3D печать части с напечатаны с полилактид (НОАК) пластика.
      1. Печать шприц высылки (SE) 2-часть аппарата: SE часть 1 - блок заднего FNP Холдинг перевозки (Рисунок 5F, серый часть; Дополнительный файл 6) и SE часть 2 - фронт высылки руководство (Рисунок 5F, черная часть; Дополнительный файл 7). Смотрите Дополнительные 2 файла схемы.
      2. Печать инфракрасный датчик брекеты (Рисунок 5I, черные ящики; Дополнительные файлы 8 и 9).
      3. (Необязательно) Печатать фигурную скобку поршень двойного шприца.
  2. Закрепите инструмент шасси слои вместе с шестигранные болты М5 и добавить резиновые ножки на базу.
  3. Настройте одноплатный компьютер с операционной системой GNU/Linux 8.0 Raspbian (Джесси) (основанный на Linux Debian).
    Примечание: Программное обеспечение для работы инструмент доступен по запросу. Инструмент программное обеспечение исходный код доступен по запросу. По получении архивный файл, загрузите все зависимости, указанные в файле README. Это программное обеспечение включает в себя простой графический пользовательский интерфейс, который позволяет контроль над прибором, включая основные параметры запуска (скорость, направление и т.д.). Пользователям предлагается расширить существующий исходный код и пользовательские модули программы специально для использования в своих собственных экспериментов. Все программное обеспечение было написано с использованием Python 2.7.12 и в настоящее время не совместим с Python 3. ИРЦ, PicoBorgRev, kivy и мультипроцессорных модулей используются. Файл README содержит подробную информацию о лицензии на распространение программного обеспечения.
  4. Установите 24 V щеткой двигатель постоянного тока (Рисунок 5A) и точности слайд (4,5"(114,3 мм) инсульта; 1,27 мм винт привести) (рис. 5 c).
    Примечание: 24 V DC мотор, используемый здесь имеет об/минМакс, яМакси крутящий момент полной нагрузки 4252 RPM, 4,83 A и ~0.2 N * м, соответственно.
    1. (Необязательно) Место прокладки под мотор, чтобы ослабить вибрации во время работы.
      Примечание: Рекомендуется, что 2-3 мм толщиной резиновый коврик вырезать в соответствии с размерами автотранспортные перевозки инструмента базы.
    2. Смонтируйте точности слайд к основанию инструмента.
      1. Временно удалите стержень с резьбой.
      2. Гора слайд с помощью двух винтов плоский #8-32.
    3. Гора тока точность слайд с помощью винта луч муфты (1-1/4" длина) содержащий 6/16" и 1/4" диаметр отверстия.
      Примечание: В зависимости от толщины акрилата для обработки подложки документа, оболочки могут быть необходимы для уровня Валы мотора и точность слайд.
  5. Соберите платформы высылки из металлических пластин и L-образный уголок фигурные (рис. 5 d). Смонтировать недрагоценных металлов платформу скользящей платформы (прилагается к резьбовой стержень) с помощью винтов #6-32. Смотрите слайд схема точности, предоставленного изготовителем для получения информации относительно установки ограничений.
  6. Соберите шприц высылки системы установки.
    1. Прикрепите линейных перемещений Подушка блоки (монтажные платформы + подшипник линейного движения) на M8 хромированной нержавеющей стали рельсы (параллельные стальные рельсы можно легко наблюдается на рис. 5).
    2. Рельсы поток через Линейная вал руководство/поддержка и зафиксировать рельсы. Используйте три направляющие на железной дороге. Гора SE частей 1 и 2 на подушки блоков с помощью винтов M4.
    3. Свободно присоединиться к SE частей 1 и 2 с шестигранные болты М8. Настройте расстояние между SE часть 1 и 2 с винтовой пружины сжатия охватывающих каждый болт которые закреплены между двумя внутрь облицовки нейлон втулки (см. Рисунок 5F). Смонтируйте эти втулки на наружной поверхности SE часть 1 и SE часть 2.
  7. Провод цепи (см. Рисунок 6 для основной схемой)
    1. Подключите контроллер двигателя к I2C/ПДД, 3,3 В и GND булавки одноплатный компьютер.
    2. DC мотор терминалов подключиться к M и M + блоков платы контроллера двигателя. Подключите 24 V, 2,5 A источник питания (Рисунок 5B) V + и GND блоков контроллер двигателя (контроллер помещены в поле простой электроники в окончательный дизайн, Рисунок5 H).
    3. Подключите 3х3 и 5V Контакты управления двигателем Совета к соответствующим контактам на одноплатный компьютер. Подключение контактов SDA и SCL мотор контроллера к контакты 3 и 5 одноплатный компьютер, соответственно.
      Примечание: Команды выдаются двигатель постоянного тока от одноплатного компьютера через контроллер двигателя. Скорость двигателя контролируется путем регулирования напряжения через мотор терминалами через широтно-импульсной модуляции. В этом случае максимальный текущий проходит через 24 V DC мотор (полной нагрузки тока: 4.83 A) ограничивается 2,5 А блок питания 24 V. Рекомендуется, что моторные цепи подключен через нормально закрытый (NC) аварийной остановки (Рисунок 5J). Это предоставляет средства для нарушить моторные цепи для включения основных аварийной остановки операции.
    4. Подключение передних и задних инфракрасные датчики (Датчики цифровые расстояния, Рисунок 5I) контакты RPi GPIO 24 и 23, соответственно.
      1. Маршрут датчик проводки через трубопроводы в базе инструмента.
        Примечание: ИК-датчики, датчики движения бесконтактный брейк луча с дальность обнаружения 2-10 см.
      2. 4.7.4.2 snap проводной ИК-датчики в 3D-печати инфракрасный датчик брекеты (Рисунок 5I, черные ящики) и смонтируйте на базе инструмента. Когда правильно установить в скобу, датчик лицо следует торчат наружу из 14 x 7 мм прямоугольные открытие скобу.
        Примечание: эти брекеты датчик может быть временно установлен с помощью Velcro или клей (временные крепления полезно надлежащим образом настроить и оптимизировать размещение ИК сенсора). Кроме того постоянно смонтируйте путем сверления отверстий небольшой путеводитель в базе инструмента и брекеты винтами м2.
    5. Подключите сенсорный ЖК-дисплей 7» на 5V, GND и отображать последовательный интерфейс (DSI) булавки одноплатный компьютер. 7" ИРЦ и ЖК-дисплей Ассамблеи показан на рисунке 5 g.

5. изготовить Polymersomes через ППП, с использованием по индивидуальному заказу высокоскоростной шприцевый насос

  1. (Вариант 1) Используйте режим автоматического запуска.
    1. Выберите Автоматически запускать из главного меню. Система предложит пользователю разрешить мотор автоматически позиционировать платформы высылки шприца в начало слайд точности. Убедитесь, что путь в спереди и сзади металлическую пластину ясно перед.
    2. Загрузите 1 мл пластиковых шприцы, как описано в разделе 2.5 и гору шприцов на женщин Luer разъемы CIJ смесителя. Загрузить CIJ смесителя (с шприцы прилагается) в прямоугольной открытия задней высылки перевозки (см. Рисунок 5E).
    3. Установите нужную скорость мотора (единицы: об/мин), используя ползунок в GUI (см. Примечание ниже для важных соображений). Оптимальная скорость двигателя будет зависеть от конкретного насоса и установки, но должны обеспечить скорость потока по крайней мере 1 мл/сек для CIJ микшер каналов измерений здесь.
      Примечание: Учитывайте следующее во время настройки скорости потока. В вертикальной конфигурации ручным FNP, реактивы, изгоняют из шприцы со скоростью ~ 1 мл/сек, но может быть сильно варьирует, когда ручные. Это просто скорость потока через шприц ствол, который контролируется скорость, с которой пользователь перемещает поршень шприца. Обратите внимание, что стоимость 1 мл/сек не ссылаясь на скорость потока выхода из меньшего диаметра сопла. На выше указанные размеры канала, ~ 1 мл/s следует сохранить для обеспечения соответствующей Рейнольд номер для турбулентного перемешивания10. Различные расхода может использоваться до тех пор, как диаметр канала корректируется соответствующим образом поддерживать число Рейнольдса, которое поддерживает турбулентных условиях. Шприц поршни выдвигаются перпендикулярно металлической пластиной, который движется вдоль слайд-высокоточный алюминиевый в сочетании с 24 V, щеткой двигатель постоянного тока. В этой конфигурации, скорость потока максимальный ствол находится под влиянием ряда факторов, в том числе (1) максимальная скорость мотора (4252 об/мин) и ведущий винт точности слайда (1,27 мм), который соединен к мотору вала (2 крутящего момента двигателя (~0.2 N * м л-полный oad крутящего момента), которая необходима для преодоления сопротивления потока (3) взносов обратного давления жидкости вступления и выхода из CIJ смеситель и (4) сила шприцы используются (пользователям должны быть внимательными сил, действующих на шприцы и использовать шприцы соответствующие силы). Что касается пункта (2), когда увеличение потока скорость достаточно крутящий момент требуется избежать срыва двигателя при сохранении устойчивый высылки под увеличения противодавления. Ствол расхода – чтобы проиллюстрировать баррель поток оценить, что вышеупомянутые системы можно достичь, рассмотрим случай, когда FNP выполняется с использованием реагентов, загружаются в два один миллилитр шприцы. Для достижения 1 мл/сек потока через ствол, двигатель должен заранее металлические плита расстояние определяется Длина плунжера (~ 68 мм для типичного один мл шприц) в одну секунду. Условии 1,27 мм свинца винт точности слайда, следует, что на 4252 об/мин двигатель постоянного тока способны продвижении платформы до ~ 90 мм/с (71 rev/s * 1,27 мм/rev). Это соответствует скорости потока баррель ~1.3 мл/сек, что превышает целевой показатель 1 мл/сек.
    4. Перед запуском инструмента, проверить систему, чтобы убедиться, что путь платформы ясно от препятствий, и что передние и задние датчики близости ИК подальше от помех (ИК-датчики являются небольшие черные ящики вблизи точности слайд терминалы; Смотрите Рисунок 5I). Также убедитесь, что капиллярной трубки выходе из смесителя CIJ направляется в соответствующую коллекцию контейнер (ex: стеклянный стакан, и т.д.).
    5. Высылать реактивы от шприцы и в смеситель CIJ, нажмите на кнопку Run в интерфейсе программного обеспечения.
  2. (Вариант 2) Использование ручной режим выполнения. Обратитесь к Автоматический режим запуска направлениях выше и отмечаем следующее изменение к шагу 5.1.5: нажмите кнопку вперед нажата непрерывно вплоть до завершения выполнения (то есть, платформе авансов в ответ на событие на пресс и мотор остановится в ответ на событие по релиз).
  3. (Вариант 3) Использование ручной платформа позиционирования режиме; Этот режим позволяет пользователям позиции платформы путем запуска двигателя при низкой скорости (20% мощности) в ответ на кнопки вперед и назад на интерфейс программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представили простой протокол для разработки nanocarriers способен загрузки гидрофильные и гидрофобные грузов, которые являются безопасными для мыши в естественных условиях и нечеловеческих приматов администрации11,13. Мы также включили подробный протокол для синтеза полимеров, используемых в результаты нашего представителя, наряду с описанием для изготовления пользовательского инструмента для механически контроли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставили подробные инструкции для быстрого изготовления polymersomes с помощью PEG17-bl- PPS35-SH, как сополимер диблок. Пузырчатка polymersomes являются основной совокупных морфологии, собрались на это соотношение гидрофильные PEG и гидрофобных PPS блок молекулярный вес. Когда затрагивает несколько раз, они имеют диаметр и полиизопрена, который соответствует polymersomes, прессованные через 200 Нм мембрану после того, как формируется через тонкий слой гидратации. Таким обра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем поддержку персонала и инструментария от фонда структурной биологии в северо-западном университете. Поддержке о.в. Лурье всеобъемлющем Рак центр из Северо-Западного университета и Северо-Западного университета структурной биологии зал признается. Детектор прямого электронов Гатан K2 был приобретен с средства, предоставленные Чикаго биомедицинских консорциум с поддержкой от Searle фондов в Чикаго сообщества доверие. Мы также благодарим следующих учреждениях Северо-Западного университета: междисциплинарный научный центр поверхности Кек, фонд структурной биологии, биологической визуализации объекта, центр Расширенный молекулярной визуализации и аналитические Бионанотехнология оборудование ядро. Это исследование было поддержано 1DP2HL132390 национального научного фонда Грант 1453576, национальные институты здравоохранения директор новой награды новатор-01, Центр восстановительной наномедицины Катализатор премии и 2014 Маккормик Катализатор премии. ПДД частично поддержали NIH лектор биотехнологии обучения Грант T32GM008449.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB EditionCanaKitUPC 682710991511
Линейная подшипниковая платформа (маленькая) - диаметр 8 ммAdafruit1179
Линейное перемещение Вал 8 мм, длина 330 мм, хромированный, закаленный корпус, метрическийкомплект VXB11868
Линейный рельсовый вал Направляющая/опора - 8 мм ДиаметрAdafruit1182
Прецизионный слайд с ручным положением 4,5 дюйма Ход, грузоподъемность 15 фунтовMcMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC моторIron HorseMTPM-P10-1JK43
Официальный Raspberry Pi Foundation 7" Сенсорный ЖК-дисплейRaspberry PiB0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Усовершенствованное управление двигателем для Raspberry PiPiBorgBURN-0011
Pololu Carrier с острым GP2Y0D810Z0F цифровым датчиком расстояния 10 смPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A Комплект винтовой балочной муфты, полированный алюминий, дюйм, диаметр отверстия 5/16 дюйма, диаметр отверстия B 1/4 дюйма, диаметр 1 дюйм, длина 1-1/4 дюйма, номинальный крутящий момент 44 фунт-дюймаRulandPSR16-5-4-A
Монометиловый эфир полиэтиленгликоляSigma Aldrich202495
МетансульфонилхлоридSigma Aldrich471259
толуолSigma Aldrich179418
толуол, безводныйSigma Aldrich244511
триэтиламинSigma AldrichT0886
Celite 545 (Диатомовая земля)Sigma Aldrich419931
ДихлорметанSigma Aldrich
Диэтиловый эфирSigma Aldrich296082
N,N-диметилформамид, безводныйSigma Aldrich227056
Карбонат калияSigma Aldrich791776
Тиоуксусная кислотаSigma AldrichT30805
ТетрагидрофуранSigma Aldrich360589
Алюминий оксид, нейтральный, активированный, Brockmann ISigma Aldrich199974
Раствор метоксида натрия, 0,5 М в метанолеSigma Aldrich403067
Сульфид пропиленаSigma AldrichP53209
Уксусная кислотаSigma AldrichA6283
МетанолSigma Aldrich320390
Раствор гидроксида натрия 1,0 NSigma AldrichS2770
Вода без эндотоксинаGE Healthcare LifeSciences SH30529.01
Бумажные полоски pHFisher Scientific13-640-508
Не содержащие эндотоксинов Dulbecco's PBSSigma AldrichTMS-012
Боросиликатные стеклянные сцинтилляционные флаконыFisher Scientific03-337-4
1 мл цельнопластиковый шприцThermoScientific S75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
Колонка жидкостной хроматографииSigma AldrichC4169
Смеситель CIJ, HDPECustom Triton
X-100Sigma AldrichX100
Раствор перекиси водородаSigma Aldrich216763
HEK-Blue hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Blue CellsInvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL AssaysLonzaN183-125
320269

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
  4. Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
  5. Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
  6. Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
  7. O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
  8. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  9. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302(2003).
  10. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  11. Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
  12. Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
  13. Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
  14. Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624(2018).
  15. Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
  16. Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
  17. Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
  18. Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Flash NanoprecipitationPolymer VesiclesBioactive Protein LoadingImmunostimulant DeliverySynthetic NanocarriersHigh Speed Syringe PumpConfined Impingement JetsDynamic Light ScatteringCryogenic Transmission Electron MicroscopyTangential Flow Filtration

Похожие статьи