Методическая статья

Роман насыщения мутагенеза подхода: Один шаг характеристика регламентационный протеин привязки сайтов в РНК с помощью кислота

DOI:

10.3791/57816

⸱

21 августа 2018 г.

1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белки, связывающие специфических последовательностей РНК играют решающую роль в экспрессии генов. Подробная характеристика этих сайтов связывания имеет решающее значение для нашего понимания регуляции генов. Здесь описан пошагово подход для насыщения мутагенеза сайтов связывания белков в РНК. Этот подход является актуальной для всех сайтов связывания белков в РНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регулирование ген играет важную роль в развитии. Многочисленные дна и RNA-связывая протеинов привязать их последовательности с высокой точностью контролировать экспрессию генов. Эти регуляторные белки контроль экспрессии генов на уровне ДНК (транскрипция) или на уровне РНК (сплайсинга пре мРНК, сплайсингу, транспорт мРНК, распад и перевод). Определение нормативных последовательностей помогает понять не только как ген включен или выключен, но также какие гены течению регулируются определенной регламентационный протеин. Здесь мы описываем одноэтапный подход, который позволяет мутагенеза насыщенность сайта связывания белков в РНК. Она включает в себя допинг ДНК шаблон с одичал тип нуклеотидов в пределах привязки сайта, синтез отдельных молекул РНК с каждой фосфоротиоат нуклеотидов и изоляции связанной фракции после инкубации с белком. Помехи от дикого типа нуклеотидов приводит к их преференциальных исключение из фракции белков прыгните. Это контролируется электрофорез геля после выборочного химического расщепления с йодом Фосфодиэфирная облигаций, содержащих кислота (фосфоротиоат мутагенеза или PTM). Этот единый этапа насыщения мутагенеза подход применим к характеристике любого сайта связывания белков в РНК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регулирование ген играет важную роль в биологии. Гены могут регулироваться на уровне транскрипции сплайсинга пре мРНК, 3' конца формирования, РНК, перевод, локализация мРНК, распад, столб-поступательные изменения/стабильности, экспорт и т.д. , которые оба дна и RNA-связывая протеинов играют ключевую роль в ген регулирование. В то время как молекулярные генетические анализы выявили многочисленные регуляторные белки, лишь немногие из них характеризовались полностью их клеточных функций или привязки сайтов в естественных условиях. Филогенетические последовательность анализа и мутагенез предлагают взаимодополняющие подходы к характеризуют ДНК или РНК белковых взаимодействий.

RNA-связывая протеинов важны в процессы развития, включая половой дифференцировки. Дрозофилы белка, секс смертельное (SXL) или мастер секс переключатель белков отсутствует в мужчины, но присутствует в женщин. Она признает уридина богатых последовательностей или пиримидин участки прилегающие к конкретным соединитель сайтов в нижнем пре мРНК цели (трансформатора, секс смертоносноеи специфичные для мужчин lethal2) в соматические клетки1,2 ,3,4. Кроме того он регулирует сплайсингу сайт переключение путем привязки к уридина богатые сплайсингу усилитель последовательностей в усилитель элементарный (e(r)) Стенограмма5,6. SXL вероятно регулирует дополнительных целей в женской микрофлорой, которые предстоит определить1,,78,9,10,11, 12 , 13.

Как правило характеристика привязки сайта включает мутагенеза, например, путем удаления или замены одного или нескольких нуклеотидов. Каждый сайт мутант привязки, относительно одичал тип РНК последовательности, затем анализируются с помощью ряда концентрации белка для определения его сродство (Kd или равновесия диссоциации постоянная) для протеина интереса; K-d является концентрация белка, необходимого для получения 50% РНК привязки. Этот трудоемкий процесс подробных мутагенеза включает поколения и анализ многочисленных мутантов — трех нуклеотидов дикого типа для каждой позиции в привязки сайта. Таким образом существует необходимость альтернативного подхода для быстрый, простой и недорогой насыщения мутагенеза сайтов связывания белков в РНК.

Здесь мы описываем одноэтапный подход, который позволяет мутагенеза насыщенность сайта связывания белков в РНК. Она включает в себя допинг ДНК шаблон с одичал тип нуклеотидов в пределах привязки сайта, синтез отдельных молекул РНК с каждой фосфоротиоат нуклеотидов и изоляции связанной фракции после инкубации с белком. Помехи от дикого типа нуклеотидов приводит к их преференциальных исключение из фракции белков прыгните. Это контролируется электрофорез геля после выборочного химического расщепления с йодом Фосфодиэфирная облигаций, содержащих кислота (фосфоротиоат мутагенеза или PTM). Этот единый этапа насыщения мутагенеза подход применим к характеристике любого сайта связывания белков в РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: На рисунке 1 обзор фосфоротиоат мутагенеза и обобщаются основные шаги в процессе.

1. Генерация библиотеки мутантов — допинг ДНК шаблон с дикого типа нуклеотидов

  1. Синтезировать T7 грунт (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') путем химического синтеза на синтезатор ДНК.
  2. Синтезировать легированных олигонуклеотида (дополнительные пряди) путем химического синтеза на соответствующий сайт связывания белка синтезатор ДНК. Используйте соответствующую смесь Фосфорамидиты во время химического синтеза для каждого сайта допинг (X ниже) при соотношении 90% A как одичал тип нуклеотидов и 10% T как дикого типа нуклеотидов (см. Представитель результаты более подробно на этот коэффициент).
    Примечание: Здесь, последовательность легированных олигонуклеотида, 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. Подчеркнутые последовательности является обратный дополнением SXL сайт связывания белков, плюс дополнительные нуклеотидов вне привязки сайта, которые предоставляют полезные элементы, подтверждающий, что не каждое изменение в РНК влияет на обязательную силу, а также загрузки элементов управления для Сравнение и нормализации нуклеотидов в пределах привязки сайта. SXL-привязки узла последовательности UUUUUGUUGUUUUUUUU, который присутствует в трансформатор пре мРНК14,,1516,17, был использован для разработки предлагаемой методологии. Последовательность в курсив дополняет последовательность праймера T7 и промоутер T7 для в vitro транскрипция.

2. синтез РНК

  1. Синтезировать RNA в 20 мкл транскрипции реакции, как описано18.
    1. Буфер транскрипции Mix T7 и 1 мкм T7 олигонуклеотида, 1 мкм легированных олигонуклеотида, 10 мм Дитиотреитол (DTT), 2 мм ГТФ, 1 мм АТФ, CTP и UTP (гуанозина, аденозин, Цитидин и уридина трифосфат) и 2 U/мкл T7 РНК-полимеразы.
    2. Добавить в двух отдельных microcentrifuge трубы, 0,167 мм α-Тио АТФ или 0,05 мм α-Тио UTP для включения кислота (см. схема на рис. 2) в РНК.
      Примечание: Для альтернативных протоколов, добавьте 0,2 мм α-Тио CTP или 0,2 мм α-Тио GTP реакция соответствующей транскрипции, содержащие легированных олигонуклеотида для тестирования двух оставшихся замен нуклеотидных.
    3. Инкубировать смесь реакции синтеза РНК втечение 2 ч при 37 ° C.
  2. Добавьте 2.5 мкл тепло лабильного щелочной фосфатазы и 2,5 мкл 10xphosphatase буфер образца РНК. Инкубируйте этого 25 мкл реакции на 10 – 30 минут при 37 ° C для удаления 5' фосфатов.
  3. Инактивирует фермент щелочной фосфатазы путем нагревания при 80 ° C для 2-5 мин.
  4. Radiolabel к 5' концу dephosphorylated РНК (5 pmole) с использованием 1 мкл T4 полинуклеотид киназы и 1 мкл γ -32P АТФ в объеме 10 мкл реакции. Инкубировать смесь реакции на 30-60 минут при 37 ° C.
  5. Инактивирует фермент киназы полинуклеотид T4 путем нагрева при 65 ° C для 20-30 мин.
  6. Гель для очистки РНК электрофорезом в 10% Денатурирующий гель полиакриламида. Найдите РНК на геле радиоавтографией. Акцизный ломтик гель, содержащий radiolabeled РНК, раздавить в пробки microcentrifuge нажимая против стены с кончиком пипетки и замочить в протеиназы K (PK) буфера (100 мм трис, pH 7.5, 12,5 мм ЭДТА, 150 NaCl, лаурилсульфат натрия 1%). Поворот трубы при комнатной температуре от 2 h для ночевки.
  7. Центрифуга для суспензии геля, отказаться от геля и собирать буферного раствора.
  8. Извлечь решение дважды с равным объемом фенол хлороформ и один раз с хлороформом и собирать водной фазе.
  9. Добавить в водной фазе 0,1 объема 3M ацетат натрия, рН 5.2, перевозчик tRNA или гликогена и 2,5 объем этанола. Держите образец-80 ° C в течение 1 ч.
  10. Центрифугуйте образцы для 5 – 10 мин в высокой скорости microcentrifuge на 16,873 x g. Осторожно извлеките буфер/этанола раствор не нарушая Пелле РНК.
  11. Помыть лепешка с 70% этанола и центрифуги для этанола удалить 2 – 5 мин тщательно. Сухие гранулы в воздухе.
  12. Ресуспензируйте гранулы в 20 – 50 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды. Хранить при температуре от-20 ° C до использования.
    Примечание: Все действия с radiolabeled РНК, с использованием надлежащих мер предосторожности и оргстекла щита для защиты от радиации. В настоящее время спина столбцы являются более часто используемых и более удобным для удаления неинкорпорированных радиоактивности, как альтернатива очищение геля РНК.

3. белки обязательную силу реакции и разделение связанных РНК

  1. Экспресс рекомбинантных белков в и очищают от кишечной палочки.
  2. Оценки концентрации рекомбинантных белков методом спектрофотометрии или путем разделения в геле полиакриламида SDS рядом известных белков стандарт, бычий сывороточный альбумин (BSA). Визуализируйте протеина интереса и BSA стандарта путем пятнать геля с Кумасси синим R-250. Quantitate белка по сравнению с известные количества BSA разведений на же гель.
    Примечание: Хранить рекомбинантных белков на - 80 ° C до использования и разбавленных в 20 мм 4-(2-гидроксиэтилкрахмала) пиперазина-1-ethanesulfonic кислота (HEPES), рН 8,0, 1 мм Дитиотреитол (DTT), 0,2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 0,05% NP-40, 20% глицерина. Использование 0,5-1,0 мм протеазы ингибитор phenylmethane сульфонилфторид (PMSF) является необязательным.
  3. Выполнять RNA-связывая реакции (20-100 мкл) в 10 мм трис-HCl, pH 7.5, 1 мм DTT, 50 мм KCl, 0.5 АБС битор РНКазы единиц/мкл, 0,09 µг/мкл ацетилированные альбумина bovine сыворотки, 1 мм ЭДТА, 0,15 мкг/мкл tRNA, 5'-конце radiolabeled РНК и соответствующей концентрации (6 мкл концентрация на котором ~ 50% РНК связывается с белком) белка.
    Примечание: Этот буфер привязка работает три RNA-связывая протеинов (SXL, U2AF65и ПТБ), но должны быть стандартизированы для протеина интереса. Оценить концентрацию белка эмпирически, с использованием различных разведениях для подготовки данного белка, который необходим для получения примерно 50% РНК привязки. Это условие или Kd представляет наиболее чувствительной частью RNA-связывая кривой.
  4. Инкубируйте реакции связывания белка для 20-30 мин при температуре 25 ° C (или на льду).
  5. Отделите белок прыгните РНК дроби от несвязанных дроби, используя один из двух подходов:
    1. Нитроцеллюлоза фильтр привязки
      1. Применять привязки реакции (20-100 мкл) нитроцеллюлоза фильтр подключен к вакуумный коллектор при комнатной температуре.
        Примечание: Только комплекс РНК белок сохраняется на фильтр и несвязанные РНК потоков через фильтр. Фильтр привязки подход позволяет выше восстановления связанных РНК и быстрее и проще, по сравнению с assay гель подвижности. Размещая открытое мембраны под нитроцеллюлоза фильтр также можно собирать несвязанных фракция РНК или бесплатные РНК для сравнения с привязанного дроби.
      2. Вырезать часть нитроцеллюлоза фильтр, содержащий сохраненных радиоактивных РНК на более мелкие куски вписываются в пробки microcentrifuge, Замочите в достаточно буфера PK (300 – 500 мкл содержащий 10 – 20 мкг PK) погружать части фильтра и элюировать РНК из фильтра для 2-3 часа или на ночь.
      3. Извлечение с фенол хлороформ, хлороформ и собирать водной фазе. Добавить ацетат натрия и этанола и после инкубации в морозильник, центрифуги, мыть, сухой и Ресуспензируйте РНК в DEPC-лечение водой. Выполните следующие шаги, как описано в шагах 2.10 в 2.14 выше.
    2. Перенос удобоподвижности геля
      1. Подготовить и полимеризоваться родной полиакриламидный гель 5% (60: 1 Acrylamide:bis-акриламида) в 0,5 x TBE (Стандартный буфер Tris-Борат-ЭДТА) перед началом привязки реакции, как альтернатива метод привязки фильтра.
      2. Предварительно запустите гель для 15 мин 250 V в холодной комнате (4 ° C).
      3. Загрузка каждой привязки реакции (см. выше) в отдельных скважинах выше предварительного хода геля.
        Примечание: Буфер хранения белка обеспечивает достаточную глицерин для загрузки образца в скважинах.
      4. Отделить белок прыгните РНК электрофорезом геля в холодной комнате 250 V для 1-2 ч, в зависимости от размера РНК и специфического протеина.
      5. Найдите положение РНК белок комплекса на геле радиоавтографией. Акцизный ломтик гель, содержащий комплекс РНК белок. Элюировать РНК от геля фрагмента путем дробления среза геля и замачивания в буфере PK.
      6. Извлечение с фенол хлороформ, хлороформ и собирать водной фазе. Добавить ацетат натрия и этанола, после инкубации в морозильник, центрифуги, мыть, сухой, воздуха и Ресуспензируйте РНК в DEPC-лечение водой. Выполните следующие шаги, как описано в шагах 2.10 в 2.14 выше.

4. анализ йода расщепляется фосфоротиоат продуктов для обнаружения мутант нуклеотидной позиции

  1. Добавить 1 мм йода в 20 мкл DEPC-лечение водой, содержащей до 10 мкг перевозчик tRNA прилепится РНК (связанными и общая RNAs) на участках фосфоротиоат инкорпорации. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
    Примечание: Более подробную информацию о йода расщепления с немного различных условий — 7% (v/v) iodoethanol, Отопление на 95 ° C 3 мин — можно найти в Gish & Eckstein 1988-19.
  2. Преципитат расщепляется РНК путем добавления натрия ацетат/этанола, как описано выше. Ресуспензируйте загрузки красителем для денатурации гели. Тепло и загрузки образца в отдельные фрагменты РНК путем электрофореза в геле полиакриламида денатурируя 15 – 20%.
  3. Разоблачить полиакриламидный гель для рентгеновской пленки.
  4. Обнаружить полосы в связанной фракции против общего пула с помощью авторадиографии.
    Примечание: Все действия с йода в вытяжкой. Для разделения РНК, показанный здесь применяется гель, клиновидные, которая достигается путем удвоения толщина обе распорки в нижней части пластины гелем, вставляя дополнительный дюйм длиной разделитель в нижней части геля. Эта форма позволяет более единообразной или ближе расстояние между короткие фрагменты РНК. Кроме того phosphorimager может использоваться вместо рентгеновской пленки для обнаружения и количественный радиоактивности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Принцип работы насыщения мутагенеза, используя допинг:

Для соответствующей молярное соотношение одичал типа и других нуклеотидов используйте равные смесь всех четырех нуклеотидов если только одну позицию для анализа. Однако, если несколько позиций анализируются одновременно, должны быть скорректированы соотношение дикого типа чтобы одичал тип нуклеотидов, т.е. сократить. В противном случае помимо одной замены, которые жела...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мутагенез уже давно используется для характеристики сайтов связывания белков. Во-первых ряд мутантов можно построены и индивидуально испытаны в обязательных анализов для анализа их воздействия на обязательную силу сходства. В то время как стандартный мутагенеза подход предлагает способ для анализа нескольких последовательностей, несколько шагов участвует в стандартный подход, например строительство мутантов и выполнение ряда обязательных реакций для каждого мутант, является трудоемким и требует много времени и не может р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор объявляет без финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор благодарит национальные институты здравоохранения для финансирования последних и спасибо Майкл р. Грин для синтеза олигонуклеотидов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уридин 5' a-тио трифосфатNEN (Бостон, Массачусетс)NLP-017
Аденозин 5' a-тио трифосфатNEN (Бостон, Массачусетс)NLP-016
Вакуумный коллекторFisher ScientificXX1002500Millipore  25  мм Стекло Микроанализ Вакуумный фильтр
Вакуумный коллекторMilliporeXX27025521225 Вакуумный коллектор для отбора проб
НитроцеллюлозаMilliporeHAWP
NitrocelluloseSchleicher & SchuellPROTRAN
Набор для дефосфорилляцииNEBM0508
T4 ПолинуклеотидкиназаNEBM0201S
Протеиназа KNEBP8107S
T7 РНК-полимеразаNEBM0251S
РНКазинPromegaРНКаза ингибитор
стеклянных пластинстандартныйстандарт
Оборудование для гель-электрофорезаСтандартСтандарт
Рентгеновские пленкиСтандартСтандарт
Полиакриламидные гелевые растворыСтандарт СтандартСтандарт

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
  2. Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
  3. Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
  4. Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
  5. Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
  6. Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520(2007).
  7. Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
  8. Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
  9. Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
  10. Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
  11. Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
  12. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
  13. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
  14. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
  15. Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
  16. Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
  17. Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
  18. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
  19. Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

T7DEPC

Похожие статьи