Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изучение потенциала мезенхимальных стволовых клеток листа на развитие гепатоцеллюлярной карциномы In Vivo

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57805

⸱

11 сентября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Medicine Department, King Abdullah International Medical Research Centre, King Abdulaziz Medical City, Ministry of National Guard Health Affairs, 2College of Medicine, Experimental Surgery and Animal Laboratory, King Saud University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокола разработать в vivo рака модели с помощью технологии cell листа. Такая модель может быть очень полезным для оценки противоопухолевой терапии.

Аннотация

В естественных условиях животных модель, которая имитирует человека рак может иметь различные приложения, которые обеспечивают значительные клинической информации. В настоящее время используемые методы для разработки моделей в vivo рака имеют значительные ограничения. Таким образом в этом исследовании, мы стремимся реализовать ячейку листа технологии для разработки модели рака в естественных условиях . Гепатоцеллюлярной карциномой (HCC) успешно развивается в обнаженной крыс с использованием клеток листы, созданные из КЦУК клеток линии клеток. Раковых клеток листы создаются через внутриклеточные адгезии и формирование стратифицированной структуры, контролируемых внеклеточного матрикса. Это позволяет для трансплантации лист КЦУК в печень и создание модели животных опухоль подшипник в течение месяца. Кроме того исследуется роль мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в развитии этой рака модели. Помимо КЦУК ячейки строки листа, создаются еще две ячейки листов: лист КЦУК клеток и костного MSCs (BMMSCs) и лист КЦУК клеток и пуповины MSCs (UCMSCs). Листы, которые имеют сочетание КЦУК клеток и MSCs способны также производить опухоль подшипник животных. Однако добавление MSCs уменьшает размер сформированных опухоли, и это неблагоприятное воздействие на развитие опухоли варьируется в зависимости от источника используется MSCs. Это указывает, что ячейки листа, из некоторых MSC подтипы могут быть использованы в опухоли и управления.

Введение

КЦУК является Первичный рак печени, существенно связано с плохим прогнозом. Ежегодно почти полумиллиона новых пациентов с диагнозом КЦУК, составляет 85% от рака печени пациентов во всем мире1. Hepatocarcinogenesis является не одной формы заболевания; скорее это набор болезней, которые имеют различные Гистопатологические особенности и генетический и геномный изменчивости, в дополнение к разнообразны прогнозные результаты1. Таким образом основные проблемы в развитии эффективной терапевтической стратегии для КЦУК являются ограниченные знания биологии КЦУК и отсутствие подходящих экспериментальных животных модель, которая может помочь понять этого сложного заболевания. В естественных условиях животных модель, которая имитирует человека рак необходим для выбора кандидата генов и выявления прогностических/прогнозирования маркеры, замешанных в индукции рака, а также для расследования различных факторов, которые могут влиять на рак ответы для терапевтических агентов.

В vitro исследования рак по-прежнему связаны с основными ограничениями. Это связано с тем, что раковые клетки теряют многие из их в vivo особенности когда поддерживается в культуре. Изменения, которые происходят в ячейках в витро результат из-за отсутствия всей ткани физиологии в обстановке ex vivo . Рака в ячейке взаимодействия (стромы, иммунной, сосудистую, эпителиальных и т.д.) в пределах микроокружения опухоли сильно отражается на раковых клеток характеристики2. Микроокружения опухоли могут изменить выражение гена/белков клеток рака и фенотипические характеристики, в дополнение к angiogenetic и метастатическим потенциалом. Двумерные (2-D) в vitro культуры система также не имеет матрицу подходящей ткани, которая необходима для регулирования прогрессии опухоли. Таким образом из-за этих ограничений, в естественных условиях модели, всегда должны использоваться для поддержки предварительные выводы в vitro моделей. В этом исследовании мы используем ячейки листа технологии для разработки в vivo животной модели, разъясняет полное биологический процесс лежащие в основе КЦУК.

Более чем десятилетие назад, создана лаборатория Окано новый метод тканевой инженерии, основанный на ячейку листа технологии3. Этот метод использует термо отзывчивым культуры пластика позволяют реверсивные клеток адгезии/отряд, контролируя гидрофобность поверхности. Этот метод позволяет нежный уборки культивируемых клеток в нетронутыми трехмерной (3-D) формате (i.e.,cell листа), с ухоженными внеклеточного матрикса (ECM) и ячеек для взаимодействия. Ячейки листа техника требует намывного культуры блюд с температуры отзывчивым полимера poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA Am), который является коммерчески доступны и готовы к использованию. При температуре ниже 20 ° C Пипа Am полимеров стать гидратированных и растворить в водных растворах, в то время как при более высокой температуре (37 ° C), полимеры становятся обезвоженной и превратить в мутным осадком. Полимер содержит гидрофильные Амида цепи и гидрофобных боковых цепей (изопропиловый группы). При высоких температурах броуновское движение молекул воды усиливается, в то время как при низкой температуре, агрегировать молекул воды, окружающие изопропиловый групп гидратированных структура разбивки и групп гидрофобных изопропиловый из-за гидрофобных взаимодействий. Таким образом всю цепь полимера агрегатов и осаждает4.

В исследовании представлены этот метод используется для разработать модель животных КЦУК, с использованием трех различных ячеек листов. Первый лист занятых состоит из КЦУК клеток линии клетки только, тогда как два других листов состоит из комбинации КЦУК клеток линии клеток и MSCs из двух разных источников: МСК костного мозга (BMMSCs) и пуповины MSCs (UCMSCs). MSCs, не гемопоэтических стромальные клетки, которые способны дифференциации intocell производных мезенхимы линии, включая адипоциты, остеоциты, хондроцитов и миоцитов5. Причина, по которой мы используем эти клетки при создании листа клеток рака является несовместимым отчетности о влиянии MSCs на раковые заболевания. Было высказано мнение о том, что MSCs может иметь два различных фенотипов: «MSC1», провоспалительные фенотип и «MSC2», иммунодепрессивные фенотип6. MSCs Экспресс Толл подобные рецепторы (TLRs). TLR4 грунтовка MSCs увеличивает их секрецию провоспалительных факторов, тогда как TLR3 грунтовка увеличивает их секрецию иммуносупрессивным факторам6. В vitro исследования этих двух фенотипов сообщил, что совместно культуры MSC1 с рак клеточных линий ослабленный рост раковых клеток, в то время как MSC2 совместного культура имела противоположный эффект7. Это подразумевает, что MSCs может быть про рак или противоопухолевых, в зависимости от их фенотип. Таким образом, в дополнение к разработке модели на животных КЦУК, с помощью технологии cell лист, мы хотим изучить влияние MSC пересадки на развитие опухоли, и ли используя эти клетки будут повысить или снизить разработки этой модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол следует животных ухода руководящие принципы этического Комитета университет короля Сауда. Университет короля Сауда этического комитета утверждаются хирургических процедур, анестезии и другие препараты, используемые на животных. Все экспериментальная работа выполняется квалифицированными специалистами.

1. ячейки листа строительство

  1. Промазывают неразбавленном плода бычьим сывороточным (ФБС) культуры (блюда температуры отзывчивым культуры 3,5 см) и обеспечить, чтобы покрыть всю поверхность блюдо.
    Примечание: Этот шаг имеет важное значение для отряда ячейки листа, так как он поддерживает рост клеток в монослое и препятствует агрегации клеток.
  2. Инкубируйте блюда для 24 ч при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2 и 95% воздуха.
  3. Удалите избыток FBS с покрытием блюда и позволяют блюда высохнуть при комнатной температуре (RT) для по крайней мере 1 час.
  4. Подготовить три клеточных суспензий: 1 x 10-6 HepG2 клетки, клетки 1 x 10-6 HepG2 с BMMSCs и HepG2 1 x 106 клеток с UCMSCs (в соотношении 4:1 для BMMSCs и UCMSCs).
  5. Семя подвесные каждой меткой блюдо на соответствующую ячейку.
  6. Приостановите все клетки в среде DMEM культуры, с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
  7. Инкубируйте клетки при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2 и 95% воздуха.

2. ячейки листа отряд

  1. На 100% клеток слияния взять блюда из инкубатора 37 ° C.
  2. Инкубируйте HepG2 ячейку листа блюдо за 1 час на RT, время инкубации HepG2/ИЗУЧЕНА и HepG2/UCMSC ячейку листа блюда для 30-40 мин при 20 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2 и 95% воздуха.
    Примечание: Ячейки листа из только HepG2 хрупкие; снижение температуры до 20 ° C наносит ущерб структуре листа.

3. эффективность хирургической процедуры

Примечание: Во время инкубации клеток листа отряд, начать процедуру животных.

  1. Инструкции по подготовке области хирургии
    1. Проведение всех хирургических процедур в стерильных отдельной области в пределах лаборатории, как капот, Ламинарный шкаф или Обслуживание асептических хирургии. Обеспечить все поверхности области хирургии не пористых, герметичные, прочный и sanitizable.
    2. Носите надлежащей защитной одежды, включая скрабы, перчатки, маски и головы и обуви обложек.
    3. Использование хирургических инструментов, которые являются чистыми и стерилизовать (через автоклавирования; насыщенный стволовых под высоким давлением) в начале операции.
    4. Изменить перчатки между крысами.
  2. Подготовка животного для хирургии
    1. Используйте 8 - до 12-недельных обнаженной крыс.
    2. Создание инъекционный наркоз для крыс.
      1. Подготовить раствор анестезии, кетамин Ксилазина, смешать 2 мл кетамина, 1 мл Ксилазина (в концентрации 20 мг/мл) и 1 мл стерильный физиологический раствор (например, 0,9% хлорида натрия) во флаконе коллекции стерильные 10-мл сыворотки и хорошо взболтать перед использования.
      2. Чтобы применить анестезии, придать 0,2 мл раствора кетамина ксилазина на 100 г веса тела крысы внутрибрюшинно.
        Примечание: Общая доза раствора составляет 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг Ксилазина.
    3. Удаления видимых грязь/мусора с хирургической сайта.
    4. Проверка глубины анестезии путем тестирования педали вывода рефлекс (ноги колодки пинча на обе задние ноги).
      Примечание: Ноги колодки щепотку вызывает реакцию, повторить в дозе 0,05 мл/100 g (примерно каждые 30 минут), если перепроверить глубины анестезии.
    5. Лечить области хирургии с двухступенчатой скраб, повидон йод/изопропанола.
    6. Обложка Крыса с стерильных пелерина, чтобы избежать загрязнения разреза.
    7. Придать крысы подкожно с бупренорфин (0,01 - 0,05 мг/кг)8 до делать разрез.
    8. С помощью стерильным скальпель, сделайте 7 - до 10 см вырезать между скины и основные мышцы, чтобы разоблачить печени.
      1. Отдельных мышц живота от кожи с плоской задней кромки скальпель.
      2. Аккуратно ножом linea alba с помощью скальпеля и расширить разрез с острыми ножницами.

4. ячейки листа трансплантация

Примечание: Трансплантация клеток листа выполняется на печень.

  1. Соберите ячейку листа от культуры блюдо.
    1. Аккуратно нажмите культуры блюдо над скамейки, чтобы отсоединить листа от его поверхности.
    2. Отдельные ячейки листа от блюдо поверхности соскабливания край листа в половину круга, используя кончик стерильной пипеткой.
    3. Аккуратно удалите весь носитель из культуры блюдо.
    4. Убедитесь, что лист нетронутыми без ущерба; в противном случае, он не может быть использован (рис. 1).
      Примечание: Результирующий листы могут быть обнаружены непосредственно в глаз.
  2. Подготовьте стерильные мембраны (фильтровальная бумага) урожай ячейку листа от блюдо.
    1. Во-первых выдержите мембрану с нормальное saline. Затем удалите избыток физраствора с стерильным ватным тампоном.
    2. Поместите мокрой мембраны клетки листа, избегая складок и пузырьков воздуха между мембраной и ячейки листа.
    3. Добавьте несколько капель нормальное saline через мембраны и клетки лист, чтобы собрать их легче.
      Примечание: Чтобы избежать нарушения ячейки листа, не использовать холодной соленой и поднимите мембраны и ячейки листа с щипцами.
    4. Оставьте мембраны на несколько секунд, чтобы обеспечить, что ячейки листа правильно присоединен к мембране, а затем собрать его.
  3. Подготовка печени для трансплантации клеток листа.
    1. Убедитесь, что поверхности печени сухие, слегка нажав с стерильным ватным тампоном.
    2. С помощью стерильный пинцет, поместите мембраны клетки листа один лепесток печени крыс.
    3. Добавить несколько капель стерильного физиологического раствора и применить нежное давление мембраны для отсоединения ячейку листа от него.
    4. Подождите 5 минут тщательно снятием мембраны.
      Примечание: Это делается для обеспечения что ячейки листа правильно подключен к печени.
    5. Наконец закройте основных мышц и кожи разрезов с нейлон швами 5-0.
    6. Лечить области хирургии с повидон йод.
      Примечание: На рисунке 2 показана схема процедуры трансплантации клеток листа на печени обнаженной крысы.

5. послеоперационный уход

  1. Сразу же после операции, дом крысы индивидуально, чтобы избежать каннибализма или удушья и контролировать его регулярно (по крайней мере каждые 15 мин) до тех пор, пока это сознательное и полностью передвигающихся самостоятельно.
  2. Затем оценить крысам ежедневно в течение 5-14 d, по крайней мере 5 d постоперационно, чтобы обеспечить, что есть никаких осложнений. В ходе ежедневной оценки убедитесь, что следующие.
    1. Рана будет закрыт, и швы нетронутыми, не будучи чрезмерно жесткой.
    2. Есть никаких признаков инфекции в разрез сайта, например тепла, чрезмерная опухоль, или гнойные выделения.
    3. Есть никаких признаков, связанные с болью, таких, как сокращение потребления пищи и воды, потеря веса, обезвоживание, кожи палаток или дыхание быстрое и открыть рот. Для управления умеренной или сильной боли после операции если таковые имеются, придать крысы подкожно с бупренорфин (0,01 - 0,05 мг/кг) каждые 6-8 ч9 как минимум 48-72 ч после операции.

6. анализ пересаженных района

  1. Один месяц после пересадки, scarifice крыса и собирать пересаженных области для гистологического и Иммуногистохимический анализ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Tumorigenicity листов пересаженные клетки крыс:

Один месяц после пересадки, все листы пересаженные клетки в печени крыс разработали опухоли (рис. 3). Средний размер развитых опухолей из HepG2, HepG2/ИЗУЧЕНА и HepG2/UCMSC клеток листы были 2,5 см, соответственно10, 4,5 см и 4 см.

Гистологичес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Обширные количество исследований посвящена разработке адекватной в vivo доклинических животной модели, напоминающий человека раковые заболевания. В настоящее время основные подходы, используемые для создания модели животных рака включают генной инженерии и клеток Трансплантация11. Генетически модифицированных животных модели являются хорошими инструментами для идентификации и проверки целевых генов, а также понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе лекарственно индуцированные то...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников экспериментальной хирургии и лабораторных животных в медицинский колледж, Университет короля Сауда, за их сотрудничество и поддержку, особенно Almukhayzim Хуссейн и Хишам Aloudah. Авторы также хотел бы признать СМИ команда университета короля Сауда бин Абдель Азиза для подготовки визуального материала особенно Muath Бен Ганнам и Абдулвахаб Alsulami.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагенты 
FBS Gibco/Invitrogen10270106
DMEM с высоким содержанием глюкозы SigmaD5671-500ML
Пенициллин/стрептомицин Life Technology15070063
Стерильный физиологический растворSigma S0817-1GA
Клеточная линия HepG2 человекаATCC, СШАHB-8065
МСК костного мозга человека клеточная линияPromoCell, СШАC-12974
ткань пуповины человека MSCsPromoCell, США C-12971
Кетамин 50%Ромпун, Байер
Ксилазин 2%Ромпун23076-35-9
Альфадин&рег;   решение.Riyadh PharmaLBL0816
Disposables: 
15 мл полипропиленовая прозрачная полипропиленовая центрифужная трубка из полипропиленаFalcon 
3,5 см стерильные чашки для культур UpCell с фильтровальной бумагой (мембраной)Sigma174904-1CS
100-1000 µ l   Наконечники для пипеток СигмаCLS4868-1000ЕА   
Базовая процедура ДрапировкаThermofisherPMD5293.0
Equipment 
Plus дозатор, переменный объемEppendorf®   Исследования&рег;Z683779-1EA
Инкубатор для культуры тканей 37° C, 5% CO2Любая марка
Шкаф биологической безопасностиЛюбая марка
Инкубатор для культуры тканей 20° C, 5% CO2Anybrand
Стерильные хирургические инструменты и обнаженные крысы: 
Щипцы
Ножницы
скальпель 
  Нейлоновый шов  5-0AccutomeAB-3854SМононить, Ланцет
1 мл Туберкулиновые шприцыFisherScientific 14-826-88
Обнаженные крысы Река
352097 Чарльз

Ссылки

  1. Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171(2011).
  2. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  3. Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
  4. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
  5. Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  6. Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088(2010).
  7. Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590(2012).
  8. Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
  9. Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017).
  10. Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004(2017).
  11. Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
  12. Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
  13. Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
  14. Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
  15. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
  16. Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
  17. Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
  18. Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HepG2
Изучение потенциала мезенхимальных стволовых клеток листа на развитие гепатоцеллюлярной карциномы In Vivo
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.