Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Яичников культуры ткани для визуализации явлений в яичнике мыши

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57794

⸱

19 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Aichi Medical University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Maternal and Perinatal Medicine, Nagoya University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Яичников культур тканей могут использоваться в качестве модели развития, овуляции и фолликул атрезии фолликулов и указать механизмы регулирования динамических процессов, яичников.

Аннотация

Периодически млекопитающих женщины овуляция почти постоянное количество яйцеклеток во время каждого цикла эструса. Для поддержания таких регулярность и периодичности, регулирование происходит на уровне гипоталамо гипофизарно гонадной оси и на развитии фолликулов в яичниках. Несмотря на активные исследования механизмы развития фолликула не ясны из-за нескольких этапов от активации неактивных первичных фолликулов к овуляции и из-за сложности правил, который отличается на каждом этапе фолликулярной. Для изучения механизмов развития фолликула и динамика фолликулов на протяжении всего цикла эструса, мы разработали модель яичника культуры ткани мыши, который может быть использован для наблюдения развития фолликула с помощью микроскопа. Разработки систематической фолликула, периодических овуляции и атрезии фолликулов могут быть воспроизведены в модели искусственного яичника, и в условиях культуры можно модулировать экспериментально. Здесь мы продемонстрировать полезность этого метода в изучении механизмов регулирования развития фолликула и других явлений, яичников.

Введение

Женщины мыши яичники содержат несколько тысяч фолликулов1, и периодические овуляции созревает примерно десять яйцеклеток на каждый цикл эструса. Фолликулов, подразделяются на несколько стадий развития: Братство пресвитериан, начальное, среднее, полостная и Graafian фолликулов, в зависимости от формы гранулезы сотовой слоя, окружающих каждый ооцитов. Большинство первичных фолликулов неактивны, и некоторые из них активизируются и превращаются в первичных фолликулов на каждый цикл эструса2. После этапа вторичных фолликулов развития фолликула регулируется главным образом гонадотропинов, фолликулярная стимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ). Однако изначальное и первичных фолликулов развития независимо от гонадотропина, и регулятивных механизмов, которые регулируют эти этапы остаются плохо inderstood3,4,5. Помимо факторов роста и гормонов изначальное и первичных фолликулов регулируется взаимодействием фолликулов6,7. Таким образом мы выступали анализ динамики фолликула в мыши тканей яичника и расследование связанных регулирующих механизмов, с помощью яичников культур тканей8,9,10.

Здесь мы представляем два методы модели яичников культуры ткани. Первый используется для анализа развития фолликула путем измерения фолликулярной областей, а вторая используется для изучения механизм регулирования во время раннего развития фолликула от изначального вторичных фолликулов сцену с трансгенных мышей. Для анализа развития фолликула мы главным образом используется яичников 4 - неделя старый самок мышей, потому что они позволяют легко визуализации фолликулов. Чтобы побудить периодических овуляции и модели в естественных условиях развития фолликула, мы воспроизводится LH всплеск и наблюдаемых овуляции, атрезии фолликулов и секрецию эстрадиола в условиях культуры ткани. Образы культивировали яичников были захвачены, и отслеживания изменений в области фолликулярной были проанализированы процессы развития фолликула. Однако в светлых местах микроскопии анализа, неясным различие между изначальным и начале первичных фолликулов. Таким образом, мы разработали метод для обнаружения малых фолликулов и различие между изначального, первичной, и вторичных фолликулов в культивированный яичников тканей с помощью Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 и яичников трансгенных мышей R26-H2B-mCherry дней 0 и 4 после рождения11. Oog1 выражение, обнаруживаемая в яйцеклеток после вступления в мейоз и постепенно увеличивается с развития фолликула, позволяя наблюдения за переход от изначального первичных фолликулов с помощью промежуток времени изображения культивировали завязи ткани11 ,12. Хотя Морфологические методы были использованы для изучения факторов, которые активируют изначальное спящих фолликулов13,14,,1516, является развитие физиологической фолликулов в яичниках трудно обнаружить, и воздействия различных факторов остаются uncharacterized. Нынешние методы культуры были разработаны для устранения этого недостатка в реальном времени анализ целевых факторов.

В настоящем исследовании мы отслеживаются фолликулярной развития методом покадровой изображений и охарактеризовал процесс развития фолликула. Наши новые методы предлагают беспрецедентный инструмент для изучения физиологии яичников.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Мышей были размещены в экологически контролируемой комнате в 23 ±1 ° C с 12 h свет/12 h темные циклом. Уход за животными протоколы и эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами для экспериментов животных медицинского университета Айти и были одобрены действующий Комитет использование и уход за животными.

1. Подготовка питательной среды и блюда

  1. Для подготовки основных питательной среды, добавьте плода бычьим сывороточным (ФБС, 5% v/v), ФСГ (100 mIU/мл), LH (10 му/мл) и пенициллин стрептомицином (пенициллин, 100 ед/мл; этамбутол, 100 мг/мл) для минимальных основных средних альфа (MEM-альфа) и перемешать в 50 мл трубки.
    Примечание: Общий объем требуемых культуры средств массовой информации варьируются от экспериментов, но 1 мл питательной среды обычно достаточно для 3,5 см стекло дно культуры блюд.
  2. Налейте 1 мл аликвоты смешанные культуры среды в 3,5 см стекло дно культуры блюда и задать место 30 мм ячейку культуры вставок в блюда. Предварительно теплой СМИ и блюда в инкубаторе (5% CO2 и 37 ° C).

2. подготовка ткани яичников

  1. Предварительно теплой фосфат буфер солевой раствор (PBS) (−) и MEM-альфа, содержащих 5% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл в инкубатор (5% CO2 и 37 ° C).
    Примечание: Около 3 мл аликвоты PBS (−) в яичнике достаточно для использования во время завязи вскрытия, и 1 мл аликвоты MEM-альфа, являются достаточными для переходных хранения одного яичников блюдах 3,5 см.
  2. Акцизный яичников с 4 - неделя старый самок мышей ICR (названный после Институт исследования рака) и отделки тканей, окружающих яичника, используя ножницы и щипчики под стереоскопическим микроскопом. Заповедник удалены яичники в среде культуры (см. шаг 2.1) до использования.
    1. Место одного яичников на фильтровальной бумаги, смоченной в предварительно разогретую PBS (−) (см. шаг 2.1) и нарезать на 4 части, используя микротом лезвия под стереоскопическим микроскопом.
      Примечание: Яичники 4 - неделя старый мышей МГП являются около 2 мм в диаметре. Количество штук зависит от размера яичников; Однако, около 500 мкм толстые куски позволяют надлежащего фолликула наблюдений (в части толще, чем 500 мм, уменьшается ткани прозрачности; в куски тоньше, чем 500 мм, разбиваются и потерял много полостная фолликулов).
    2. После вскрытия поместите нарезанный завязи образцов в подогретым культуры среднего блюдах 3,5 см (см. шаг 2.1).

3. яичников Культура ткани

  1. Падение приблизительно 0.5 мкл питательной среды на кусочки тканей яичника на вкладыше культуры клеток где тканей яичника будет задать с помощью микропипеткой.
  2. Поместите каждый нарезанный образец в каплю питательной среды на вставки культуры клеток с помощью пинцета.
  3. Культура тканей яичника в 5% CO2 при 37 ° C.
  4. Замените питательной среды свежие подогретым среднего каждые 2 дня.
    Примечание: Расписание для среднего изменения культуры секции завязи от 4 - неделя старый ICR мышей представлена на рисунке 1.
    1. Чтобы воспроизвести всплеск LH, относиться к культивировали 4 - неделя старый ICR мышей яичников с носитель, содержащий 100 му/мл ФСГ и ЛГ для 12 h каждые 4 дня (рис. 1).

4. Микроскоп изображения культивировали яичников

  1. Начать изображений культивировали яичников после 1 день когда осесть на вставки культуры клеток ткани и выполнять анализ конфокальный или инвертированный микроскоп интервалы 24 h разрешить достаточного роста фолликула между моментами времени.
    Примечание: Confocal микроскопии превосходит Перевернутый микроскопии для наблюдения фолликулов в яичниках весь искусственный.

5. промежуток времени визуализации культивировали яичников

  1. Оптимизируйте промежуток времени визуализации условия, включая лазерной интенсивности и длительности выдержки, для визуализации системы (таблица 1).
    1. Выберите парные яичники образцов из одного мышей для использования в качестве лечения и управления группами. Различаются лазерного света и времени экспозиции для достижения лучших изображений (Таблица 1).
    2. Сравните рост фолликулов при условии каждой культуры путем измерения фолликул областей изображения образцов управления интервалом 24 ч и в промежуток времени изображений образцов (см. шаг 6). Одновременно подсчитать количество овуляцией яйцеклеток в каждом яичнике и выбрать оптимальный промежуток времени визуализации условия.
  2. Захват изображения интервалом 30 мин, с использованием покадровой тепловизионные системы при определенных условиях (Таблица 1).

6. фолликула роста анализ

  1. Для анализа развития фолликула, измерения фолликул областей в захваченные изображения с помощью ImageJ программного обеспечения (http://resbweb.nih.gov/ij/).
    1. Первоначально Установите масштаб изображения, нажав кнопку «Задать шкалу» под «Анализировать» в панели инструментов. Введите длину стороны образа и соответствующее количество пикселей в пустые поля «Известный расстояние» и «Расстояние в пикселах», соответственно.
    2. Нажмите кнопку «Свободные руки» в панели инструментов и наметить фолликулов в захваченных светлые области изображения.
    3. Нажмите кнопку «Мера» под «Анализировать» в панели инструментов.
      Примечание: Если другие данные измерений, нажмите кнопку «измерение» под «Анализировать» в панели инструментов и установите соответствующие флажки в списке.

7. анализ развития фолликула, используя трансгенных мышей

  1. Соберите яичников от послеродовых дней 0 и 4 (P0 и P4) женский трансгенных мышей содержащие трансгенов Oog1pro3.9 и R26-H2B-mCherrи культуры на вставки как описано в разделе шаги 1.1 – 3.2, за исключением не фрагмент P0 и P4 яичников.
  2. Замените питательной среды свежий, подогретым среднего блюдах 3,5 см в инкубаторе, содержащей 5% CO2 при 37 ° C каждые 2 дня.
    Примечание: Концентрация ЛГ в среде культуры P0 и P4 яичников могут оставаться постоянной, поскольку LH всплески происходят не в P0 и P4 мышей.
  3. Набор Микроскоп, чтобы визуализировать только AcGFP1-позитивных первичных фолликулов в яичниках культивировали P4 (Таблица 1).
    Примечание: Только Изначальное и первичных фолликулов в яичниках женщины мыши P4.
  4. Захват изображения культивировали Р0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry трансгенных мышей яичников интервалом 30 мин с использованием параметров, используемых для P4 яичников (см. шаг 5.2).
  5. Отслеживать и анализировать развитие фолликула с использованием сигналов AcGFP1 и H2B-mCHerry.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 показывает протокол о внесении изменений в средствах массовой информации во время яичников культуры ткани. После этой программы, ICR 4 week-old мышей яичники были культивировали и образы интервалы 24-h, с помощью конфокальной микроскопии (рис. 2). В культуре тканей яичника на 3 недели наиболее полостная и вторичных фолликулов были выродились, атрезии фолликулов и некоторые были овуляцией (Рисунок 2<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы разработали две новые методы для изучения развития фолликулов в яичниках мыши. Первый метод предполагает культуры тканей нарезанный яичников взрослых мышей, следуют анализ развития фолликула, а вторая включает в себя использование покадровой imaging для визуализации раннего развития фолликула на этапе гонадотропин независимые. Ранее мы использовали нынешний метод культуры тканей яичника оценить влияние лейкемия ингибирующего фактора и прогестерон фолликула развития8,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим д-р Naojiro Minami (Университет Киото) за предоставление Oog1pro3.9 мышей. Это исследование было поддержано Nitto фонда и JSP-страницы (KAKENHI # JP15H06275).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фолликулостимулирующий гормон из гипофиза человекаSIGMAF4021
Лютенизирующий гормон из гипофиза лошадейSIGMAL9773
Раствор пенициллин-стрептомицинаWako Pure Chemical Industries168-23191
MEM a, GlutaMax, без нуклеотидовThermo Fisher32561037
Стеклянная нижняя чашкаMatTekЧашка P35G-0-10-C35 мм, покровное стекло No 0, диаметр стекла 10 мм
Вкладыш для культивирования клетокклеток Merck MilliporePICM0RG50Диаметр: 315 мм, размер пор: 0,4 мм, материал: гидрофильная чашка для
клеточных культур PTTE 3,5 смGreiner Bio-One627160
50 мл / центрифужная пробирка с тройным уплотнением крышкиIWAKI2345-050
Низкопрофильные одноразовые лезвия 819Leica14035838925
LSM 710ZeissКонфокальный микроскоп
CellVoyager, CV1000Yokogawa Electric CorporationЦейтраферная съемка
BZ-X700KEYENCEЦейтраферная съемка
Carl

Ссылки

  1. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  2. Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
  3. Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
  4. Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
  5. Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
  6. Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
  7. Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
  8. Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).
  9. Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
  10. Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
  11. Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686(2013).
  12. Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
  13. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
  14. Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
  15. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
  16. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
  17. Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  18. Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
  19. Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
  20. Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ImageJmCherry
Яичников культуры ткани для визуализации явлений в яичнике мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.