Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57832

⸱

2 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

В этой статье

Краткое содержание

Очистки ионных каналов часто является сложной, но как только достигнуто, он потенциально может позволить в vitro исследования функций и структуры каналов. Здесь мы описываем ступенчатой процедуры для выражения и очистки белков млекопитающих bestrophin, семейство Ca2 +-активированный Cl– каналы.

Аннотация

Человеческий геном кодирует четыре bestrophin паралоги, а именно: BEST1, BEST2, BEST3 и BEST4. BEST1, кодируемых геном BEST1 , является Ca2 +-активированный Cl– канал (CaCC) преимущественно выражена в пигментный эпителий сетчатки (ПЭС). Физиологические и патологические значение BEST1 выделяется тот факт, что более 200 различных мутаций в гене BEST1 были генетически связаны с спектр по меньшей мере пять сетчатки дегенеративных расстройств, таких как лучший Вителлиформная макулярная дистрофия (лучший болезнь). Таким образом понимание биофизики bestrophin каналов на уровне одного молекула имеет огромное значение. Однако получение очищенной млекопитающих ионные каналы часто является сложной задачей. Здесь мы приводим протокол для выражения млекопитающих bestrophin белков с системой передачи BacMam бакуловирусы генов и их очищение сродства и размер-гель-проникающей хроматографии. Очищенные протеины имеют потенциал, чтобы быть использованы в последующих функционального и структурного анализа, например электрофизиологических запись в липидных бислоев и кристаллография. Важно отметить, что этот трубопровод может быть адаптирована для изучения функций и структур других ионных каналов.

Введение

Bestrophins — семейство ионных каналов сохраняется через видов, изменяясь от бактерий до человека1. В организме человека ген BEST1 , расположенный на хромосоме 11q12.3, кодирует мембранный белок Bestrophin-1 (BEST1), которая выражается главным образом в базолатеральной мембраны клеток сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) глаза2,3 ,4. Состоит из 585 аминокислот, первый ~ 350 из которых сохраняются высоко среди видов и содержат трансмембранного регионе, BEST1 действует как CaCC людей1,5,6. Кроме того гомолог BEST1 в кур и Klebsiella pneumoniae функционировать в качестве homopentamers7,8, предлагая высокий уровень сохранения всей эволюции.

В организме человека свыше 200 мутаций в гене BEST1 были клинически связаны к группе заболеваний дегенерация сетчатки, под названием bestrophinopathies1,9. Были зарегистрированы пять конкретных bestrophinopathies, включая лучший болезни взрослого начала Вителлиформная дистрофия, аутосомно-доминирующим vitreoretinochoroidopathy, аутосомно-рецессивный bestrophinopathy и пигментный ретинит3,4 ,10,11,12,,1314. Эти заболевания, которые приводят к снижению зрения и даже слепоты, в настоящее время неизлечимыми. Для того, чтобы разработать терапевтические процедуры и потенциально персонализированной медицины, важно, чтобы понять, как эти болезнетворные мутации BEST1 влияние на функции и структура BEST1 канал15. Для этих целей исследователи должны получить очищенный bestrophin (дикого типа и мутантов) каналов и поведения в экстракорпорального анализы5,8.

Первым ключевым шагом является выражением bestrophin каналов из высших видов в mammalian клетках. Трансдукция бакуловирусы клеток HEK293-F (BacMam система) является мощным методом выразить участием мембранных белков16,17, этот протокол использует оптимизированные BacMam вектор (pEG BacMam) для надежной выражение целевых белков18, который в данном случае является млекопитающих bestrophin гомолога. Этот вектор был использован для выражения различных мембранных белков, в том числе G-белок-рецепторы, ядерные рецепторы и другие каналы иона18. Есть также доказательства того, что произведенные белки подходят для кристаллографии18. С высоким уровнем экспрессии в HEK293-F клеток белков могут затем быть очищены с помощью хроматографии; в частности в случае bestrophins, можно использовать как сходства, так и размер-гель-проникающей хроматографии.

После того, как этот протокол доработаны для канала bestrophin, очищенный протеин после этого могут быть проанализированы для его функции и структуры через плоские липидного бислоя и рентгеноструктурного анализа, соответственно5,8. Вообще эти методы предоставляют мощный трубопровода для функциональных и структурных исследований bestrophins и других ионных каналов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. производство BacMam выражение Baculoviruses

  1. Вставьте кодирующая последовательность желаемого млекопитающих bestrophin белка в колышек, BacMam векторные18 с последовательностью признание протеазы вируса Etch табака (TEV), следуют GFP-10 x его тег в C-terminus белка.
  2. Временно transfect плазмиды выражение в клей HEK293 клетки19,20,21,22,23. Проверьте в выражении гена GFP-синтез белка под микроскопом люминесцентные с 10 X или 20 X увеличение, источник возбуждения 488 нм и фильтр выбросов 510 Нм (рис. 1A).
    Примечание: На полимерной основе transfection обычно выполняется с 1 мкг плазмидной ДНК для 35 мм блюдо HEK293 клеток.
  3. Производят baculoviruses в Sf9 клетках насекомых, как описано в16,17.
    Примечание: Проход 3 (P3) вирус, который будет использоваться для заразить клетки HEK293-F для производства белка, может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц.
  4. Определите титр (инфекционные единиц) P3 вируса, доска формирования пробирного16,17.
    Примечание: Как протеин интереса отмеченных GFP, быстрый метод для проверки инфекционных единиц является заразить клетки Sf9 с серийных разведений вируса и подсчитать количество люминесцентные клеток после 48 ч.

2. белков

  1. Сохранить HEK293-F клетки в культуре подвеска с HEK293-F выражение средний в увлажненные инкубатора 37 ° C с 8% CO2. Используйте одноразовые культуры колбы, которые 2 - 2,5 раза больше, чем объем культуры и вращать культуры на орбитальной платформы на 135 об/мин.
    Примечание: Рекомендуется, чтобы заразить клетки, когда они находятся между 5 и 30 ходов и выполнять эти действия под капотом культуры клеток.
  2. 24 ч до вирусной инфекции, добавить 15 мкл Трипановый синий 15 мкл Алиготе культуры клеток и проверьте плотность клеток и жизнеспособности, используя Горяева под микроскопом. Разбавить клетки 0,6 х 106 клеток/мл в 2 x 2 Л флаконы, каждый, с 500 мл среды предварительно нагревают при 37 ° C.
    Примечание: Мертвые клетки являются запятнана синий Трипановый синий. Жизнеспособность нужной ячейки > 95%.
  3. В день инфекции проверьте плотность клеток и жизнеспособности (шаг 2.2).
    Примечание: Высокая ячейка жизнеспособность > 95% имеет важное значение для эффективного выражения инфекции и белка. Плотность ожидаемый клеток является ~1.0 x 106 клеток/мл (выросли на ночь от 2 x 500 мл 0,6 x 106 клеток/мл клеточной культуры). Предполагаемое общее количество клеток является ~1.0 x 109.
  4. Добавьте P3 baculoviruses клетки на разносторонности инфекции (МВД) 5. Чтобы определить количество вируса для прививок, используйте следующее уравнение:
    figure-protocol-1
  5. Встряхните клетки на орбитальной платформы на 135 rpm в увлажненные 37 ° C инкубатор с 8% CO2 на 24 часа.
  6. Добавить 10 мм натрия бутират в культуре клеток и продолжить инкубации в течение 48 часов.
    Примечание: Для некоторых белков, снижение температуры культуры клеток до 30 ° C после натрия бутират сложения может улучшить выражение и стабильности.
  7. Под микроскопом флуоресценции с 10 X или 20 X увеличение, источник возбуждения 488 нм и 510 нм фильтра выбросов проверьте процент и яркость зеленых клеток, которые непосредственно представляют урожайность белка (bestrophin-GFP-10xHis), (Рисунок 1B).
    Примечание: Доля Зеленые ячейки вычисляется путем: 100 x (зеленые клетки/всего клетки). Хороший белок выражение уровень обозначается сильные зеленые флуоресценции под микроскопом.
  8. Урожай клетки центрифугированием при 1000 x g в 4 ° C в течение 20 мин удалить супернатант и вновь приостановить клетки окатышей с фосфат амортизированное saline (PBS) для окончательного объема ~ 80 мл. Сплит суспензию клеток в 2 x 50 мл конические трубы и центрифуги на 1000 x g в 4 ° C на 20 мин хранить клетки окатышей на-80 ° C.

3. Очищение протеина

  1. Инкубируйте конические пробирки, содержащие ячейки гранулы перемешивания водяной бане при комнатной температуре за 10-15 мин, таким образом, чтобы они оттепель. Вновь приостановить клетки в 2 x (w/v) объем буфера (Таблица 1) (например, 10 г гранул клеток в 20 мл буфера) дополняют ингибиторы протеиназы (апротинин, Leupeptin, А Pepstatin и phenylmethylsulfonyl фтор) 0,1-1,0 мм. Накапайте вверх и вниз широко для получения однородных клеток подвеска.
  2. Лизируйте клетки с помощью высокого давления гомогенизатора. Запустить суспензию клеток через гомогенизатор на 7-10 МПа для в общей сложности 3 - 4 раза для достижения полной гомогенизации. Держите lysate клетки на льду на 2-3 минут между раундами.
  3. Добавьте моющее средство [например, 2% w/v соль класс н додецил β-D-Maltopyranoside (DDM)] lysate клетки. Проинкубируйте с агитации за 1 час при 20 ° C для извлечения мембранных белков.
    Примечание: Тип моющего средства необходимо быть оптимизированы для каждого целевого белка18,24.
  4. Центрифуга на 150 000 x g в ультрацентрифуга на 4 ° C на 1 час.
    Примечание: Все следующие шаги выполняются при 4 ° C.
  5. Собирайте Светлоклеточная lysate и потока через 5 мл его ловушку Ni2 +- НТА сродство столбец предварительно достижение равновесного уровня с буфером (Таблица 1).
    Примечание: После центрифугирования, Светлоклеточная lysate будет зажата между Пелле внизу и облачный слой сверху. Использование пипетки передачи 10 мл тщательно собирать ясно lysate и затем переключиться на 1 мл накапайте за последние несколько миллилитров lysate. Избегайте Пелле, который может засорить Ni2 + колонка; Однако небольшое количество верхнего слоя тонкой или могут быть отфильтрованы с 1,5 мкм фильтром.
  6. Промойте колонку с 25 мл буфера B и затем 40 мл буфера C (таблицы 2 и 3, соответственно).
    Примечание: Это хорошее место, чтобы отдохнуть, как общая очистка может занять до 12 часов и белка может оставаться стабильным, в то время как вложенного к столбцу на ночь.
  7. Прикрепите столбца к системе жидкостной хроматографии (ПСОК) быстро белка и элюировать с фракционирование белков из столбца с 13 мл буфера D (Таблица 3). Сбор фракций белка обогащенного согласно индикация поглощения УФ.
    Примечание: ПСОК условия заключаются в следующем: 1,0 мл размер фракции, сигнал давления до столбца равным 0,3 МПа и скорость потока 0,5 мл/мин.
  8. Измерьте концентрацию продукт eluted белка на microvolume спектрофотометром. Читайте поглощения в 280 Нм.
  9. (Необязательно) Чтобы удалить тег GFP-10xHis, добавьте ТэВ протеазы в соотношении 1:1 массовых и Инкубируйте на 4 ° C на 30 мин.
    Примечание: Тег может или не может повлиять на функции или структуре очищенный канала. Рассчитайте сумму ТэВ от объема и концентрации собранных белка от шагов 3.7-3.8. Например если 10 мл продукта элюции собираются и измеряется в 0,1 мг/мл, общий белок масса 10 x 0,1 = 1 мг и 1 мг ТэВ будет использоваться для пищеварения.
  10. Концентрат белка с 15 мл центробежные (50 или 100 кДа) фильтр на спиннинг на 4000 x g в 4 ° C до окончательный объем 400-500 мкл (для загрузки образца петли 2 мл на ПСОК).
    Примечание: Время центрифугирования для концентрации варьируется в зависимости от концентрации и размер протеина. Во избежание чрезмерной концентрации, которые могут вызвать осадков белок, спина за 10 мин на первый взгляд, а затем наблюдать за оставшийся объем и оценить время для последующих спина (например, 2-5 мин), и так далее, чтобы получить окончательный объем. Накапайте между спинами разойтись белка, который вытянуло в нижней части фильтра.
  11. Передача концентрированных белков новый 1,5 мл трубки и удалить любой преципитат или пузырьки из концентрированного продукта. Спина в > g 12000 x 5-10 мин при 4 ° C и собирать супернатант в новой 1,5 мл трубки.
  12. Загрузите конечный продукт с 1 мл шприц и круглым кончиком иглы на ПСОК систему для размер-гель-проникающей хроматографии со столбцом размер исключения, предварительно достижение равновесного уровня с буфером E (Таблица 5).
    Примечание: ПСОК условия заключаются в следующем: размер фракции 0,5 мл, предварительно столбец давлению, равным 2,50 МПа, объем потока, равным 30 мл буфера E (Таблица 5), и скорость потока, равным 0,5 мл/мин.
  13. Обратите внимание, что хорошо себя белки бежать как один пик (рисунок 2A) и собирать белка fraction(s), соответствующий этому пик (рисунок 2A).
  14. Концентрат белка с 4 мл или 0,5 мл центробежного фильтра единица (же молекулярной массой отсечения как шаг 3.10) и спина на 4000 x g при 4 ° C до конечной концентрации 5-10 мкг/мкл. Используйте спектрофотометра для проверки конечного продукта концентрация (шаг 3,8).
    Примечание: Время центрифугирования варьируется, как объем конечного продукта могут отличаться между процессами очистки. Обычно центрифугирование занимает 10-20 мин. Рекомендуется для пипетки между спинами разойтись белка, который вытянуло в нижней части фильтра.
  15. Передать новые трубки 1,5 мл концентрированных белков. Удалите любой преципитат центрифугированием в > g 12000 x 5-10 мин при 4 ° C. Супернатант передать новой 1,5 мл трубки. Сделать 10 мкл аликвоты для хранения при температуре-80 ° C и сохранить один 2-5 мкл малых Алиготе для запуска на градиент гель SDS-PAGE 4-15% на 9 V/см (рис. 2B).
  16. Подтвердите личность очищенный протеин, масс-спектрометрия8.
    Примечание: В пробирке анализ функции и структура очищенный протеин может выполняться через плоские липидного бислоя и рентгеноструктурного анализа, соответственно5,8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Интенсивность флуоресценции в клей временно transfected клеток в HEK293 (рис. 1A) является хорошим показателем для уровня выражения прогнозируемых белка в клетках подвеска HEK293-F (рис. 1B). Если целевой белок не является четко выраженной или неправильно локализуется в HEK293 клетках после переходных трансфекции, рекомендуется рассмотреть вопрос об изменении выражения конструкция (например., изменяя положение GFP-тега и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает полезным трубопровода для очистки каналов иона млекопитающих bestrophin использоваться для будущего в vitro анализов и выражения. Хотя ПСОК устройства требуется для размера-гель-проникающей хроматографии, шприцевый насос является достаточным для всех шагов аффинной хроматографии, включая привязки, мытье и элюирующие. При использовании шприцевый насос для push решения (в шприце) через колонку, важно для подложки в сторону весной, чтобы избежать толкания пузырьков воздуха в столбце. Если чи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Этот проект финансировался NIH грантов EY025290, GM127652 и Университет Рочестер начального финансирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HEPESFisher ScientificAC327265000 
NaClFisher ScientificAC446212500
глицеринFisher ScientificG33-500
имидазолFisher ScientificAC301870010
MgCl2Fisher ScientificAC197530010 
TCEPFisher ScientificAA4058704 
АпротининФишер НаучныйAAJ63039MA
ЛеупептинФишер НаучныйAAJ61188MB 
Пепстатин А, НаучныйAAJ20037MBФишера
ФенилметилсульфонилфторидНаучныйAC215740050
ДДМ,АнатрассД310С
ДДМ анаградАнатрасД310
Сф-900 II, SFM,ТермоФишер10902179
ФриСтайл МидThermoFisher12338018
NanoDrop спектрофотометрThermoFisherND-2000
Гомогенизатор высокого давленияAvestinEmulsiflex-C5
HisTrap колонкаGE17-5248-01
Superdex-200 колонкаGE28990944
AKTA PureGE29018224
Ultra-15 центробежные фильтрующие установкиMilliporeUFC910024
Ultra-4 центробежные фильтрующие установкиMilliporeUFC810024
Ultra-0,5 центробежные фильтрующие установкиMilliporeUFC505024
Optima XE-90 УльтрацентрифугаBeckman CoulterA94471
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004
Сборный гельBio-RAD4561084
T100 ТермоамплификаторBio-Rad1861096
PolyJet реагент для трансфекцииSignaGenSL100688
pEG BacMam Векторполучен из лаборатории Гуо в Институте Воллума
, , , , ,

Ссылки

  1. Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
  2. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  3. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
  4. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
  5. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
  6. Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
  7. Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
  8. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
  9. Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
  10. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
  11. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
  12. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
  13. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
  14. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
  15. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
  16. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  17. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  18. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  19. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540(2013).
  20. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
  21. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079(2012).
  22. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
  23. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  24. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  25. Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
  26. Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Экспрессия белков млекопитающихсистема бакуловируса BacMamаффинная хроматографияэксклюзионная хроматографиякультура клеток HEK293Fультрацентрифугированиеочистка с помощью His-меткирасщепление TEV-протеазойанализ методом FPLC
Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.