Мы описываем изменение мелкомасштабной добычи и колориметрические анализов лактата и пирувата в нематода C. elegans. При использовании коммерческих пробирного наборы, техническое развитие их чувствительность и точность имеет важное значение. Осадков белок в добыче является наиболее важным этапом для количественного определения внутриклеточных метаболитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лактата и пирувата являются ключевыми интермедиатов внутриклеточных энергии метаболических. Мониторинг соотношения молочной кислоты/пирувата в клетках помогает определить, является ли есть дисбаланс в метаболизме энергии, связанных с возрастом между митохондриальной окислительного фосфорилирования и аэробного гликолиза. Здесь мы покажем использование коммерческих колориметрического анализа комплектов для лактата и пирувата в организме модель C. elegans. Недавно чувствительность и точность колориметрии/Флуориметрическое пробирного наборы были значительно улучшилось, научных исследований и разработок, проводимых производителями реагента. Улучшенная реагентов позволили использование мелких анализов с 96-луночных пластины в C. elegans. В общем Флуориметрическое пробирного превосходит в чувствительности колориметрического анализа; Однако колориметрические подход больше подходит для использования в общих лабораториях. Еще одним важным вопросом в этих анализов для количественного определения является белок осадков гомогенизированные C. elegans образцы. В методе осадков белок, общие выделений (например., трихлоруксусная кислота, хлорной кислоты и metaphosphoric кислоты) используются для пробоподготовки. Бесплатно белка пробирного образец готовится непосредственно добавив холодной осадителя (конечной концентрации 5%), во время гомогенизации.
Введение
Концентрации лактата и пирувата широко рассматривается как промежуточные энергии метаболизма и связаны в Штаты гликолиза, цикла трикарбоновой кислоты (TCA) и электрон-транспортной цепи в клетках аэробных организмов. Серию реакций в гликолизе окисления глюкозы пируват, который находится на перепутье метаболических и могут быть преобразованы для углеводов через глюконеогенез, жирных кислот и метаболизм энергии через ацетил-КоА и аминокислота аланин. TCA цикл происходит при наличии достаточного количества растворенного кислорода и является основополагающим для преобразования глюкозы энергии. Особенно изменение вторичного метаболизма является интересным феноменом, в котор....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. синхронизированные культуры C. elegans
- Перед посевом, культура Escherichia coli (E. coli) штамма ОР50 на ночь при 37 ° C в 300 мл жидкой среды бульон Бертани Лурия (LB). Магазин искусственный ОР50-4 ° c.
- Чтобы сделать LB отвара жидкой среды, используйте 10 g Триптон, 5 г экстракта дрожжей, 10 г NaCl и 1,5 мл 1 N NaOH и добавить 1 Л деионизированной водой. Автоклав.
Примечание: ОР50 и C. elegans штаммы доступны из центра генетики Caenorhabditis (Университет Миннесоты, Сент-Пол, Миннесота, США).
- Чтобы сделать LB отвара жидкой среды, используйте 10 g Триптон, 5 г экстракта дрожжей, 10 г NaCl и 1,5 мл 1 N NaOH и добавить 1 Л деионизированной водой. Автоклав.
- Чтобы сделать нематоды роста среднего (НГМ) агар, используйте 3 g NaCl, 2.5 g Пептон, 17 g ага....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С помощью колориметрических анализов для количественного определения концентрации лактата и пирувата, мы показали точность этих анализов, по сравнению с предыдущими докладами в C. elegans7,,8. Здесь процесс белка осадков во время извлечения образца был наиболее важным шагом для создания точных значений. Для осадков белок, общие выделений (например., ТСА, СПС, или metaphosphoric кислоты) может использоваться для п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
При использовании этих колориметрических пробирного наборы, наиболее важным этапом в пример извлечения для обнаружения клеточных лактата и пирувата точно в C. elegans является процесс белка осадков во время гомогенизации (рис. 1). Это не строго необходимо использовать тефлон гомогенизатор, как другие гомогенизаторы (например., Dounce и конические ткани кофемолки, или бисерные мельницы) также подходят для мелкомасштабной добычи червей. Мы не обнаружить сотовой лактата и пиру.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была финансово поддержана специальный исследовательский грант от Дайто Бунка университета для Сумино Янасэ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор для колориметрических/флуориметрических анализов лактата | BioVision | #K607-100 | колориметрический/флуориметрический 100 анализов; Хранить при -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate набор для анализа | BioAssay Systems | #EPYR-100 | колориметрический/флуорометрический 100 анализов; Хранить при -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | колориметрический анализ; хранить при |
| Трихлоруксусная кислота | Wako Pure Chemical | #207-04955 | хранить при комнатной температуре |
| Тефлоновый гомогенизатор | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Вместо Iwaki/Pyrex, доступно Wheaton |
Ссылки
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
