Методическая статья

Метод Set реплики: Высок объём подход к количественной мерой Caenorhabditis elegans продолжительность жизни

DOI:

10.3791/57819

⸱

29 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем метод набора реплик, подход к количественной мерой C. elegans жизни/выживание и healthspan высокой пропускной способности и надежным образом, таким образом позволяя скрининг многих условий без ущерба для качества данных. Этот протокол подробности стратегии и представляет собой программное обеспечение инструмент для анализа данных набора реплик.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод набора реплик является подход к количественно измерить продолжительность жизни или выживание нематоды Caenorhabditis elegans в духе высокой пропускной способности, таким образом позволяя один следователь на экран более лечения или условий за то же количество время без потери качества данных. Этот метод требует общего оборудования в большинстве лабораторий, работающих с C. elegans и таким образом просто принять. Этот подход центров на опробование независимых выборок населения в каждой точке наблюдения, а не один пример со временем как с традиционными методами продольной. Озвучивание влечет за собой добавление жидкости к скважинам несколькими хорошо плиты, которая стимулирует C. elegans для перемещения и облегчает количественного определения изменений в healthspan. Другие основные преимущества метода набора реплик включают снижение воздействия агар поверхностей переносимых по воздуху загрязнителей (например плесень или грибок), минимальная обработка животных, и надежность на спорадические неправильно озвучивание (например вызов животного как мертвый, когда он по-прежнему жив). Надлежащим образом анализировать и визуализировать данные из набора реплик стиль эксперимент, был также разработан инструмент заказного программного обеспечения. Текущие возможности программного обеспечения включают в себя предоставление кривых выживания как набора реплик и традиционных (Каплана-Мейера) эксперименты, а также статистический анализ для набора реплик. Протоколы, представленная здесь описать традиционные экспериментальный подход и метод набора реплик, а также обзор соответствующего анализа данных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из наиболее трансформативных технологических достижений на пути к пониманию генетическую основу старения является развитие на основе кормления RNAi в C. elegans1; до экспериментального использования РНК-интерференции многие фенотипов старения не были генетически шансов справиться с возникающими. Кормление-на основе RNAi достигается за счет производства двуцепочечной ДНК в E. coli , который соответствует эндогенных C. elegans мРНК: IPTG индуцирует двунаправленный транскрипции через вставки либо C. elegans cDNA или часть кадр в открытом чтения в плазмиду2. Когда C. elegans питаются нетронутыми двуцепочечной ДНК кишечной палочки, производится бактериями перевезены из просвета в кишечной клетки через белка трансмембранного SID-23и затем распространяются через остальную часть животного через SID-14. В каждой ячейке, экзогенных dsRNA обрабатывается Dicer комплекс в siRNA, которые взаимодействуют с зрелой мРНК через дополнительные низкопробный спаривать для создания нового малых интерферирующих РНК мРНК дуплекс. Этот дуплекс признан комплекса RISC и расщепляется, тем самым унижающего достоинство эндогенного мРНК5. Таким образом просто изменив Вставка плазмида, один можно инактивировать функции практически любого гена в геном C. elegans . Это открытие привело к созданию нескольких крупных RNAi кормления-на основе библиотек коллекции преобразован E. coli запасов, которые могут быть объединены для достижения охвата примерно 86% известных C. elegans генов6, 7.

С выдвижением на основе кормления интерференции всеобъемлющей экраны в C. elegans привели к открытию более чем 900 генов, которые изменяют жизни когда инактивированных (что подтверждается RNAi фенотип ассоциаций, куратор в WormBase), который мы называем в качестве gerogenes. Роль для большинства gerogenes в долголетия управления был обнаружен путем кормления-на основе RNAi в нескольких докладах семенных (см. Рисунок 1A и дополнительный файл 1 для подробной информации). В некоторых случаях эти gerogenes были определены на основе измерения жизнеспособности на один или несколько пунктов времени, который не обеспечивает количественной мерой изменения в жизни с лечением RNAi. В других случаях эти гены были количественно оценены изменения в жизни, а также дополнительные связанные возраст фенотипов. К примеру мы определили ранее 159 генов, которые необходимы для нормальной и повышенной продолжительность жизни животных с снижение инсулина/IGF-1 сигнализации и количественно изменения в healthspan. Из них 103 гена inactivations привести к progeric фенотип, поскольку потери привели к один или более признаков преждевременного старения8.

Хотя некоторые gerogenes были связаны с или более 100 исследований (например, daf-16, daf-2, сэр-2.1), свыше 400 gerogenes имеют 10 или меньше цитаты (рис. 1Bи дополнительный файл 2). Таким образом хотя всеобъемлющий кормления-на основе экранов RNAi обнаружили и бегло охарактеризовал сотни предполагаемого gerogenes, как эти функции генов долголетия управления и генетических взаимосвязей между этими продукты гена остаются плохо изучал. Полный продольного анализа для возраста связанные фенотипов является необходимым условием для выявления генетических взаимодействий между gerogenes (например epistatic взаимодействия, asynthetic взаимодействия, и т.д.). Получить более глубокое понимание генетических взаимосвязей между gerogenes требует высокой пропускной способности количественный метод, который также использует преимущества кормления-на основе RNAi.

Наиболее распространенными суррогатной старения определяется продолжительность жизни. Традиционный подход для измерения смертности C. elegans отслеживает гибели отдельных животных со временем в рамках небольшой выборки. Относительно небольшое количество животных идут с течением времени и периодически осторожно ткнул с провода платины или ресниц, с движением как показатель жизнеспособности (рис. 2A). Этот метод широко используется, поскольку она обеспечивает простой, прямые измерения средняя и максимальная продолжительность жизни. Однако этот традиционный метод требует много времени и относительно низкой пропускной способностью, которая ограничивает количество животных и условий, которые могут быть измерены одновременно контролируемым образом. Недавнее исследование моделирование показало, что многие исследования C. elegans жизни не пробирного достаточно большое количество животных, чтобы иметь возможность надежно обнаружить небольшие изменения между условия9. Кроме того этот традиционный метод предполагает неоднократно обработка же когорты животных с течением времени, который в свою очередь может ввести загрязнение и может повредить или убивать животных, неустойчивое, возрасте.

Мы разработали альтернативные «набора реплик» методологию для измерения C. elegans продолжительность жизни. С этой целью большое население возраста синхронизированы, isogenic животных делятся на ряд небольших групп населения (или реплик). Образцы достаточно реплики создаются для покрытия каждый момент запланированного эксперимента. В каждый момент времени наблюдения одна из реплик забил на количество живых мертвецов и цензуре животных, а затем животных в пределах этой репликации удаляются. Таким образом над ожидаемой продолжительность жизни населения в целом, ряд независимых субпопуляций периодически пробы (рис. 2B). В использовании наборов реплик есть нет повторяющихся подталкивая животных и не многократное воздействие потенциального загрязнения окружающей среды. Жизнеспособность, наблюдается в одноразовый точке является полностью независимым от каждого наблюдения, которая минимизирует обработки и увеличивает пропускную способность, по крайней мере на порядок. Это позволило нам чтобы quantitate изменения в жизни для сотни RNAi клоны одновременно8,10.

Здесь мы представляем подробные протоколы для проведения C. elegans жизни через набора реплик и традиционные методы для озвучивания C. elegans долголетия. Мы демонстрируем, что аналогичные результаты получены между методами. У нас есть разработки программного обеспечения для оказания помощи в графическом анализе срок службы данных, получаемых через любой подход, который мы свободно предоставляют под лицензией GPL V3 (см. таблицу материалов). «WormLife» написана в R-11и включает в себя графический интерфейс пользователя (GUI) для построения данных, которая была протестирована в Mac OS и Linux. Наконец мы сравнить и противопоставить недостатки каждого метода и выделить другие соображения при выборе между подходами для измерения количественных изменений в C. elegans продолжительность жизни.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. традиционный метод для скоринга C. elegans долголетия

  1. Подготовка реагентов
    1. Определите гены инактивированной через систему РНК-интерференции на основе кормления. Приобрести преобразованные запасы HT115 E. coli2 содержащий RNAi клон интерес. Кроме того subclone кДНК гена интереса в multicloning сайт L4440 плазмиды.
      Примечание: HT115 является штамм РНКазы III-недостаточным E. coli с IPTG-индуцибельной T7 полимеразной активности, который используется для предотвращения деградации двуцепочечной ДНК внутри бактерии. Срок службы исследований, которые не используют систему РНК-интерференции на основе кормления HT115 или ОР50 E. coli на стандартных NGM пластины может быть используемым.
    2. Подготовка 3 – 6 (или более) 6 см пластины RNAi в условие теста (дополнительные 3 файла для рецепта). Храните RNAi пластины на 4 ° C до посева бактерии до нескольких месяцев.
    3. Растут преобразованные E. coli на ночь (16 – 20 ч, 37 ° C, пожимая инкубатор на 180 – 220 об/мин).
      Примечание: HT115 E. coli выращивается в LB с ампициллин (50 мг/мл). Стандартный ОР50 E. coli не устойчивые к антибиотикам и выращивается без ампициллина. Объем культуры зависит # пластин, но, как правило, между 8 и 100 мл фунтов, в зависимости от экспериментальный дизайн.
      1. Концентрат бактерий центрифугированием в 3000 x g 15 – 20 мин в центрифуге benchtop. Аспирационная супернатанта и вновь приостановить гранулы на 1/10 Начиная объема (т.е. 10 x) в LB с ампициллина HT115 (или без ампициллин для стандартных ОР50).
      2. Аликвота 200 мкл сосредоточено 10 x бактерий для каждой пластины 6 см. Подготовка 3 – 4 реплицирует на условие теста, 2 дополнительных резервных пластинами, которые будут использоваться в случае загрязнения. При подготовке пластины, маркировать их, так что экспериментатор, скоринг пробирного слепых в экспериментальных условиях, используя код цвета или аналогичные схемы кодирования. Убедитесь, что код записывается.
      3. Позволяет открыть пластины сухой в чистой среде, например скамейке ламинарного потока до тех пор, пока впитала все жидкости или разрешить покрыты пластины для просушки на скамейке на ночь. Контролировать пластин во время сушки, что обеспечивает агар сухой без чрезмерного высыхания.
        Примечание: Чрезмерное сушки пластин приводит к растрескиванию, что приведет к C. elegans рыть в агар агар. Мокрой поверхности агара также поощрять рыться.
    4. Храните сушеные пластины в червь поле на ночь (до 24 ч) при комнатной температуре, чтобы позволить индукции производства двуцепочечной ДНК. После 1 дня на RT Храните пластины на 4 ° C на срок до 2 недель в запечатанном zip-lock мешок (для предотвращения высыхания плиты). Перед использованием возвращение пластины в комнатной температуре внутри zip-lock мешок, чтобы предотвратить конденсацию от введения воздуху грибковых загрязнителей.
  2. Синхронизация C. elegans с гипохлоритом лечения
    Примечание: Смотрите дополнительные 3 файла для M9 и гипохлорита раствор рецепты.
    1. Собирайте беременных взрослых животных с M9. Используйте подключен стеклянной пипетки для перемещения 2 х 15 мл пробирок.
    2. Спин трубы для 30» в ~ 2000 об/мин. Проверьте наличие резерва на нематод в нижней части трубки. Аспирационная супернатант. Мыть два раза раствором M9, повторяя спин и аспирации.
    3. Вновь приостановите C. elegans в 4 мл M9. Добавьте 2 мл раствора гипохлорита. Сразу же вихрь ~ 3 мин, с периодические энергичные встряхивания. После 3 минут ищите облако яйца под микроскопом рассечения. Вихревой дополнительные 10 – 20 s если яйца не были выпущены через 3 мин.
      Примечание: Сроки лечения гипохлорит имеет важное значение. Яйца в пределах беременных взрослых являются, что выжить лечения. После ~ 3 мин вскрывать беременных взрослых и яйца проливаться. Однако если яйца находятся в растворе гипохлорита слишком долго после освобождения они умрут. И наоборот если беременных взрослых не осталось гипохлорита раствор достаточно долго, без яиц будет выпущен.
    4. Быстро промойте раствором M9 дважды как шаг 2.1.2.
    5. Вновь приостановите C. elegans яйцо Пелле в 3 мл M9 и передачи новой трубки 15 мл. Позволить эмбрионов люк на ночь в 3 мл раствора M9 с вращением на 20 ° C.
    6. Рассчитать плотность L1 животных (или эмбрионы) за мкл, сбрасывая 10 мкл раствора L1 3 x 6 см пластины и подсчитать количество животных L1, чтобы вычислить среднее количество Л1С/мкл.
      Примечание: L1 животных будет урегулировать с течением времени. Таким образом следует периодически смешанного решения L1.
    7. Семя 50 L1 животных за тарелку. Инвертировать пластины и уплотнения с резинкой. Поместите пластины в пластиковой червь ящик. Уплотнение коробки в большой zip-lock мешок. Перейти к 20 ° C инкубатора.
  3. Предотвращение производства потомства путем добавления 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUdR)
    1. Расти животных до стадии L4 при 20 ° C. Проверить, чтобы увидеть ли синхронизироваться животные разработали для L4 приблизительно 40 h после посева (шаг 2.1.7).
      Примечание:C. elegans развития время будет отличаться при различных температурах,12 и темпы роста мутанта животных, для которых не характеризовались ставки должны испытываться эмпирически.
      1. Мкл 160 50 x FUdR для каждой пластины 6 см с животными L4.
        Примечание: Важно, чтобы добавить FUdR на стадии L4. Для удобства сделайте 1000 x запасы FUdR, растворяя 1 g FUdR в 10 мл сверхчистого H2O. фильтр-стерилизуйте фондовая FUdR с 0,2 мкм фильтром и 10 cc шприца. Аликвота ~ 1 мл бульона в стерильных 1.5 мл пробирок. Заморозить и хранить при температуре от-20 ° C.
    2. Осмотрите пластины для присутствия мужчин C. elegans. Удалите все мужчины.
      Примечание: срок службы обычно измеряется гермафродитки и не мужчин. Гермафродитки, которые спариваются живут меньше, чем unmated животных, даже в присутствии FUdR13. Самцы меньше и тоньше затем гермафродиты и может быть легко идентифицирован отличительной хвост подключили14.
    3. Установите флажок в zip-lock мешок. Возвращение в 20 ° C инкубатора.
  4. Озвучивание жизнеспособность
    1. Оценка жизнеспособности ежедневно нежно прикасаясь животное на голове с помощью провода платины или ресниц. Оценка животных, которые не в состоянии двигаться как мертвые и удалить их из пластины (рисунок 2A). Запишите номер, наблюдается мертв для каждого условия для каждой точки время наблюдения.
      Примечание: Для снижения риска скоринга предвзятости, экспериментатор должен оставаться слепым в экспериментальных условиях и аналогичным образом не должна ссылаться на результаты от предыдущих точек времени во время озвучивания.
    2. Цензор животных, которые разрыв, умирают от других очевидных развития дефектов, или обхода вверх на стороне блюдо: удаление этих животных и запись, номер на каждой отмечено время точкой для рассмотрения в рамках статистического анализа. Кроме того если мужчины будут найдены, удалите их и записать номер наблюдается.
    3. Повторите шаг 1.4.1 ежедневно до тех пор, пока не животные остаются живыми.
      Примечание: Если газон E. coli существенно уменьшится или грибок начинает расти на пластину, передать все остальные животные свежие пластины с соответствующим RNAi и FUdR.
  5. Данные анализа - черчения и статистика
    1. Ввод или открыть записанные наблюдения данные в программное обеспечение поддерживает анализ выживаемости с непараметрические Каплана-Мейера оценщик15 и лог ранг теста16 ( дополнительный файл 3см). Не забудьте включить цензуре животных. Не включают мужчин, которые были замечены, если таковые имеются.
      Примечание: форматы данных могут отличаться между программного обеспечения, но общий формат для записи каждого отдельного животного, наблюдается на отдельной строке. Экспериментальная timepoint, в которой животное было отмечено как мертвые это время «событие». Если цензуре, время «события» является timepoint, в которой животное была подвергнута цензуре. Обычно существует поле или флажок, чтобы указать цензуре наблюдений.
    2. Участок Каплана-Мейера кривых выживания. Выберите меньше шести условий для одного участка, если много условий дубликатах для улучшения читабельности.
      1. Проверить наличие данных вопросов, которые визуально ясно отсутствующих наблюдений, управления неожиданные результаты и т.д. — и решения этих проблем до статистического анализа.
    3. Используйте функцию тест лог ранг в ваше программное обеспечение для попарного выполнения статистических сопоставлений. Убедитесь, что любые имеющиеся варианты для лечения цензуре результаты надлежащим образом установлены для право цензуре данных.

2. реплики метод Set для скоринга C. elegans долголетия

Примечание: в то время как традиционный метод требует 3 – 6 пластин за состояние (1.1.2 см. выше), метод набора реплик требует много больше (см. шаг 2.2.2 ниже). Традиционный метод следующим животных на пластину же на протяжении всего эксперимента (рис. 2A). В отличие от этого, с набора реплик животных забил только один раз: многие идентичные реплицирует настроены в начале эксперимента, чтобы реплицировать один забил в каждый момент времени (за судебного разбирательства) (рис. 2B).

  1. Настройка библиотеки.
    Примечание: Дополнительные подробности о передаче RNAi клоны покрыта здесь, как набора реплик, протокол поддается одновременное скоринга много RNAi клонов, и может быть расширена до более чем 100 клоны одновременно. Коллекции RNAi клонов сохранились как глицерин запасов в 96-луночных формат плиты. Реплика набора экспериментов используйте 24-ну пластины. Каждый хорошо это условие различных теста, которые могут соответствовать коллекции RNAi клоны, различных химических обработок, животных штаммов, и так далее.
    1. Соберите макет sublibrary для коллекций RNAi клонов, таким образом, что выполнены следующие условия:
      1. Убедитесь, что в течение 96-луночных коллекции, хорошо A1 пустой вектор отрицательного контроля.
      2. Вставка элемента дополнительные пустой вектор случайным образом в течение каждого 24 скважины.
      3. 96-луночных пластины можно разбить блоки 24 скважин, таким образом, что каждый 24-ну пластины в одном случайно вставила отрицательный контроль (рис. 2 c).
      4. Вставка элемента позитивного управления случайным образом в каждой группе 24-Уэллс (рис. 2 c).
        Примечание: Положительный контроль зависит от экспериментальных вопрос. Например когда глядя на коллекцию RNAi клонов, увеличение продолжительности жизни, daf-2(RNAi) часто включается. И наоборот при взгляде на сокращенный срок службы, часто используется daf-16(RNAi) .
  2. Подготовка наборов реплик
    Примечание: количество необходимых реплицирует равен минимальное количество времени точек (рис. 2B). Надо знать a posteriori сколько нужно измерить продолжительность жизни до начала эксперимента, а также озвучивание частоты (например реплика набора эксперимент работает 40 дней с каждый забил день требует подготовки минимум 20 наборов для Каждое условие в начале эксперимента). Это целесообразно сделать ~ 5 дополнительных резервных наборов данных (см. 2.2.2 и 2.2.2.3 ниже).
    1. Чтобы создать свежие штамп sublibrary интерференции, инокуляции 200 мкл LB + Amp в колодец в формате 96-луночных (600 мкл пластины) с помощью репликатора 96-контактные пластины, следующие шаги:
      1. Стерилизуйте 96 пластина репликатор ПИН, последовательно погружая контакты в отбеливатель 50% сверхчистого H2O и этанола. Храните контакты погружаются на по крайней мере 30 s за шаги, дезинфицирующие средства и этанола.  После погружения в этаноле пламя советы кратко. Повторите эти действия.
        Примечание: не забудьте смыть всех отбеливателя и не оставляйте контакты подвергаются отбеливатель для длительных периодов времени, как отбеливатель может разъедать контакты из нержавеющей стали.
      2. Осторожно снимите крышку клей фольги из замороженных 96-луночных глицерин фондовых библиотек плиты и мягко, но твердо молоть советы репликатору стерилизованные пластины в колодцы запасов до сих пор замороженных глицерина. Инокуляции 200 мкл LB + Amp культур и печатью привитых пластины с проницаемой мембраны. Разрешить культур расти на ночь на benchtop.
      3. Стерилизовать репликатору пластины как шаг 2.1.1, тщательно удалить уплотнение из жидкого культуры пластины после ночи роста и погружать советы репликатор контактов. Применять советы с даже давление к прямоугольной LB amp + плита агара тет и передачи бактерий из контактов к пластине нежно с небольшое круговое движение, обеспечивая оставить достаточное пространство между соседними точками. Разрешить колоний расти на ночь на пластину агар на 37 ° C. Увидеть дополнительные 3 файла для приготовления LB + Amp/Tet пластины.
      4. Перед использованием Храните плита агара на 4 ° C Перевернутый (крышка стороной вниз), завернутые в фильме парафина.
        Примечание: Хранение колонии сторону крышку позволит конденсации кросс загрязнить RNAi клоны! Колонии E. coli могут храниться для 2-8 недель при 4 ° C, в зависимости от конкретного RNAi клоны, как клоны RNAi сохранять эффективность в стимулировании двуцепочечной ДНК после индукции IPTG для переменной длины времени. Для небольших коллекций RNAi клонов, RNAi эффективность должна быть эпирически определяется RT-ПЦР для подтверждения нокдаун.
    2. Вычислить минимальное количество 24-ну пластин, необходимых для одного разбирательства эксперимента: (# пластины в наборе реплик) x (ожидаемый # время очков). Убедитесь, что несколько наборов дополнительных реплик включены для рассмотрения таких вопросов, как загрязнение (Рисунок 2Б).
      Примечание: Общее количество клонов RNAi определяют количество пластин 24-хорошо сделать один набор реплик для каждой точки времени (рис. 2 c).
      1. Подготовка 24-ну пластины, как шаг 1.1.2 (дополнительные 3 файла для рецепта). Этикетке плиты при подготовке их так экспериментатор, скоринг пробирного будет слепой в экспериментальных условиях, используя код цвета или аналогичные схемы кодирования.
      2. Прививать один набор 1,5 мл LB + Amp культур для каждые 10 реплик (см. 2.2.2). Прививать культуру в 96 хорошо штанхглубинных пластины с помощью репликатора пластины (как 2.1.3) и бактериальных колоний от 2.1.4 (рис. 2 c, слева). Печать с дышащая мембрана, расти 20 h (37 ° C) при встряхивании.
      3. Семя 120 мкл ночь культуры для каждой пластины с помощью 6-ну многоканальные пипетки с регулируемым кончиком интервал (рис. 2 c, справа). Сухой плиты выявленных в Ламинарный шкаф до впитывания все жидкости. Не слишком сухой. Хранить пластины на ночь при комнатной температуре.
  3. Синхронизация C. elegans с использованием гипохлорита лечение
    1. Рассчитать минимальное количество животных, необходимых для эксперимента: минимальное число необходимых Л1С = (15-20 животных/хорошо) (24 скважин/плита) (X набора пластин/реплик)(Y replica sets).
      Примечание: метод набора реплик требует больше животных, чем традиционный метод. Одна пластина 10 см, полная беременных червей могут предоставить 20 000 – 50 000 L1 животных в зависимости от плотности беременных взрослых. Аналогичным образом двадцать 6 см пластины принести вокруг ~ 30000 L1 животных. План для подготовки яиц подготовки, которая удваивает минимальное количество животных необходимо. Если население в подготовке голодали, повторно корма или кусок к новой плите и позволяют по крайней мере три поколения на питание до возложат17,18. Убедитесь в том заморозить обратно оставшихся Л1С.
    2. Выполните шаги 1.2 для 1.2.6 как традиционный метод для получения синхронизированы L1 животных. Семян 15 – 20 L1 животных в каждой хорошо с помощью 6-хорошо регулируемые интервалы пипетки и реагента водохранилище, аналогичны 1.2.7. Периодически перемешивают L1, решение не допустить расселения животных.
  4. Предотвращение производства потомства с добавлением 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUdR)
    1. Выполните шаг 1.3.1.  Подготовить стерильные 50 x FUdR запасов (см. шаг 1.3.1.1).
    2. Когда животные досягаемости L4, 25 мкл 50 x FUDR в каждую лунку 24-ну пластины с помощью пипетки регулируемый интервал 6-канальный.
  5. Оценка жизнеспособности
    1. Удалите один из набора репликации пластин и наводнения скважин с M9 решения, запись всего животных в колодец и затем нежно коснуться-перемещение животных на голове с забрать червя (рис. 2B). Животные, не двигаться забил как мертвые. Выбросите забил пластины. Запись жизнеспособность ежедневно.
      Примечание: Животные, которые разрыв, Показать брутто морфологических дефектов, удалось разработать, или пополз вверх на стороне хорошо должны подвергаться цензуре, исключая их из мертвых и общего значения.
      1. Запишите количество животных, которые подвергаются цензуре в пределах каждой скважины в каждый момент времени отдельно от других значений.
      2. Не забиваешь скважин, которые не имеют продовольствия или загрязнены (например гриб или слизь); такие скважины считаются цензуре. Кроме того цензор хорошо, если отображение всех животных морфологические или развития дефектов. Запишите событие цензуры для этой интерференции клон/хорошо в этот момент времени.
      3. После забив реплицировать пластины, отменить его. Продолжить озвучивание новых репликации набора каждый день до тех пор, пока все животные во всех скважин мертвы. Для снижения риска скоринга предвзятости, экспериментатор должен оставаться слепым в экспериментальных условиях и аналогичным образом не должна ссылаться на результаты от предыдущих точек времени во время озвучивания.
      4. Если все животные в рамках хорошо были мертвым в данный момент, а затем забив в тот день, рассмотреть ли все животные были забил как мертвый для двух раз подряд точек для данной скважины. Если это так, забив жизнеспособность больше не требуется для этого хорошо в последующее время точек.
      5. Проведение испытаний дополнительный независимый эксперимент. Отслеживать результаты последовательных испытаний отдельно от тех, которые в предыдущих исследованиях, с номером суда отметил.

3. граф данных

Примечание: С набора реплик применяется метод кривой подходят для Приблизительная средняя и максимальная продолжительность жизни. Параметры для оценки смертности C. elegans подходят логит кривой19.  Поскольку большинство средств выживания не поддерживают логит кривой, Новая программа была разработана для построения кривых логит (для набора реплик); Также поддерживаются Каплана-Мейера кривых (для традиционного метода).

  1. Начать работу с программным обеспечением. Скачайте zip-файл релиз для текущей версии (см. Раздел материалы). Распакуйте zip-файл в папку. Просмотреть файл «readme» в выведенном папки для дополнительных инструкций по установке.
  1. Начало построения интерфейса. Найти местоположение каталога «код» в папке извлечения из zip-файла (например  «/ Пользователи/имя пользователя /Desktop/WormLife/код»).
    1. Введите следующие команды в консоли R, подставляя для только что определили путь к папке. Нажмите клавишу ВВОД или вернуться после каждой строки: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
    2. Дать время для интерфейса для загрузки в новом окне, принося вверх экрана по умолчанию, как показано на рисунке 3A. Пусть R в фоновом режиме.
  2. Данные в формате с разделителями-запятыми (CSV) или табуляцией (TSV) файлов. Укажите имена, зависит от типа анализа и столбцы. Просмотреть дополнительные файл 4 (набора реплик) и дополнительных файлов 5 (традиционные/Каплана-Мейера) отформатированные пример данных.
    Примечание: данных должен быть указан в формате «длинный», то есть по одной строке на штамм/лечение за время очко за судебного разбирательства. CSV-файлы, рекомендуется для лучшей совместимости между платформами.
    1. Удалите строки, соответствующие замечания, которые были пропущены или цензуре. Проверьте отсутствие отсутствующие или нечисловые значения, как это может привести к ошибке при импорте данных.
    2. Для традиционного анализа стиля Каплана-Мейера, не объединить данные из независимых испытаний сюжет их отдельно. Для анализа набора реплик, объединять данные из нескольких испытаний, а затем исследовать, используя функцию «TrialView» (см. 6.3.3.4).
  3. С помощью построения интерфейса
    1. Загрузить файл данных («импорт» в меню «Файл») с помощью диалогового окна. Чтобы открыть файлы «CSV», измените тип файла в раскрывающемся «.csv» (по умолчанию — «.txt/.tsv»), перейдите к папке с файлом данных. Вот файл данных примера набора реплик (дополнительный файл 4).
      Примечание: Импорт файла, когда набор данных уже открыт заменит текущий набор данных.
    2. Выберите файл для импорта для запуска мастера импорта, который ходит через определение столбцов выбранного файла (Рисунок S1A для набора реплик). Если входных данных соответствует набора реплик эксперимент, выберите «Логистическая регрессия» для изучения типа.
      Примечание: Процесс импорта отличается от набора реплик (S1 рисунокA) и традиционные (Каплана-Мейера) (S1 рисунокB).
    3. «Диаграмма». Выберите «Добавить строку» приступить к печати данных. (Линия соответствует одному набору условий. Есть функции, чтобы помочь с эксперименты где были испытаны много условий).
      1. Участок контроля условий-в случае примера данных N2 (WT) с L4440 (пустой вектор) RNAi являются подходящими. Выберите «Добавить строку» в меню «Графики» для запуска мастера добавления линии: выберите условие сюжет и графические параметры для представления строки.
        1. Чтобы вручную добавить кривую для различных условий, повторите шаги в 3.3.3.1
        2. Чтобы изменить цвет или участок символ для линии, выберите «Изменить линию» меню «граф».
        3. Чтобы удалить линию без очистки всех строк, выберите «Удалить строку» в меню «граф».
        4. Чтобы удалить все строки в текущем сюжет, выберите «Очистить линию» меню «граф».
        5. Для переопределения автоматически выбирается максимальная (время) по оси x, используйте «Набор X шкала» меню «граф».
          Примечание: по оси y (сохранившихся фракция) всегда отображается 100% (вверху) до 0% (внизу) с шагом в 20%. Оси x всегда отображается с шагом 5. Метки оси, не выводятся для обеспечения гибкости в маркировке после сохранения участок изображения.
      2. Для сохранения изображений JPEG-формат отображаемой участка, используйте параметр «Сохранить участок» в меню «файл»; сохраняется только текущий график.
      3. Для создания отдельных участков для многих различных условий в одном эксперименте, программное обеспечение позволяет определение и построение «серии».
        Примечание: Реализация концепции серии повышает эффективность при работе с большими экспериментов.
        1. Если начиная с пустой участок рабочей области, добавьте линии, соответствующие управления условий, которые должны быть согласованы во всех участков в серии (см. 3.3.3.1).
        2. Определите серии с «Определить серии» в меню «графики». Выберите условие соответствует линии для отображения впервые в серии; может быть выбран только один. Выбираете графические параметры (линия цвет и сюжет символ) на линии, как показано 3.3.3.1.
        3. Обзор участков для различных тестовых условий. Переключение отображения «серии линии» между условий с помощью кнопок влево/вправо стрелки по бокам окна основной сюжет, а также в верхнем меню (Рисунок 3А-C).
          Примечание: Если выбранный серии линии то же состояние, как один из ранее добавленный элемент управления/опорных линий, Новая линия может появиться накладными.
        4. Определите серию сделать некоторые другие функции, доступные (сохранить серии участков и Trialview ЮВЕ 3.3.3.4 для последнего). После определения серии, используйте параметр «Сохранить серии участки» из меню «Файл» для сохранения файлов изображений отдельных участка для каждого участка в серии в новой папке.
      4. Trialview — визуализация результаты независимых испытаний набора реплик эксперимента. Если для одной или нескольких групп образца были запущены несколько испытаний, участок данные из отдельных исследований и объединения данных из всех испытаний отдельно для оценки согласованности между независимых испытаний (см. Рисунок 3D).
        1. Создана серия, как описано в 3.3.3.3. Различные испытания будут отображаться для каждой группы «различных» образца в другое изображение за соответствующие испытания для указанной ссылки/контрольных образцов.
        2. Чтобы сохранить изображения TrialView, перейдите к «Печать TrialViews» в меню "данные"; изображение JPEG, которое будет выводиться для каждого участка в серии.
          Примечание: Пример результатов в рисунке 3D является для случая с два испытания.
    4. Средний срок службы Сводная таблица для набора реплик данных. Визуально осмотрите кривых для обеспечения разумного соответствия данных, а затем выберите Сводная таблица »» параметр в меню данные, чтобы сохранить таблицу значений (время на 50% выживания на кривой логит) средний срок для каждого образца типа.
  4. Статистический анализ данных, полученных через метод набора реплик
    1. Для статистического анализа между двумя группами из набора реплик эксперимент, изменения и выполнить сценарий R, в zip-файл выпуска (см «WormLife статистического анализа шаблон сценария. «««Р»).
      Примечание: Знание R не требуется для запуска сценария. Дополнительная документация находится в комментариях в файле. Скрипт готов для анализа примера данных набора реплик. Пользователя генерируемые данные в соответствующем формате (см. дополнительные 4 файла) может также быть проанализированы.
      1. Откройте файл сценария в R (R GUI или RStudio).
        Примечание: Это будет отображать сценарий без его запуска.
      2. Измените расположение необходимых файлов соответствует папке на вашем компьютере.
        Примечание: Эти пути файлов должно быть «полным» (то есть должен включать полный файл местоположения, включая папки).
        1. Измените пути (расположения файлов/папок) для «wlDir» (местоположение каталога), «dataFile» (набора реплик файл данных для анализа), «compFile» (спецификация сопоставления для запуска, если применимо) и «outputPath» (местоположение, где будут записаны файлы результатов ««««к).
      3. Задайте имена столбцов в разделе «Укажите столбцы в файле данных», если имена столбцов в файле для проведения анализа отличаются от пример файла. Укажите столбец для каждого параметра. Если исследование имеет несколько штаммов, но не интерференции (или других) включать столбец в файле данных с пустых записей или же для всех строк (например «no_treatment» и др.).
      4. Установите значение параметра «compFile». Если параметр «compFile» присвоено NA, будут выполняться все возможные попарного сравнения групп.
        Примечание: Группа определяется сочетанием штамм/генотип и лечения, которые объединяются и отображаются как «strain_treatment». Для более крупных исследований со многими группами могут быть предоставлены в CSV-файл, указав сравнений. Смотрите пример файл «comps_rsm_example.csv».
      5. Задать число итераций для Монте-Карло передискретизации («k.resamp», значение по умолчанию — 1000).
        Примечание: P-значения 0 могут быть возвращены при выполнении слишком несколько итераций; в таких случаях уместно сообщить «p < 0.01» (если k.resamp = 100), или «p < 0,001"(если k.resamp = 1000), и т.д.
      6. Запустите сценарий: кнопку «Источник» в RStudio (в правом верхнем углу окна редактирования) или «исходный документ» в меню «Правка» в R GUI. (Выполнение может занять некоторое время).
      7. Когда индикатор R «занят» больше не отображается, откройте выходной каталог там будет таблицу с результатами каждого сравнения (медиана выживаемости, p значения, % средний срок изменения).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В развитии любой новой методологии важно, что новый метод резюмирует принятые результаты предыдущих подходов и соответствует стандарту в поле. Мы ранее показали эпирически что набора реплик и традиционные методы для assaying C. elegans жизни производят аналогичные результаты20. Одичал тип C. elegans (N2) поддерживается при 20 ° C, обычно живут между 20 и 25 дней, которые мы наблюдали с традиционными (рис. 4A, чёрная л...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Набор методы традиционной и реплики требуется синхронизация хронологическом возрасте животных. Мы включить метод, который синхронизирует животных с использованием гипохлорита лечения взрослых, беременных, где только оплодотворенные яйца с беременных взрослого выжить лечения. Эти эмбрионы люк в жидкой суспензии и развивающих арест на первом личиночной стадии (L1). После посева L1 животных на продукты (например E. coli выражая двуцепочечной ДНК ген интереса), животные возобновление развития. Синхронизация...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование для этой работы, описанные в этой рукописи была предоставлена: Университет Рочестер Канцелярии Прево и школа медицины и стоматологии деканат через медицинских наук центр вычислительной инноваций (HSCCI); Эллисон медицинский фонд новых ученых в старения стипендий (АГ-NS-0681-10) спонсоров было никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
IPTG (изопропилбета-D-1-тигалактопиранозид)Gold Bio12481C100
FuDR (5-фтор-2'-дезоксиуридин)Alfa AesarL16497
24 луночные планшеты для культивированияGreiner Bio-One#662102
Retangular необработанный однолуночный планшет, 128x86 ммThermo-Fisher242811
600 &; L 96-луночные пластиныGreiner Bio-One#786261
2mL 96-луночные пластиныGreiner Bio-One#780286
Воздухопроницаемая пластина уплотнительVWR60941-086
96-контактная пластина репликаторNunc250520
бакто-пептонVWR90000-368
бактериологический агарAffymetrix/USB10906
Библиотека клонов РНК-интерференции C. elegans в бактериях HT115 - AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)См. также Kamath et al., Nature 2003.
Библиотека клонов РНК-интерференции C. elegans в бактериях HT115 - VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)См. также Rual et al., Genome Research 2004. Эту библиотеку также можно получить в Дхармаконе.
WormLife - программное обеспечение для анализа выживаемости набора репликSamuelson LabN/Ahttps://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Пустой вектор плазмидыAddgene1654https://www.addgene.org/1654/
Wormbasehttp://www.wormbase.org/ 
OASIShttps://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Графпад Призмаhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854(1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103 (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278(2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964(2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Replica Set MethodC elegans LifespanHigh throughput ScreeningFeeding based RNAiSurvival Curve AnalysisMulti well Plate AssayFUdR TreatmentL1 Animal SeedingPlate ReplicatorData Analysis Software

Похожие статьи