Гибкие низкая стоимость гидропоники системы для оценки реакция растений на небольших молекул в стерильных условиях

Преимущества выращивания растений с использованием гидропоники широко признается в производстве больших и форма растений, позволяя воспроизводимость экспериментов^1,2,3. В этой системе состав питательный раствор можно должным образом контролируется и переработанных вдоль всех стадиях роста и развития растений. Кроме того корни не подвергаются к абиотическим стрессам, как может случиться в почвы выращенных растений, таких как питательных голода и воды дефицит⁴. Как растения, выращенные гидропоники настоящий Морфологические и физиологические черты, довольно похож на те, которые выращиваются в почве эта система широко использовалась в исследованиях потому, что она позволяет осуществлять мониторинг роста корня/стрелять и их заготовки без травмы^2,5.

Благодаря возможности изменения состава и концентрации раствора питательная большинство исследований с использованием гидропоники условий выполнено охарактеризовать функции микро - и макроэлементы^{1,3 ,6,,78}. Однако эта система оказалась очень полезной для широкого круга приложений в биологии растений, таким образом, чтобы уточнить функции гормонов и химических веществ в растениях. Например открытие strigolactones как новый класс гормонов⁹ и фенотип ускоренного роста, вызванного Брассиностероиды приложения¹⁰ были исполнены в гидропонных условиях. Кроме того, эта система позволяет эксперименты с метками изотопов (например, ¹⁴N /¹⁵N и ¹³CO₂)^11,12 , чтобы оценить их включению в белков и метаболитов по масс-спектрометрии.

Учитывая важность этой системы в исследования растений, большое количество гидропонных культур был разработан в последние несколько лет, включая системы, использующие (i) передача саженцев из плит для гидропоники контейнеры^{3, 13}; (ii) минеральная вата, которая ограничивает доступ к на ранних стадиях корень развития^2,,1415; (iii) полиэтилена гранулят как плавающий органа, который делает однородной применение малых молекул/лечение трудным¹⁶; или (iv) уменьшенное количество растений^9,17. Обычно большой объем гидропонных танков, описаны во многих из этих протоколов (небольшие объемы, начиная от 1-5 L, до 32 Л)¹⁸, что делает применение химических веществ чрезвычайно дорогим. Хотя некоторые исследования описывают гидропоники выращивания в асептических условиях^8,19, Ассамблея системы обычно довольно трудоемким, состоящий из идеальный регулировки нейлоновые сетки в пластика или стекла контейнеры^5,8,17,20.

Ввиду важности Arabidopsis thaliana как модель завод большинство гидропоники системы были разработаны для этого вида^{1,2,8,14,18, 19 , 20}. Тем не менее, есть несколько исследований, отчетности гидропоники роста функции других видов растений с помощью предварительной обработки семян для улучшения их всхожесть и синхронизации ставки в vitro^8,16 . Для работы в больших масштабах, мы разработали протокол для создания простых и недорогостоящих обслуживания гидропоники системы, которая обеспечивает стерильные условия для выращивания растений, в том числе A. thaliana и другие виды, такие как трава Щетинник Зелёный. Метод, описанный здесь подходит для различных экспериментов, как рост рассады можно развернуть, синхронизации и легко контролируется. Кроме того, эта система имеет много преимуществ, как: (i) его Ассамблее прост и может быть повторно использован его компонентов; (ii) оно позволяет легко применение различных химических веществ в жидкой среде; (iii саженцев прорастают и расти непосредственно в среде культуры без необходимости перехода к системе гидропоники; (iv) стрелять и корень развития/рост может тесно контролироваться и саженцы собирают без ущерба; и (v), это делает его возможным для работы на больших масштабах, поддержания физиологических условиях.

1. Подготовка жидких и твердых культуры и средств массовой информации

1. Подготовить жидкой среды, используя половину сила фотосинтетическую и Скуг (МС) средний с витаминами [0,0125 мг/Л cobalt(II) хлорид пентагидрат, 0,0125 мг/Л Небходимая сульфата пентагидрат, 18,35 мг/Л тетранатрия железа натрия, 3.10 мг/Л борная кислота, 0,415 мг/Л калия йодида, 8.45 mg/L марганца сульфата моногидрата, 0,125 мг/Л Молибдат натрия дигидрат, 4,30 мг/Л цинка сульфата гептогидрата, 166.01 мг/Л хлористого кальция, 85 мг/Л калия дигидрогенфосфат, 950 мг/Л Нитрат калия, 90.27 мг/Л сульфата магния, 825 мг/Л нитрата аммония, 1 мг/Л глицина, 50 мг/Л myo инозитол, 0,25 мг/Л никотиновой кислоты, 0,25 мг/Л пиридоксина гидрохлорида и тиамина гидрохлорида 0,05 мг/Л] ДОПОЛНЕНО с 0,25 г/Л МЧС и скорректировать рН до 5,8 с 10 М Кох.
2. Добавьте 10 г/Л агар сделать среднего MS-твердый половину сила. Автоклав среды при температуре 121 ° C за 20 мин до использования.

2. гидропоники системы сборки

Примечание: Эти шаги следует тщательно построить гидропонное системы.

1. Материал стерилизации
   1. Упаковывайте в мешке автоклав наконечник пипетки стойки (без крышки), которые будут использоваться в качестве minitanks. Автоклав стойки на 121 ° C в течение 20 мин, 15 psi.
      Примечание: Стойки кончик полипропиленовые пипетки, мы использовали имел следующие размеры: 120 мм (длина) x 89 мм (ширина) x 55 мм (высота). Наконечник пипетки плоской поверхности должны иметь область для добавления питательной среды. Могут использоваться другие подсказки стойки (см. Таблицу материалы).
      Примечание: На протяжении всей процедуры Ассамблеи гидропоники системы, необходимо использовать Ламинарный шкаф, которые должны быть очищены и продезинфицированы с 70% этанол до использования. Экспериментатор должен носить пальто лаборатории, моют руки и любой открытой кожи и лечить их с 70% этиловом спирте. Перчатки являются необязательными, за исключением применения наркотиков.
   2. Очистите все аксессуары, описанные выше (одноразовые пластиковые коробки, скотч, пипетки, ножницы и щипчики) с 70% этанол перед входом Ламинарный шкаф. Если вытяжка позволяет, включите свет УФ за 10 мин до монтажа гидропоники системы для того чтобы держать рабочую зону обеззараживания.
2. Minitank монтаж
   1. Печать верхней поверхности кончика пипетки плоский с клейкой ленты (рис. 1B). Если возможно оставьте его под УФ света за 10 мин.
   2. 180 мкл растопленным твердых MS питательной среды (слегка теплой), чтобы каждый хорошо с помощью многоканальных дозаторов (рис. 1 c).
      Примечание: При подготовке много танков, используйте плитой для предотвращения застывающих среды MS.
   3. Позвольте средство для закрепления полностью (для около 30 мин).
      Примечание: В период затвердения, УФ-свет может быть включен.
   4. Заполните вверх стойку наконечник пипетки полностью с жидкой питательной среды MS (рис. 1 d) и обеспечить тесный контакт между твердых и жидких сред.
   5. Удалите клейкие поверхности верхней плоской кончика пипетки и установите его на стойке тщательно. Гидропонное системы теперь готова получать стерилизованные семена.

3. Семена стерилизации

1. Место 500 Arabidopsis семена в 1,5 мл микропробирок. Используйте как много пробирок при необходимости согласно количество растений, необходимых для проведения эксперимента.
2. Вымойте семена с 70% этанол на 2 мин с нежным агитации. Пусть семена успокоиться, а затем осторожно выньте этанола.
3. Добавьте 1 мл 10% раствора гипохлорита натрия, содержащий 2 мкл Полисорбат 20 моющего средства. Агитируйте решение для 5 минут удалить решение тщательно.
4. Сполосните семена с стерильной дистиллированной водой до тех пор, пока все остатки отбеливателя полностью удалены (приблизительно 5 x).
   Примечание: После поверхности стерилизации, семена были погружены в стерильной дистиллированной воде и расслаиваются при 4 ° C в темноте для 5 d для синхронизации всхожесть.
   Примечание: Семена Setaria viridis (присоединение A10.1) были преинкубации в концентрированной серной кислоты на 15 мин (сломать физического покоя), тщательно промывают в стерильной дистиллированной воде и затем disinfested с 5% раствора гипохлорита натрия содержащие 0,1% Полисорбат 20 для 5 мин с нежным агитации²¹. Оставшиеся шаги стерилизации были идентичны описанным для выращивания арабидопсиса семян.

4. начальное приложение

1. Вырежьте немного оконечности 200 мкл отзыв с помощью стерильным скальпель.
2. Пипетка Arabidopsis семена в твердой питательной среды на верхней поверхности плоской кончика пипетки. Будьте осторожны, что носитель не ослабить от квартиры; в противном случае, семена будут затенены и саженцы не будет расти должным образом (Рисунок 1E).
   Примечание: Используйте стерильный пинцет для Setaria семена (с эмбриона, позиционируется вверх).
3. Храните столько minitanks как можно внутри одноразовые пластиковые коробки для поддержания высокой влажности и держать среды, свободной от микроорганизмов (Рисунок 1F).
4. Уплотнение одноразовые пластиковые коробки, тщательно с использованием клейкой лентой, чтобы избежать загрязнения.
5. Поместите гидропонных систем в камере роста с условиями соответствующего роста для растений интерес.
   Примечание: В этой работе были использованы следующие условия: 75% влажности и 150 мкмоль м^-2 s^-1 освещенность и экваториальный условий 12 ч света (21 ° C) / 12 h темный (19 ° C) для выращивания арабидопсиса, или 300 мкмоль м^-2 s^-1 о свет (28 ° C) излучения и 12 h / 12 h темный (25 ° C) для Setaria (Рисунок 1 g и 1 H).

5. Проверка использования этой гидропоники системы препятствовать целевого Rapamycin киназа

Примечание: Это гидропоники системы была первоначально разработана для облегчения администрирования химических веществ для растений, которые, в целом, являются очень дорогими, чтобы применяться в широкомасштабных экспериментов. Как доказательство концепции АТФ конкурентный ингибитор АЗД-8055, который известен конкретно сайт связывания СПС TOR протеин киназы²², был нанят следовать репрессии в отношении деятельности TOR в проростках A. thaliana (Columbia-0 Ноттингем Arabidopsis фондового центра, НКБА ID: N22681). Здесь кратко описан используемый протокол.

1. Растут семена гидропоники до стадии 1.04 согласно BBCH масштаб²³ (для около 11 d) в климатических условиях, описанных выше. Заменить питательного раствора, либо с свежих средних содержащие 0,05% ДМСО (контроль), 2 мкм АЗД-8055 (TOR ингибитор) разводят в ДМСО, или без лечения (макет), в конце ночи (EN).
2. Урожай некоторых саженцев в разное время точках после лечения и разделить их на корни и побеги. Замораживание образцов в жидком азоте, измельчить их до состояния порошка в роботизированной точильщика (см. Таблицу материалы) и хранить порошок-80 ° c до использования.
3. Иммуноблот против фосфорилированных и не phosphorylated форм 40S рибосомных белка S6 (RPS6) согласно Dobrenel и др. ²⁴.
4. Отбеливатель нетронутыми саженцев для образца депигментация, мыть их в дистиллированной воде, погрузить их в раствор йода для 5 мин²⁵и сфотографировать саженцев в стереомикроскопом (0,63 X цель, 20 x приближения и 7,5 x величины) для качественная оценка содержание крахмала.
5. Количественно крахмала после энзимной деградации и измерения глюкозы выпущенное спектрофотометрически, связывая его с сокращения NADP⁺ до NADPH^26,27.
6. Выполняет общее извлечение RNA, синтез cDNA и Количественная ПЦР-анализы как описано в Caldana et al. ²⁸ оценить уровень экспрессии генов, связанных с различных видов напряжений.
7. При необходимости проращивания на подложке садоводства в пластиковые горшки с емкостью 0,1 Л при аналогичных климатических условиях [60% влажности, 150 мкмоль м^-2 s^-1 излучения и экваториальный условиях 12 ч света (21 ° C) / 12 h темный (19 ° C )] для того, чтобы сравнить их с сеянцев, выращенных гидропоники.
   Примечание: Целевых генов используется для анализов выражение гена были ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), и ТПС5 (At4g17770) и их уровни выражения были нормализованы, используя метод Дельта Ct²⁹ , с помощью ACT2 (At3g18780) или PDF2 (At4g04890) как внутреннюю ссылку генов, предполагая 100% эффективности амплификации PCR во всех образцах. Олигонуклеотида пар используется для количественного PCR были: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), ТПС5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) и PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).

Киназы TOR является основной регулятор, который интегрирует питательных веществ и энергии, сигнализации способствовать пролиферации клеток и рост всех эукариот. Усилия по разъяснению функций TOR в растениях включают поколения Arabidopsis трансгенных линий, содержащих условное репрессии TOR через РНК-интерференции или искусственные микроРНК28,30,31, Учитывая эмбриона смертоносных фенотип TOR нокаут растений32,33,34,35. Большинство из условного трансгенных линий находятся под контролем эстрадиол-, дексаметазон- или этанола индуцибельной промоутеров, которые могли бы также сделать использовать гидропоники системы.

Одним из хорошо известных целей деятельности TOR в проростках Arabidopsis является прямым фосфорилирование рибосомных белка S6 киназы (S6K)34,36,,3738. После фосфорилирования, S6K далее фосфорилирует 40S рибосомных белка S6 (RPS6), затрагивающих рибосомных белка перевод24,,3940. Недавно было продемонстрировано, что фосфорилирование RPS6 Ser240 сайт является хорошим маркером Тор активности24. Immunoblotting анализов подтвердили, что вскоре после 30 мин лекарствами, значительным снижением фосфорилирования Ser240 наблюдалось в корни и побеги (рис. 2). В экспериментальных условиях используется чтобы быть мощным ингибитором TOR, который быстро подавляет киназу деятельность также показал АЗД-8055.

Трансгенных линий Arabidopsis с снижение экспрессии гена TOR или компонентами TOR комплекс представить четкие крахмала избыток фенотип28,31. Качественный анализ крахмала, используя раствор Люголя показали шаблоне ожидаемые накопления крахмала и деградации в течение цикла diel (рис. 3). Саженцы, которые не получили применение ДМСО или АЗД-8055 показал не большее накопление крахмала в их листья в конце ночи (EN), и накопление крахмала в контрольных растений (получившие 0,05% ДМСО) согласуется с литературой 41 , 42. Кроме того, растения, относились с АЗД-8055 представил большее количество оставшихся крахмала в EN по сравнению с управления саженцев. Эти результаты свидетельствуют о полезности предлагаемой системы гидропоники выращивания рассады, подражая физиологических условиях. Эта система также включено подтверждение крахмала избыток фенотип типичный репрессий TOR компонентов комплекса24,28,31.

Содержание крахмала было также точно измерено с использованием чувствительных методологии, демонстрируя, что АЗД-8055 лечения привело к саженцев, содержащие значительно более высокий уровень крахмала в конце дня (Эд) и EN по сравнению с ДМСО лечить контроля растения (рис. 4). Крахмала накапливается в листьях в течение дня и это мобилизовала всю ночь для поддержания метаболической активности, преимущественно дыхания и непрерывный экспорт сахарозы в другие органы растений41,42. При нормальных условиях только небольшая часть крахмала (между 5% и 10% от суммы на ED) остается в43,EN,44,,45. Эти результаты подтверждают, что крахмал, наблюдается избыток фенотип под репрессии TOR происходит всему diel цикла.

Гидропоники выращенных растений были по сравнению с сеянцев, выращенных в подложке садоводства в схожих климатических условиях, относительно выражения уровня Абсцизовая кислота отзывчивым фактора привязки элементов 3 (ABF3) ген (Рисунок 5A ), который напрямую коррелирует с внутренней ABA уровнях, класса гормонов, широко известный как маркер из-за его роль в нескольких абиотического стресса ответы46,47,48. Хотя сеянцев, выращенных в системе гидропоники значительное увеличение уровня ABF3, выражение аспарагин синтетазы 1 (ASN1) не пострадал от ДМСО или АЗД лечения (Рисунок 5B). Однако Трегалоза фосфат синтазы 5 (ТПС5) была значительно увеличена после 8 h TOR ингибирование (Рисунок 5B). ASN1 и ТПС5 реагировать сахара в низкий и высокий уровень49,50,51,52,53,54, соответственно, предлагая что эти растения не испытывают энергичный стресс.

Рисунок 1 : Рабочий процесс для монтажа системе гидропоники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Эффект торможения TOR на RPS6 фосфорилирования в различных тканях Резуховидка Таля . Immunoblotting показывает обилие общее и фосфорилированных RPS6 в корне (A) и (B) стрелять экстракты саженцев относились с 2 мкм, АЗД-8055 или 0,05% ДМСО (управления). Значения представляют коэффициенты, нормализованы не phosphorylated протеин RPS6. Антитела против актина был использован как элемент управления загрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Резуховидка Таля сеянцы витражи с реактив Люголя в. Лечение с 2 мкм АЗД-8055 или 0,05% ДМСО (управления) были применены на EN (красная стрелка) и по сравнению с МОК саженцев (без лечение). Саженцы были собирают до лечения приложения (0ч) и в 12 ч (Эд) и 24 h (EN) после лечения, обозначенных черными стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Эффект торможения TOR на содержание крахмала Резуховидка Таля саженцев. Крахмал измерялась ферментативно до (0 h) и в 12 ч (Эд) или 24 ч (EN) после лечения с 2 мкм АЗД-8055 (черный) или 0,05% ДМСО (контроль, белый). Показанные значения являются среднее ± стандартная ошибка (SE) (n = 4). Существенные различия между саженцы относились с АЗД-8055 и ДМСО, используя студента t-тест, обозначаются звездочками: * (P < 0,05) и *** (P < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Уровень экспрессии генов, связанных со стрессом. Сравнение (A) ABF3 стенограммы в гидропоники и субстрат выращенных саженцев Arabidopsis Col-0. (B) сравнение ASN1 и ТПС5 стенограммы в проростках Arabidopsis относиться с 2 мкм, АЗД-8055 и 0,05% ДМСО. Уровни нормализованных выражения отображаются как 2^(-dCt). Показанные значения являются среднее ± SE (n = 3). Значительные различия, используя студента t-тест, обозначаются звездочками: *** (P < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные Рисунок 1:это в пробирке гидропонное системы позволяет синхронизировать всхожесть и получения однородной саженцев. Непосредственно в этой системе были проросшие семена A. thaliana (C3) и S. viridis (C4). (A и C) саженцы были неоднородны по отношению к стадии развития и лечения был применен после 11 d (арабидопсиса) или 7 d (Setaria). (B и D) корни растут прямо к питательные решения, облегчения добавления различных веществ и их усвоение. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что эта система предлагает оптимальные условия для роста растений и может использоваться эффективно выполнять широкий спектр анализов. Кроме того это гидропоники системы является очень полезным для широкомасштабных экспериментов.

Авторы не имеют ничего сообщать.