Изучение потенциала мезенхимальных стволовых клеток листа на развитие гепатоцеллюлярной карциномы In Vivo

Summary

Здесь мы представляем протокола разработать в vivo рака модели с помощью технологии cell листа. Такая модель может быть очень полезным для оценки противоопухолевой терапии.

Abstract

В естественных условиях животных модель, которая имитирует человека рак может иметь различные приложения, которые обеспечивают значительные клинической информации. В настоящее время используемые методы для разработки моделей в vivo рака имеют значительные ограничения. Таким образом в этом исследовании, мы стремимся реализовать ячейку листа технологии для разработки модели рака в естественных условиях . Гепатоцеллюлярной карциномой (HCC) успешно развивается в обнаженной крыс с использованием клеток листы, созданные из КЦУК клеток линии клеток. Раковых клеток листы создаются через внутриклеточные адгезии и формирование стратифицированной структуры, контролируемых внеклеточного матрикса. Это позволяет для трансплантации лист КЦУК в печень и создание модели животных опухоль подшипник в течение месяца. Кроме того исследуется роль мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в развитии этой рака модели. Помимо КЦУК ячейки строки листа, создаются еще две ячейки листов: лист КЦУК клеток и костного MSCs (BMMSCs) и лист КЦУК клеток и пуповины MSCs (UCMSCs). Листы, которые имеют сочетание КЦУК клеток и MSCs способны также производить опухоль подшипник животных. Однако добавление MSCs уменьшает размер сформированных опухоли, и это неблагоприятное воздействие на развитие опухоли варьируется в зависимости от источника используется MSCs. Это указывает, что ячейки листа, из некоторых MSC подтипы могут быть использованы в опухоли и управления.

Introduction

КЦУК является Первичный рак печени, существенно связано с плохим прогнозом. Ежегодно почти полумиллиона новых пациентов с диагнозом КЦУК, составляет 85% от рака печени пациентов во всем мире¹. Hepatocarcinogenesis является не одной формы заболевания; скорее это набор болезней, которые имеют различные Гистопатологические особенности и генетический и геномный изменчивости, в дополнение к разнообразны прогнозные результаты¹. Таким образом основные проблемы в развитии эффективной терапевтической стратегии для КЦУК являются ограниченные знания биологии КЦУК и отсутствие подходящих экспериментальных животных модель, которая может помочь понять этого сложного заболевания. В естественных условиях животных модель, которая имитирует человека рак необходим для выбора кандидата генов и выявления прогностических/прогнозирования маркеры, замешанных в индукции рака, а также для расследования различных факторов, которые могут влиять на рак ответы для терапевтических агентов.

В vitro исследования рак по-прежнему связаны с основными ограничениями. Это связано с тем, что раковые клетки теряют многие из их в vivo особенности когда поддерживается в культуре. Изменения, которые происходят в ячейках в витро результат из-за отсутствия всей ткани физиологии в обстановке ex vivo . Рака в ячейке взаимодействия (стромы, иммунной, сосудистую, эпителиальных и т.д.) в пределах микроокружения опухоли сильно отражается на раковых клеток характеристики². Микроокружения опухоли могут изменить выражение гена/белков клеток рака и фенотипические характеристики, в дополнение к angiogenetic и метастатическим потенциалом. Двумерные (2-D) в vitro культуры система также не имеет матрицу подходящей ткани, которая необходима для регулирования прогрессии опухоли. Таким образом из-за этих ограничений, в естественных условиях модели, всегда должны использоваться для поддержки предварительные выводы в vitro моделей. В этом исследовании мы используем ячейки листа технологии для разработки в vivo животной модели, разъясняет полное биологический процесс лежащие в основе КЦУК.

Более чем десятилетие назад, создана лаборатория Окано новый метод тканевой инженерии, основанный на ячейку листа технологии³. Этот метод использует термо отзывчивым культуры пластика позволяют реверсивные клеток адгезии/отряд, контролируя гидрофобность поверхности. Этот метод позволяет нежный уборки культивируемых клеток в нетронутыми трехмерной (3-D) формате (i.e.,cell листа), с ухоженными внеклеточного матрикса (ECM) и ячеек для взаимодействия. Ячейки листа техника требует намывного культуры блюд с температуры отзывчивым полимера poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA Am), который является коммерчески доступны и готовы к использованию. При температуре ниже 20 ° C Пипа Am полимеров стать гидратированных и растворить в водных растворах, в то время как при более высокой температуре (37 ° C), полимеры становятся обезвоженной и превратить в мутным осадком. Полимер содержит гидрофильные Амида цепи и гидрофобных боковых цепей (изопропиловый группы). При высоких температурах броуновское движение молекул воды усиливается, в то время как при низкой температуре, агрегировать молекул воды, окружающие изопропиловый групп гидратированных структура разбивки и групп гидрофобных изопропиловый из-за гидрофобных взаимодействий. Таким образом всю цепь полимера агрегатов и осаждает⁴.

В исследовании представлены этот метод используется для разработать модель животных КЦУК, с использованием трех различных ячеек листов. Первый лист занятых состоит из КЦУК клеток линии клетки только, тогда как два других листов состоит из комбинации КЦУК клеток линии клеток и MSCs из двух разных источников: МСК костного мозга (BMMSCs) и пуповины MSCs (UCMSCs). MSCs, не гемопоэтических стромальные клетки, которые способны дифференциации intocell производных мезенхимы линии, включая адипоциты, остеоциты, хондроцитов и миоцитов⁵. Причина, по которой мы используем эти клетки при создании листа клеток рака является несовместимым отчетности о влиянии MSCs на раковые заболевания. Было высказано мнение о том, что MSCs может иметь два различных фенотипов: «MSC1», провоспалительные фенотип и «MSC2», иммунодепрессивные фенотип⁶. MSCs Экспресс Толл подобные рецепторы (TLRs). TLR4 грунтовка MSCs увеличивает их секрецию провоспалительных факторов, тогда как TLR3 грунтовка увеличивает их секрецию иммуносупрессивным факторам⁶. В vitro исследования этих двух фенотипов сообщил, что совместно культуры MSC1 с рак клеточных линий ослабленный рост раковых клеток, в то время как MSC2 совместного культура имела противоположный эффект⁷. Это подразумевает, что MSCs может быть про рак или противоопухолевых, в зависимости от их фенотип. Таким образом, в дополнение к разработке модели на животных КЦУК, с помощью технологии cell лист, мы хотим изучить влияние MSC пересадки на развитие опухоли, и ли используя эти клетки будут повысить или снизить разработки этой модели.

Protocol

Протокол следует животных ухода руководящие принципы этического Комитета университет короля Сауда. Университет короля Сауда этического комитета утверждаются хирургических процедур, анестезии и другие препараты, используемые на животных. Все экспериментальная работа выполняется квалифицированными специалистами.

1. ячейки листа строительство

1. Промазывают неразбавленном плода бычьим сывороточным (ФБС) культуры (блюда температуры отзывчивым культуры 3,5 см) и обеспечить, чтобы покрыть всю поверхность блюдо.
   Примечание: Этот шаг имеет важное значение для отряда ячейки листа, так как он поддерживает рост клеток в монослое и препятствует агрегации клеток.
2. Инкубируйте блюда для 24 ч при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO₂ и 95% воздуха.
3. Удалите избыток FBS с покрытием блюда и позволяют блюда высохнуть при комнатной температуре (RT) для по крайней мере 1 час.
4. Подготовить три клеточных суспензий: 1 x 10-⁶ HepG2 клетки, клетки 1 x 10-⁶ HepG2 с BMMSCs и HepG2 1 x 10⁶ клеток с UCMSCs (в соотношении 4:1 для BMMSCs и UCMSCs).
5. Семя подвесные каждой меткой блюдо на соответствующую ячейку.
6. Приостановите все клетки в среде DMEM культуры, с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
7. Инкубируйте клетки при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO₂ и 95% воздуха.

2. ячейки листа отряд

1. На 100% клеток слияния взять блюда из инкубатора 37 ° C.
2. Инкубируйте HepG2 ячейку листа блюдо за 1 час на RT, время инкубации HepG2/ИЗУЧЕНА и HepG2/UCMSC ячейку листа блюда для 30-40 мин при 20 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO₂ и 95% воздуха.
   Примечание: Ячейки листа из только HepG2 хрупкие; снижение температуры до 20 ° C наносит ущерб структуре листа.

3. эффективность хирургической процедуры

Примечание: Во время инкубации клеток листа отряд, начать процедуру животных.

1. Инструкции по подготовке области хирургии
   1. Проведение всех хирургических процедур в стерильных отдельной области в пределах лаборатории, как капот, Ламинарный шкаф или Обслуживание асептических хирургии. Обеспечить все поверхности области хирургии не пористых, герметичные, прочный и sanitizable.
   2. Носите надлежащей защитной одежды, включая скрабы, перчатки, маски и головы и обуви обложек.
   3. Использование хирургических инструментов, которые являются чистыми и стерилизовать (через автоклавирования; насыщенный стволовых под высоким давлением) в начале операции.
   4. Изменить перчатки между крысами.
2. Подготовка животного для хирургии
   1. Используйте 8 - до 12-недельных обнаженной крыс.
   2. Создание инъекционный наркоз для крыс.
      1. Подготовить раствор анестезии, кетамин Ксилазина, смешать 2 мл кетамина, 1 мл Ксилазина (в концентрации 20 мг/мл) и 1 мл стерильный физиологический раствор (например, 0,9% хлорида натрия) во флаконе коллекции стерильные 10-мл сыворотки и хорошо взболтать перед использования.
      2. Чтобы применить анестезии, придать 0,2 мл раствора кетамина ксилазина на 100 г веса тела крысы внутрибрюшинно.
         Примечание: Общая доза раствора составляет 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг Ксилазина.
   3. Удаления видимых грязь/мусора с хирургической сайта.
   4. Проверка глубины анестезии путем тестирования педали вывода рефлекс (ноги колодки пинча на обе задние ноги).
      Примечание: Ноги колодки щепотку вызывает реакцию, повторить в дозе 0,05 мл/100 g (примерно каждые 30 минут), если перепроверить глубины анестезии.
   5. Лечить области хирургии с двухступенчатой скраб, повидон йод/изопропанола.
   6. Обложка Крыса с стерильных пелерина, чтобы избежать загрязнения разреза.
   7. Придать крысы подкожно с бупренорфин (0,01 - 0,05 мг/кг)⁸ до делать разрез.
   8. С помощью стерильным скальпель, сделайте 7 - до 10 см вырезать между скины и основные мышцы, чтобы разоблачить печени.
      1. Отдельных мышц живота от кожи с плоской задней кромки скальпель.
      2. Аккуратно ножом linea alba с помощью скальпеля и расширить разрез с острыми ножницами.

4. ячейки листа трансплантация

Примечание: Трансплантация клеток листа выполняется на печень.

1. Соберите ячейку листа от культуры блюдо.
   1. Аккуратно нажмите культуры блюдо над скамейки, чтобы отсоединить листа от его поверхности.
   2. Отдельные ячейки листа от блюдо поверхности соскабливания край листа в половину круга, используя кончик стерильной пипеткой.
   3. Аккуратно удалите весь носитель из культуры блюдо.
   4. Убедитесь, что лист нетронутыми без ущерба; в противном случае, он не может быть использован (рис. 1).
      Примечание: Результирующий листы могут быть обнаружены непосредственно в глаз.
2. Подготовьте стерильные мембраны (фильтровальная бумага) урожай ячейку листа от блюдо.
   1. Во-первых выдержите мембрану с нормальное saline. Затем удалите избыток физраствора с стерильным ватным тампоном.
   2. Поместите мокрой мембраны клетки листа, избегая складок и пузырьков воздуха между мембраной и ячейки листа.
   3. Добавьте несколько капель нормальное saline через мембраны и клетки лист, чтобы собрать их легче.
      Примечание: Чтобы избежать нарушения ячейки листа, не использовать холодной соленой и поднимите мембраны и ячейки листа с щипцами.
   4. Оставьте мембраны на несколько секунд, чтобы обеспечить, что ячейки листа правильно присоединен к мембране, а затем собрать его.
3. Подготовка печени для трансплантации клеток листа.
   1. Убедитесь, что поверхности печени сухие, слегка нажав с стерильным ватным тампоном.
   2. С помощью стерильный пинцет, поместите мембраны клетки листа один лепесток печени крыс.
   3. Добавить несколько капель стерильного физиологического раствора и применить нежное давление мембраны для отсоединения ячейку листа от него.
   4. Подождите 5 минут тщательно снятием мембраны.
      Примечание: Это делается для обеспечения что ячейки листа правильно подключен к печени.
   5. Наконец закройте основных мышц и кожи разрезов с нейлон швами 5-0.
   6. Лечить области хирургии с повидон йод.
      Примечание: На рисунке 2 показана схема процедуры трансплантации клеток листа на печени обнаженной крысы.

5. послеоперационный уход

1. Сразу же после операции, дом крысы индивидуально, чтобы избежать каннибализма или удушья и контролировать его регулярно (по крайней мере каждые 15 мин) до тех пор, пока это сознательное и полностью передвигающихся самостоятельно.
2. Затем оценить крысам ежедневно в течение 5-14 d, по крайней мере 5 d постоперационно, чтобы обеспечить, что есть никаких осложнений. В ходе ежедневной оценки убедитесь, что следующие.
   1. Рана будет закрыт, и швы нетронутыми, не будучи чрезмерно жесткой.
   2. Есть никаких признаков инфекции в разрез сайта, например тепла, чрезмерная опухоль, или гнойные выделения.
   3. Есть никаких признаков, связанные с болью, таких, как сокращение потребления пищи и воды, потеря веса, обезвоживание, кожи палаток или дыхание быстрое и открыть рот. Для управления умеренной или сильной боли после операции если таковые имеются, придать крысы подкожно с бупренорфин (0,01 - 0,05 мг/кг) каждые 6-8 ч⁹ как минимум 48-72 ч после операции.

6. анализ пересаженных района

1. Один месяц после пересадки, scarifice крыса и собирать пересаженных области для гистологического и Иммуногистохимический анализ.

Results

Tumorigenicity листов пересаженные клетки крыс:

Один месяц после пересадки, все листы пересаженные клетки в печени крыс разработали опухоли (рис. 3). Средний размер развитых опухолей из HepG2, HepG2/ИЗУЧЕНА и HepG2/UCMSC клеток листы были 2,5 см, соответственно¹⁰, 4,5 см и 4 см.

Гистологичес...

Discussion

Обширные количество исследований посвящена разработке адекватной в vivo доклинических животной модели, напоминающий человека раковые заболевания. В настоящее время основные подходы, используемые для создания модели животных рака включают генной инженерии и клеток Трансплантация¹¹. Генетически модифицированных животных модели являются хорошими инструментами для идентификации и проверки целевых генов, а также понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе лекарственно индуцированные то...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильно>Реагенты
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM с высоким содержанием глюкозы	Sigma	D5671-500ML
Пенициллин/стрептомицин	Life Technology	15070063
Стерильный физиологический раствор	Sigma	S0817-1GA
Клеточная линия HepG2 человека	ATCC, США	HB-8065
МСК костного мозга человека клеточная линия	PromoCell, США	C-12974
ткань пуповины человека MSCs	PromoCell, США	C-12971
Кетамин 50%	Ромпун, Байер
Ксилазин 2%	Ромпун	23076-35-9
Альфадин&рег;   решение.	Riyadh Pharma	LBL0816
Disposables:
15 мл полипропиленовая прозрачная полипропиленовая центрифужная трубка из полипропилена	Falcon
3,5 см стерильные чашки для культур UpCell с фильтровальной бумагой (мембраной)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µ l   Наконечники для пипеток	Сигма	CLS4868-1000ЕА
Базовая процедура Драпировка	Thermofisher	PMD5293.0
Equipment
Plus дозатор, переменный объем	Eppendorf®   Исследования&рег;	Z683779-1EA
Инкубатор для культуры тканей 37° C, 5% CO2	Любая марка
Шкаф биологической безопасности	Любая марка
Инкубатор для культуры тканей 20° C, 5% CO2Any	brand
Стерильные хирургические инструменты и обнаженные крысы:
Щипцы
Ножницы
скальпель
Нейлоновый шов  5-0	Accutome	AB-3854S	Мононить, Ланцет
1 мл Туберкулиновые шприцы	Fisher	Scientific 14-826-88
Обнаженные крысы	Река