Method Article

Эффективное очищение и LC-MS/MS-на основе анализа развития для десяти-одиннадцати транслокации-2 5-метилцитозин Dioxygenase

DOI:

10.3791/57798

⸱

October 15th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Missouri-Kansas City

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для эффективной одного шага очистки активных непомеченным человека десять-одиннадцать транслокации-2 (TET2) 5-метилцитозин dioxygenase с помощью ионообменной хроматографии и его анализа, с помощью жидкой массы хроматографии тандем спектрометрия (LC-MS/MS)-подход на основе.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпигеномные транскрипции регулирования, при посредничестве 5-метилцитозин (5мс) играет решающую роль в эукариотических развития. Деметилирования этих эпигенетических меток осуществляется путем последовательного окисления десять-одиннадцать транслокации dioxygenases (TET1-3), после ремонта glycosylase зависимых базовых иссечение тимин ДНК. Инактивация гена TET2 из-за генетической мутации или других эпигенетические механизмы связаны с плохим прогнозом у больных с различными рака, особенно кроветворных злокачественных опухолей. Здесь мы Опишите эффективной одного шага очистки ферментативно активной непомеченным человека TET2 dioxygenase с помощью хроматографии катионного обмена. Далее мы предоставляем жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS) подход, который можно отделить и количественно четыре обычных оснований ДНК (A, T, G и C), а также четырех баз модифицированных цитозином (5-метил, 5-гидроксиметил, 5-формил и 5-карбоксильных). Этот assay может использоваться для оценки деятельности дикого типа и мутантов TET2 dioxygenases.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C5 позиция баз цитозина внутри CpG dinucleotides является преобладающим метилирования сайт (5mCpG) в млекопитающих геномов1. Кроме того, ряд недавних исследований обнаружили обширные метилирование цитозина C5 (5мс) в не CpG сайтах (5mCpH, где H = A, T, или C)2,3. модификация 5мс служит transcriptional глушителя на эндогенных retrotransposons и Джин промоутеров3,4,5. Метилирование ДНК на 5мс также играет важную роль в инактивации Х-хромосомы, Джин импринтинг, ядерной перепрограммирования и ткани специфических генов выражение5,6,7. Метилирование цитозина с позиции C5 осуществляется methyltransferases ДНК, и мутации в эти энзимы вызывают значительные пороки развития8. Удаление следов 5мс инициируются TET1-3 5мс оксидазы9,10. Эти тет семья dioxygenases превратить 5мс 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC) путем последовательного окисления шаги11,12,13. Наконец тимин ДНК glycosylase заменяет 5fC или 5caC в неизмененном цитозин, с использованием базового иссечение ремонт путь11.

Человеческий геном TET2 была определена как часто мутировавших генов в различных гемопоэтических злокачественных опухолей, включая миелодиспластические синдромы (MDS)14,,1516, MDS-миелопролиферативных новообразования ( MDS-MPN) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), происходящих из MDS и MDS-MPN16. Уровни 5hmC модификации в костном мозге ДНК ниже у пациентов с TET2 мутации, по сравнению с теми с дикого типа (wt)-TET214. Ряд групп разработали модели мыши TET2-нокаут для уточнения его роли в нормальное кроветворение и миелоидного преобразования17,18,19,20. Эти мыши с мутациями в гене TET2 были первоначально нормальной и жизнеспособным, но проявляется различных злокачественных опухолей кроветворной, как они в возрасте вызывая их ранней смерти. Эти исследования показали важную роль, которую играют wt-TET2 в нормальные гемопоэтические дифференциации. В этих моделях мыши, гетерозиготных гемопоэтических стволовых клеток (TET2+ / СКК) и гомозиготных TET2- / - СКК были конкурентное преимущество перед СКК гомозиготных wt-TET2 в заселив гемопоэтических линии как оба TET2+ /- и TET2- / - СКК различных злокачественных опухолей кроветворной17,18. Эти исследования показывают, что haploinsufficiency TET2 dioxygenase изменяет развития СКК и приводит к гемопоэтических злокачественных опухолей.

Подобно мышей с мутациями в гене TET2, большинство больных лейкемией манифеста haploinsufficiency TET2 dioxygenase деятельности. Эти главным образом гетерозиготных соматические мутации включают рама shift и нонсенс мутации, рассеянных по всему телу гена TET2 во время Миссенс-мутации, которые являются наиболее сосредоточены в домен dioxygenase12. На сегодняшний день, маленькая характеристика wt - и мутанта TET2 сообщается в литературе главным образом из-за трудностей с производством TET2 dioxygenase и его пробирного21. Здесь мы приводим простой одношаговый очищение родной TET2 dioxygenase с помощью ионообменной хроматографии. Кроме того количественные assay LC-MS/MS был оптимизирован и используется для измерения Ферментативная активность родной TET2 dioxygenase.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. клонирование и очистки непомеченным человека TET2 Dioxygenase

  1. Клонирование человека TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) в pDEST14 назначения вектор с использованием метода участкам рекомбинации как описано22.
    Примечание: Предыдущие исследования показали, что домен dioxygenase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) TET2 C-терминал является минимальным каталитически активных доменных21,23. Для того чтобы выразить непомеченным TET2 dioxygenase домен с помощью вектора pDONR221, обуви Dalgarno и Козак последовательности были включены в вперед грунт во время ПЦР (Таблица 1).
  2. Для бактериальных трансформации, добавить 1 мкл рекомбинантных pDEST14 вектора выражения содержащие непомеченным человека TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) до 100 мкл химически сведущее Escherichia coli BL21 (DE3) клетки в 1,7 мл трубку. Храните смесь на льду по крайней мере 15 минут после теплового шока при 42 ° C за 30 s на водяной бане.
    1. Сразу же после теплового шока держите клетки обратно на льду для минимум 2 мин. После этого добавьте 250 мкл супер оптимального бульон с catabolite репрессий (S.O.C СМИ) клеток. Инкубируйте бактериальные клетки за 1 ч при 37 ° C в шейкере.
    2. После инкубации спина вниз клетки центрифугированием трубки на 9000 x g за 1 мин отменить 70% супернатанта, закупорить и растворяют гранулы в левой над средствами массовой информации.
    3. Распространение суспензию клеток на табличке агар Лурия бульон (LB), содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Инкубировать пластину для 16 ч при 37 ° C.
  3. Выберите один из изолированной колонии и инокуляции в 10 мл LB-ампициллин СМИ в 50 мл трубки. Инкубируйте трубки при 37 ° C в шейкер для ночлега. После этого используйте 100 мкл культуры из 50 мл трубки для инокуляции 100 мл LB-ампициллин средств массовой информации. Инкубировать настой при 37 ° C на шейкер на 180 об/мин и использовать его как основной культуры. Следующий день, используйте 6 мл основной культуры для инокуляции 15 колбы, каждый содержащий 600 мл LB-ампициллин СМИ. Теперь Инкубируйте 15 колбы при 37 ° C на шейкер на 180 об/мин.
    Примечание: Для проверки преобразованные клоны, выполняют ДНК последовательности или ограничение пищеварение с изолированной плазмидной ДНК.
  4. Чтобы проверить плотность бактериальной культуры, измерьте его ОД600 с помощью спектрофотометра. После того, как культура достигает плотность 0,8 в ОД600, побудить выражение TET2 белка с 300 мкл 1 IPTG М (конечная концентрация 0,5 мм в 600 мл) в каждый флакон и далее расти культуру для 16 h 17 ° c.
  5. После 16 ч передать центрифуги бутылки бактериальной культуры. Центрифуга бактериальной культуры, выражая фермента TET2 в 5250 x g 45 мин использования бактериального гранулы для TET2 очистки.
    Примечание: Выполните все оставшиеся шаги очистки белков, либо на льду или на 4 ° C.
  6. Ресуспензируйте бактериальных Пелле в 100 мл 50 мм MES (2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислота) буфер, рН 6 и sonicate для 5 × 30 s на мощность 20 с 60 s охлаждения интервалов.
  7. Спин lysate на 5250 x g 45 мин собирать супернатанта, содержащий водорастворимые фермент TET2 и пройти через 0.45 мкм фильтров перед загрузкой на ПСОК систему.
    Примечание: В этих экспериментах, фермент TET2 было весьма стабильным, но при необходимости протеазы ингибитор коктейль содержащий 1 мм benzamidine-HCl, 1 мм phenylmethylsulphonyl фторид (PMSF) и 0,5 мм 1,10 -o- фенантролиновый могут быть добавлены к ячейке lysate для предотвращения деградации TET2 фермента. Избегайте использования ЭДТА или EGTA в ингибитор коктейль, как они могут мешать следующие хроматографии катионного обмена.
  8. Пакет 30 мл сильной катионообменной смолы в столбец ПСОК. Сбалансировать столбец с 10 томов кровать стирка буфера (MES буфера 50 мм, pH 6) со скоростью 0,3 мл/мин с помощью ПСОК систему постоянного потока.
  9. Загрузить осветленный lysate на предварительно уравновешенной столбцов и промыть ∼10 кровать тома мыть буфера до тех пор, пока через поток становится ясно.
  10. Элюировать TET2 с помощью 0-100% градиент из буфера мытья Элюирующий буфер (MES буфера 50 мм, pH 6, 1 M NaCl) в 15 томах кровать следуют Холдинг на 100% Элюирующий буфер для 2-х местный томов.
    Примечание: Сбор образцов (по 100 мкл) lysate до и после загрузки наряду с все фракции элюции столбца ячейки и анализировать на 10%, урегулировании SDS-PAGE.
  11. Бассейн фракций, содержащих белок TET2, заморозить сухой, распустить фермента поддон в 10 мл воды и хранить при температуре-80 ° C.

2. 5мс окисления TET2 Dioxygenase

  1. Выполните все деметилирования реакции в трех экземплярах с 3 мкг субстрата (25-mer двойной мель ДНК, Таблица 2).
    1. Добавить 100 мкг очищенный TET2 фермента в 50 мкл буфера общая реакция, содержащий 50 мм HEPES (рН 8,0), 200 мкм FeSO4, 2OG 2 мм (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate) и 2 мм аскорбат и инкубировать при 37 ° C для 1 h21.
    2. Утолите TET2 катализируемых реакций окисления с 5 мкл 500 мм ЭДТА.
  2. После закалки TET2 реакций, подготовьте образцы для анализа LC-MS/MS, разделив ДНК от TET2 реакционной смеси с использованием oligo очистки столбцов.
    1. Добавьте 100 мкл буфера привязки oligo 55 мкл закаленном реакции.
    2. После этого добавьте в смесь 400 мкл, 100% этанола. Передайте эту смесь через столбец привязки oligo.
    3. Вымойте привязанного ДНК с 750 мкл буфера мытья и элюировать в 20 мкл воды.
  3. Дайджест изолированной ДНК с 2 единицы DNase I и 60 единиц Нуклеаза S1 при 37 ° C в течение 12 ч, для производства отдельных нуклеозидов monophosphates.
  4. После переваривания добавить 2 единицы икры кишечной щелочной фосфатазы (CIAP) в образцах и инкубировать для добавления 12 ч при 37 ° C для удаления терминала фосфатные группы из нуклеозидов monophosphates для получения нуклеозидов.
  5. Подсчитать все нуклеозидов, особенно модифицированных cytosines, используя описанный ниже метод LC-MS/MS.

3. количественные LC-MS/MS-на основе анализа развития

  1. Подготовка 100 мкм Стоковый раствор всех цитозина модифицированных нуклеозидов [5-метил 2′ Дезоксицитидин (5mdC), 5-гидроксиметил 2′ Дезоксицитидин (5hmdC), 5-формил 2′ Дезоксицитидин (5fdC) и 5-карбоксильную 2′ Дезоксицитидин (5cadC)] и нормальной ДНК баз (аденин, тимин, цитозином и гуанина) в воде ВЭЖХ класса для разработки метода LC-MS/MS.
  2. Оптимизировать параметры МС/МС нуклеозидов зависимых вливая акций решения, по одному, в масс-спектрометр со скоростью потока 10 мкл/мин в EMS режим сканирования. Оптимизировать следующие параметры: Declustering потенциал (DP), вход потенциальных (EP), столкновение потенциал клеток вход (КЭП), столкновение энергии (CE) и столкновения потенциал клеток выхода (CXP) для каждого нуклеозидов ДНК с помощью автоматизированного количественного оптимизации особенность программного обеспечения.
  3. Оптимизация параметров зависит от источника МС/МС путем инъекций 10 мкл Стоковый раствор, с использованием градиента с 25% растворителем B со скоростью потока 0,3 мл/мин где растворителя A Ацетат аммония 10 мм (рН 4,0) и растворителей B 20% ацетонитриле с 10 мм аммония ацетат (рН 4,0). Оптимизировать следующие параметры: занавес газ (CUR): 10-50, температура: 0-600 ° C, газового потока 1 (ГС1): 0-50, 2 потока газа (GS2): 0-50, Collisionally активированный диссоциации (CAD): низкий-средний-высокий, ионного распыления напряжения (IS): 4000-5500 для каждого ДНК нуклеозидов, используя руководство функция в количественных оптимизации программного обеспечения в режиме ФИА (анализ потока инъекций).
  4. Чтобы отделить все восемь ДНК нуклеозидов, выполняют жидкостной хроматографии с использованием следующих градиент: 0% растворителем B (0-2 мин), 0-20% растворителем B (2-5 мин), 20-60% растворителем B (5-9 мин.), 60-0% растворителем B (9-10 мин) и затем сбалансировать с растворителем A для 5 минут при скорости потока 0,3 Мл/мин на C18 столбца (размер частиц: 5 мкм, размер поры: 120 Å).
  5. Использование оптимальных параметров МС/МС (Шаг 3.2 и 3.3), в сочетании с вышеупомянутой жидкостной хроматографии градиента (Шаг 3.4), определить ответ линейности, предел обнаружения (LOD) и нижний предел количественного определения (LLOQ) с помощью два раза последовательного растворения 100 мкм стандартной смеси, содержащей все восемь нуклеозидов. Рисование стандартных кривых для всех восьми ДНК нуклеозидов.
  6. Выявления и количественной оценки всех нуклеозидов, особенно модифицированных cytosines, производимых на Шаг 2.4 с использованием метода LC-MS/MS и стандартных кривых.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Динамические изменения в ДНК 5мс, тет семья dioxygenases играет важную роль в эпигеномные транскрипционный анализ правил. TET2 dioxygenase часто мутирует в различных злокачественных опухолей кроветворной12. Расследовать роль фермента TET2 в нормального развития и болезней, мы клонировали его минимальной каталитически активных домена без какой-либо тег сходства в вектор pDEST1422. ∼5% общего растворимого белка непомеченным dioxygenase TET2 бы...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мутации в гене TET2 являются одними из наиболее часто обнаруживаемые генетические изменения у больных с различными гемопоэтических злокачественных. На сегодняшний день сотни различных TET2 мутации, которые включают нонсенс, рамка shift и Миссенс-мутации, были определены12пациентов. У больных с TET2 перегласовок показывают низкий уровень геномной 5hmC костного мозга по сравнению с теми с wt-TET214. Черепашки TET2 стучите в эксперименты резюмировалась воздей...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют без финансовых интересов объявить.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось министерством обороны США в виде идея премии (W81XWH-13-1-0174), апластической анемии и Грант Фонда MDS, и Грант UMRB м.м. авторам спасибо Mohit Jaiswal и Subhradeep Bhar для первоначального клонирования TET2 в pDEST14 вектора.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HEPESКарбосинтFH31182
Сульфат железа(II) гептагидратSigma-AldrichF8633
α-Кетоглутаровая кислота (2-Оксоглутаровая кислота)Sigma-AldrichK1750
L-Аскорбиновая кислотаSigma-AldrichA4544
Этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль дигидратSigma-AldrichE5134
Ацетат аммонияSigma-AldrichA1542
АцетонитрилFisher Scientific75-05-8
Вода класса ВЭЖХFisherScientific 7732-18-5
Олиго чистота и концентраторZymo ResearchD4061
ДНКаза INew England BiolabsM0303S
S1 нуклеазаThermo ScientificENO321
CIAP (щелочная фосфатаза кишечника теленка)New England BiolabsM0290S
LB MediaAffymetrixJ75852
IPTGКарбосинтEI05931
MES [2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота моногидрат]КарбосинтFM37015
хлорид натрияФишера Scientific7647-14-5
ГлицеринSigma-AldrichG7893
SP СефарозаFisher Scientific45-002-934
2'-дезокси-5-метилцитидинTCID3610
2'-дезокси-5-гидроксиметиалцитидинTCID4220
2'-дезоксицитидин-5-карбоновая кислота, сольнатрия Berry & ампер; AssociatesPY 7593
5-формил-2'-дезоксицитидинBerry & ПартнерыPY 7589
2'-дезоксицитидинBerry & AssociatesPY 7216
2'-дезоксиаденозинкарбосинтND04011
2'-дезоксигуанозинкарбосинтND06306
2'-дезокситимидинVWR Life Science97061-764
Шлюзовая технологияThermo Fisher11801016
Beckman Allegra X-15R центрифуга Beckman Coulter392932
Sonic Dismembrator 550Fisher ScientificXL2020
Ä Система KTA FPLCPharmacia (GE Healthcare)18116468
система сублимационной сушки FreeZone 4.5Labconco7750020
очистные колонны Zymo Oligo Zymo ResearchD4061
BDS Hypersil C18 колонкаKeystone Scientific, INC105-46-3
3200 Q-Trap масс-спектрометрAB Sciex
HPLC Shimadzu ВЭЖХ 
Колонка XK16/20 FPLCPharmacia (GE Healthcare)28988937

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
  2. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905(2013).
  3. Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
  4. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
  5. Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
  6. Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
  7. Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
  8. Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
  9. Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
  10. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  11. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
  12. Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
  13. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
  14. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
  15. Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
  16. Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
  17. Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
  18. Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
  19. Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
  20. Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
  21. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
  22. Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
  23. Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
  24. Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
  25. Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
  26. Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
  27. Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
  28. Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
  29. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TET2 PurificationCation Exchange ChromatographyLC MS MS AssayDNA Base QuantificationEnzyme Activity AnalysisBacterial Expression SystemProtein IsolationNucleoside DetectionEpigenetic DemethylationModified Cytosine Bases

Related Articles