Глубокая последовательности дрожжей населения, отобранных для положительных дрожжи 2-гибрид взаимодействия потенциально дает огромное количество информации о взаимодействующих партнер белков. Здесь мы описываем функционирования конкретных Биоинформатика инструменты и заказной обновленное программное обеспечение для анализа данных последовательности от таких экранов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Информатики анализ последовательности данных из пакетного дрожжи 2-гибрид экраны
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мы адаптировали дрожжи 2-гибрид assay одновременно раскрыть десятки переходных и статические белковых взаимодействий в одном экране, использование высокопроизводительного секвенирования ДНК короткий читать. Результирующие наборы данных последовательности можно не только отслеживать какие гены в популяции, которые обогащаются во время выбора для положительных дрожжи 2-гибрид взаимодействия, но также дать подробную информацию о соответствующих поддоменах белков, достаточных для взаимодействия. Здесь мы описываем полный набор автономных программ, которые позволяют не специалисты для выполнения всех биоинформатики и статистической шаги, чтобы обрабатывать и анализировать файлы fastq последовательности ДНК из пакетного дрожжи 2-гибрид пробирного. Шаги обработки, охватываемых этими программного обеспечения включают в себя: 1) карт и подсчета последовательности читает соответствующий каждый кандидат белков закодированы в библиотеке 2-гибрид добычу дрожжей; 2) статистический анализ-программа, которая вычисляет профили обогащения; и 3) Инструменты для изучения переводческих кадров и положение в регионе кодирования каждого обогащенного плазмида, который кодирует взаимодействующих протеинов интереса.
Введение
Один из подходов к обнаружить взаимодействий протеина является пробирного (Y2H) 2-гибрид дрожжей, какие подвиги инженерии дрожжевых клеток, которые растут только тогда, когда протеин интереса привязывается к фрагменту взаимодействующих партнера1. Обнаружение нескольких Y2H взаимодействия теперь может быть сделано с помощью массивной параллельной последовательности высок объём. Несколько форматов были описаны4,3,2,5 , включая один, что мы разработали, где население выращиваются в пакете в условиях, которые выбрать для дрожжей, содержащих плазмиды, которые производят позитивное взаимодействие Y2H6. Рабочий процесс, мы разработали, называется DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей), идентифицирует дифференциальной interactomes же добычей библиотек для идентификации белков, которые взаимодействуют с одним белка (или домен) против. конформационно собственный мутант домен или другой белок. Одним из основных шагов в этом процессе является правильной обработки и анализа данных последовательности ДНК. Некоторую информацию можно почерпнуть просто подсчитывая количество операций чтения для каждого гена как до, так и после выбора Y2H взаимодействий в моде аналогичны РНК seq эксперимент. Однако гораздо более подробную информацию можно извлечь из этих наборов данных, включая информацию о поддомен данного белка, который способен производить Y2H взаимодействия. Кроме того в то время как DEEPN подход является ценным, анализируя многие пример реплицирует может быть обременительным и дорогостоящим. Эта проблема смягчается с помощью статистической модели, которая была разработана специально для DEEPN наборов данных, где количество реплицирует это ограничено6. Чтобы сделать обработку и анализ ДНК последовательности наборов данных надежной, полной, надежной и доступной для следователей без опыта биоинформатики, мы разработали набор программ, которые охватывают все этапы анализа.
Этот набор самостоятельных программ, которые работают на настольных компьютерах включает в себя MAPster, DEEPN и Stat_Maker. MAPster-это графический пользовательский интерфейс, который позволяет каждому fastq файл в очереди для картирования генома, с помощью программы HISAT27, производство стандартных .sam файл для использования в нисходящие приложения. DEEPN имеет несколько модулей. Он назначает и подсчитывает читает соответствующий особый ген похож на тип РНК seq количественной оценки, с помощью модуля «Ген количество». Он также извлекает последовательности, соответствующий стыке транскрипционный анализ домена Gal4 и добычей последовательности и упорядочивает позиции этих узлов, чтобы позволить их инспекции сравнительные таблицы и графики (с использованием модуля «Junction_Make») Модуль «Blast_Query» позволяет легко инспекции, количественный и сравнения последовательностей перехода Gal4 перекрестка. Stat_Maker оценивает читает на ген обогащения данных статистически как способ приоритезации вероятно Y2H хитов. Здесь мы опишем, как использовать эти программы и полностью проанализировать последовательность ДНК, которую данные из DEEPN Y2H эксперимент. Доступны версии DEEPN для запуска на PC, Mac и Linux систем. Другие программы, такие как отображение программы MAPster и DEEPN модуль статистики Stat_Maker полагаются на подпрограммы, которые выполняются под управлением Unix и доступны только на Mac и linux систем.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Сопоставление файлов Fastq
Примечание: DEEPN программного обеспечения, а также многие программы биоинформатики использовать данные последовательности ДНК, которой сопоставлен каждой последовательности чтения для его позиции в ссылке ДНК. Разнообразные программы сопоставления могут использоваться для этого в том числе MAPster здесь интерфейс, который использует программу HISTAT2 производить .sam файлы, используемые в последующих шагах.
- Карта данных последовательности правильную версию генома. Для библиотек Y2H происхождения мыши используйте геноме UCSC мм10; для тех, кто с помощью человеческих генов используйте геноме UCSC ссылку hg38 для Saccharomyces cerevisiae генов, используйте геноме UCSC SacCer3 ссылку.
-
Установите MAPster.
- Скачать MAPster программное обеспечение и установить. Программное обеспечение можно найти с помощью веб-браузера на следующее: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 работает на системах UNIX, таких как Apple Macintosh. Вследствие этого программа MAPster будет работать только на совместимых систем, таких как Apple Macintosh и linux.
Примечание: Системные требования для Apple Mac являются: OSX 10.10 + > 4 ГБ ОЗУ, > 500 ГБ дискового пространства и доступ в Интернет для загрузки ссылку геномов. Пользователям может понадобиться проконсультироваться с институциональными его лица если их предприятия протоколы безопасности, ограничивающих права и разрешения администратора.
- Скачать MAPster программное обеспечение и установить. Программное обеспечение можно найти с помощью веб-браузера на следующее: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 работает на системах UNIX, таких как Apple Macintosh. Вследствие этого программа MAPster будет работать только на совместимых систем, таких как Apple Macintosh и linux.
-
Введите требуемые файлы и параметры на вкладке «Основные» (рис. 1). Выберите соответствующую кнопку «Pairwise» ввести файлы либо как пар или непарные с FASTQ как формат файла по умолчанию.
- Для DEEPN анализа включите параметр «Pairwise» значение «Выкл.» для запуска в одном чтения формате.
- Загрузить файлы в MAPster просто путем drag-and-drop в соответствующее окно.
- Выберите ссылку на источник ДНК/генома, который соответствует источнику Y2H добычу библиотека вставок. Индексированные геномов из нескольких модельных организмов, перечислены в окне «Геном» и может быть автоматически загружаются из центра Университета Джонса Хопкинса для вычислительной биологии. Геномы ссылки будут храниться локально для последующего использования.
- Укажите количество процессов компьютера будет посвящена программе сопоставления под полем «Потоки», начиная с HISAT2 поддерживает многопоточность. MAPster Поиск компьютера и предложить максимальное количество процессоров, доступных по умолчанию.
- Укажите имя выходного файла. Это имя файла будет использоваться на протяжении всего процесса DEEPN, поэтому рекомендуется короткий но описательное имя без пробелов или специальных символов. Укажите папку для выходных сопоставленных файлов, используя кнопку «Открыть выходной каталог».
- После того, как были выбраны соответствующие файлы и параметры, добавьте сопоставление задание в очередь заданий, используя кнопку «Добавить в очередь». Имена файлов в главном окне можно исключить и заменить файлы, соответствующие нового образца и они могут быть добавлены в очередь после предоставления соответствующего выходного файла.
- Нажмите кнопку «Запустить очередь» после внесения всех заданий в очереди заданий.
Примечание: После того, как задание сопоставления были помещены в очередь, выбор что работа приводит параметров для отображения в окне «Параметры задания» и инструкции командной строки со всеми аргументами, чтобы отображаться в окне «Работа команды». Параметры вывода относятся ли к держать гласит, что удастся согласовать и указав количество начального выравнивания, допускается для каждого чтения. По умолчанию выходной файл из MAPster — в формате SAM (например файл «.sam»). Он будет содержать все считывает последовательность из файлов fastq, указанный для этого образца, включая те, которые были (сопоставленное) и не были успешно сопоставлены с указанным geome (несопоставленные).
2. Bioinformatic обработки с помощью программного обеспечения DEEPN
Примечание: DEEPN программное обеспечение в настоящее время составляется для использования с добычей библиотеки, содержащие последовательности кДНК мыши, человека cDNA последовательностей или S. cerevisiae геномных последовательностей ДНК. DEEPN принимает стандартные .sam формат файла и может принять Сэм (.sam) файл, содержащий как сопоставленные, так и несопоставленные читает или отдельные файлы для каждого из несопоставленных и сопоставленных читает.
- Скачать DEEPN программное обеспечение и установить. Программное обеспечение можно найти с помощью веб-браузера на следующее: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Выберите, какая версия соответствует вычислительной платформы и скачать. Для установки, откройте загруженного установочного пакета.
Примечание: Версии DEEPN доступны для PC, Mac и Linux sysrems. Системы Mac и PC должны иметь > 500 ГБ дискового пространства и > 4 ГБ ОЗУ. -
Откройте программное обеспечение DEEPN. В главном окне (рис. 2) выберите соответствующую информацию библиотеки добычу из верхней выбор коробки. Выберите папку, где обработанные файлы могут идти, нажав кнопку «Работа папка» и перейдя в папку/каталог. При необходимости можно создать новую папку. После того, как выбрана папка «Рабочий», DEEPN создаст три вложенные папки под названием unmapped_sam_files, mapped_sam_files и sam_files.
- Если с помощью .sam файлы, содержащие как сопоставленные, так и несопоставленные читает такие производства с настройками по умолчанию программа MAPster, поместите их в папку «sam_files». В противном случае место .sam файлы в unmapped_sam_files и mapped_sam_files соответственно.
- Инициировать обработку, нажав кнопку «Ген игр + Junction сделать».
Примечание: Обработка начнется с ген игр модуль, который будет использовать сопоставление позиций подсчитать, сколько читает соответствуют каждого гена. Джанкшен сделать затем извлечь узел последовательности (последовательности сливается прямо вниз по течению от Gal4-активации домена) от чтения и идентифицировать их по алгоритму взрыва. Это создаст полный набор папок, изображенный на рисунке 3. Время обработки зависит от размера и числа файлов данных последовательности и быстродействие компьютера, используемого. Типичный раз варьируются от 12 – 30 h для экспериментального набора ~ 250 миллионов человек читает. Процедура ген игр и Junction_Make процедура может индивидуально начал, нажав кнопку «Ген игр» или «Junction сделать». -
Загрузите и установите Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Это пакет статистического анализа, предназначенный для DEEPN наборов данных, которые в настоящее время работает только на системах Unix Mac.
- Открыть Stat_Maker и нажмите на кнопку «Проверить установку» (рис. 4). Если в первый раз, Stat_Maker автоматически установит R, ЗУБЦЫ и Bioconductor, потянув за эти ресурсы из Интернета. После обнаружения R, ЗУБЦЫ и Bioconductor, Stat_Maker стать активными и позволяют дальнейшего ввода данных пользователем.
- Нажмите кнопку «Выбрать папку» для перехода в рабочей папке, обработки DEEPN. Stat_Maker будет автоматически найти и список файлов для статистического анализа в окне.
- Перетащите и поместите соответствующие файлы из окна списка файлов выше в файле windows ниже для каждого вектора и приманки набора данных и для каждого условия роста: не выбран (его + СМИ) и выбран (его - СМИ). Важно отметить, что Stat_Maker требует повторяющиеся наборы данных для пустой вектор одиночку, двух выборок населения, не были выбраны и выбраны два образца. Это дает оценку изменчивости в эксперимент.
- Нажмите кнопку «Запустить». В зависимости от скорости компьютера вычисление займет от 5-15 мин.
- Результаты обзора из Stat_Maker вывода, которые помещаются в новую вложенную папку в папке основной работы с надписью «Stat_Maker результаты».
Примечание: Результаты находятся в файле CSV (с разделителями-запятыми), который может быть открыт в общем программами электронных таблиц. Stat_Maker будут ранжировать гена хитов, которые, вероятно, дифференциально обогащаться на выбор с приманкой интереса над пустой pTEF ГПБ (рис. 5). Также представлены — это процент операций чтения для каждого набора данных где вставка гена найдены вверх, вниз по течению, или в открытом чтения кадра и ли ген также находится в пределах фрейма правильное поступательное чтение. Часто DEEPN будет захватить надежного взаимодействия Y2H приманки с частями данного cDNA, которые находятся вне кадра надлежащего чтения соответствующего белка или часть cDNA, вниз по течению от его соответствующего кадра открытым чтение. Сканирование комбинированный выход из Stat_Maker упрощает обнаружение и устранение этих нерелевантных хитов. -
Чтобы просмотреть данные на каждого потенциального кандидата, откройте программное обеспечение DEEPN, выберите соответствующую информацию библиотеки добычу, а затем правильную рабочую папку, используя папку «работы».
- Нажмите кнопку «Запрос взрыва». Это загружает новое окно (рис. 6). В верхнем текстовом поле введите имя ген или номер GenBank Нм для выбора кандидата гена интереса. Эти имена гена соответствуют имена, перечисленные в файле вывода StatMaker. Тип введите или возвращения, который инициирует извлечение гена интереса.
- Выберите, какие наборы данных будет использоваться для анализа с помощью меню «Выбор набора данных». Как правило они включают только вектор и приманки образцы, выращенной в условиях, неизбирательной и образец приманки, выращенных в условиях отбора. Первоначально наборы данных займет несколько минут для загрузки, однако, последующих запросов же наборов данных с различных генов будет идти быстро. Blast_Query будет отображать фьюжн точек вдоль последовательности интереса и как обильные каждой точки слияния. Это может быть отображена как в формате таблицы, с помощью вкладки «Результаты» или графическом формате, используя вкладку «Сюжет». Эти результаты можно экспортировать в CSV-файл, нажав кнопку «Сохранить .csv» в правом верхнем углу.
3. Проверка кандидатов, отобранных по DEEPN
Примечание: DEEPN и Stat_Maker предназначен для выявления кандидата генов, которые дают позитивного взаимодействия Y2H. Проверка такого взаимодействия Y2H может быть производится с использованием традиционных двоичный формат Y2H, используя приманку плазмиду интереса в паре с пустой плазмида Gal4-активации домена «добычу» а также в паре с добычей плазмида, перевозящих фрагмента гена/cDNA интерес. Это не целесообразно изолировать фактический плазмиду интереса в смеси ДНК, изолированных от дрожжей населения подвергается Y2H выбор. Однако можно вычислительно реконструировать, что ген/cDNA фрагмент является то, что производит Y2H взаимодействия, Дизайн праймеров для 5' и 3' конца этого фрагмента и усилить этот фрагмент из ДНК, изолированных от дрожжей населения. В этом разделе описывается, как найти 5' и 3' конца фрагмента добычу кандидата.
- Открыть DEEPN программного обеспечения и выберите параметры «Выберите параметр» и работу папка» выберите работать «соответствующего проекта. Запуск модуля Blast_Query, нажав кнопку «Blast запрос».
-
Введите имя гена интереса или его GenBank «Нм» номер в верхнем текстовом поле. Выберите из выпадающего меню набора данных, который соответствует выбранной дрожжей населения для приманки интерес для получения таблицы позиций соединения на вкладке «Результаты». По умолчанию Blast_Query будет заказать различные позиции, согласно их изобилия в объекте dataset, количественно ppm общее количество узлов, найденных в базе данных.
- Найти наиболее распространенных позиции, что является «в ORF» и «в кадре». Значение для позиции соответствует нуклеотидной позиции гена с последовательностью ссылок NCBI («Нм» номер) в верхнем текстовом поле. Эта последовательность может извлечь от GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) или скопирован из нижнего текстового поля в окне Blast_Query.
Примечание: Пример можно найти в Рисунок 6, средняя группа. В наборе центр «Результаты» показать как перекрестка наиболее распространенных: «Position»: 867; «#Junctions»: 20033.821; «Запрос запуска», 1; CD: В ORF; и «Рама»: В кадре. Нуклеотидов 867 GenBank NCBI ссылка последовательности NM_019648 это начало фрагмента добычу.
- Найти наиболее распространенных позиции, что является «в ORF» и «в кадре». Значение для позиции соответствует нуклеотидной позиции гена с последовательностью ссылок NCBI («Нм» номер) в верхнем текстовом поле. Эта последовательность может извлечь от GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) или скопирован из нижнего текстового поля в окне Blast_Query.
- Если запрос начать 1, Дизайн ' конец 5 праймера включить нуклеотидов, соответствующий номер позиции и расширить 25 нуклеотидов вниз по течению от этой позиции (рис. 7). Если запрос начать более чем 1, это указывает, что есть дополнительные нуклеотидов между доменом активации Gal4 и добычей последовательность интереса и что грунт следует начать далее вниз по течению согласно значению запроса начать.
- В DEEPN окне нажмите кнопку «Чтение глубины» под «Анализ данных». Когда открыто окно чтения глубину, введите NCBI последовательности (Нм) номер или гена имя ссылки в верхнем текстовом поле. Используйте выпадающее меню для выбора соответствующего набора данных, содержащего обогащенный гена интереса. Используйте таблицу слева и отображения графики на право определять, сколько чтений были обнаружены в данных, которые соответствуют гена интереса (рис. 7Б).
- Дизайн 3' конца праймера, который будет захватить последовательность фрагмента гена, вычисляется путем чтения глубины. Если обилие читает выходит за рамки ORF и остановить кодон, Дизайн праймера так, что она включает в себя стоп-кодон и региона только вверх по течению стоп-кодон. Если последовательностей гена не распространяется на прошлом стоп-кодон, используйте таблицу результатов для поиска наиболее отдаленный регион 3', которые могут быть обнаружены и использовать эту позицию как дальний 3' точку, чтобы поместить в грунт.
Примечание: Программа чтения глубина сканирует в интервалах найти последовательности, которые соответствуют указанным гена/cDNA интерес. Это помогает предсказать, где 5' и 3' конца фрагмента наиболее распространенных добычей для этого гена в образце. Колебания в глубине чтения по длине последовательности являются нормальными, как видно на рисунке 7. Если читать глубина явно мимо стоп-кодон, он указывает, что фрагмент добычу выходит за пределы стоп-кодон и таким образом грунт 3' можно просто соответствуют региона вокруг стоп-кодон. -
Выполните реакции PCR 50 мкл на ген. Каждый реакции содержит 25 пмоль каждого прямого и обратного грунтовки, соответствия плазмида добычу библиотеки (см. таблицу материалы). Реакции также содержат 25 мкл высококачественный 2 x PCR Мастер микс, 5 мкг ДНК образца, и воды до 50 мкл.
- Усилить реакции для 25 циклов с расширением раз 3 мин при 72 ° C, отжига Температура 55 ° C за 30 s и денатурировать на 98 ° C 10 s. предшествует Велоспорт 30 s денатурации 98 ° c и следовать с 5 минут инкубации при 72 ° C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сопоставление данных fastq: первый шаг
В практически всех NGS приложений, включая первоначальный вывод представляет собой файл короткие последовательности чтений, которые должны быть сопоставлены выравнивание геномной DEEPN транскриптомики, или другие ссылки ДНК8. Недавно была разработана программа выравнивания HISAT2, который использует алгоритмы индексирования-искусство резко увеличить отображение скорости7,<...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Набор программного обеспечения, описанные здесь позволяет полностью обрабатывать и анализировать данные секвенирования ДНК высокой пропускной способности из DEEPN эксперимент. Первая программа, используемая является MAPster, который принимает считывает последовательность ДНК в файлах стандартных fastq и карты их позицию на ссылку ДНК для последующей обработки на целый ряд программ информатики, включая программное обеспечение DEEPN. Утилита MAPster интерфейса и его способность стоять в очереди несколько заданий, входных ф...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать
Благодарности
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения: низ R21 EB021870-01A1 и NSF исследовательский проект Грант: 1517110.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Мапстер | https://github.com/emptyewer/MAPster/releases | ||
| программное обеспечение | https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases | ||
| Statmaker | https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases | ||
| Минимальная компьютерная система | Apple | Mac Intel Core i5 или лучше | |
| - | 4 Гб ОЗУ или | ||
| Gb Disk spce или лучше | |||
| - | OS 10.10 или выше | ||
| Dell | Intel i5-7400 или лучше | ||
| - | 4 Gb RAM или лучше | ||
| - | 500 Gb Disk spce или лучше | ||
| - | Windows 7 или выше |
Ссылки
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
- Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
- Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).
- Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
- Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. Alignment of Next-Generation Sequencing Reads. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17, 13(2016).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
