В настоящем документе мы описываем протокол для характеристики Т-зависимых и T-независимой иммуноглобулина (Ig) изотипа ответы в мышах с помощью ИФА. Этот метод используется в одиночку или в сочетании с потоком цитометрии позволит исследователям для выявления различий в ответах изотипа Ig B клеточный мышей после иммунизации антигена Т-зависимых и T-независимой.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Характеристика тимус зависимых и тимус независимые иммуноглобулина изотипа ответов в мышей, используя энзим соединенный Assay иммуносорбента
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Антитела, также называют как иммуноглобулины (Ig), выделяемый продифференцировано лимфоциты, клетки plasmablasts/плазмы, гуморальный иммунитет обеспечивают грозным защиту против вторжения патогены через различные механизмы. Одна из основных целей вакцинации является заставить защитный антиген специфические антитела для предотвращения опасных для жизни инфекций. Тимус зависимые (TD) и тимус независимые (TI) антигены можно добиться надежной реакции антиген специфически IgM и может также вызвать производство коммутацией isotype антитела (IgG, IgA и IgE) а также генерации клеток памяти B с помощью предоставляемые антиген представляющих клеток (БТР). Здесь мы описываем протокол характеризовать TD и TI Ig изотипа ответы в мышей, используя энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA). В настоящем Протоколе TD и TI Ig ответы вызвал у мышей внутрибрюшинного (и.п.) иммунизации с антигенами конъюгированных Гаптены модель TNP-KLH (в квасцы) и ТНП полисахарида (в PBS), соответственно. Чтобы заставить TD памяти ответ, руля иммунизации TNP-KLH в квасцов дается на 3 недели после первой иммунизации с же антигена/адъювант. Sera мыши собирают в разное время точек до и после иммунизации. Всего в сыворотке Ig и ТНП специфические антитела являются впоследствии количественно с использованием сэндвич isotype специфических Ig и косвенные ELISA, соответственно. Чтобы правильно определить сывороточной концентрации каждого изотипа Ig, образцы необходимо надлежащим образом быть разбавлен по размеру в пределах диапазона линейной стандартных кривых. Используя этот протокол, мы последовательно получить надежные результаты с высокой специфичности и чувствительности. При использовании в комбинации с другими взаимодополняющими методами проточной цитометрии, в пробирке культуры splenic клетки B и иммуногистохимическое окрашивание (IHC), этот протокол позволит исследователям получить всеобъемлющее представление о антитела ответы в данной экспериментальной обстановке.
Введение
Лимфоциты являются основным игроком в гуморального иммунитета и единственный тип клеток млекопитающих, которые способны производить антитела, также называются иммуноглобулины (Ig)1,2. Антитела секретным клетками B обеспечивают грозным защиту против вторжения патогены через различные механизмы, включая обезвреживание, опсонизацию и активации комплемента, ведущих к защитного иммунитета3. Секреция антител клетками B достигается только после полной активации конкретных клеток B, которая обычно требует двух различных сигналов3. B клеточного рецептора (BCR) выразил на ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол соответствует руководящим принципам Комитета по этике институциональных исследований на животных по Rutgers University. Все мыши используются в соответствии с низ руководящие принципы и животных протоколом, утвержденным на институциональный уход животных и использования Комитетом.
1. Подготовка мышей и Коллекция наивного мыши Sera
- Держите всех мышей для иммунизации экспериментов в конкретного возбудителя бесплатный животных фонда.
- Использование пола согласованной, молодых взрослых (8-12 недель) нокаут и помёте контроль мышей, которые разделяют те же родители и клетки для иммунизации исследований.
- ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы использовали этот протокол для расследования роли критической регулятор иммунной системы, TRAF3, TI и TD иг изотипа ответы9,10,11. TRAF3 прямо или косвенно регулирует трансдукции сигнала целого ряда врожденная и адаптивного иммунитета рецепторов, включая ФНО рецептор надсемейства, Толл подобные рецепторы и T Мобильный рецептор/CD28, среди прочих27,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем протокол для характеризации TD и TI Ig изотипа ответов в мышах с помощью ИФА. Успешное осуществление этого протокола требует использования материалов, указанных в таблице 1, включая ELISA пробирного пластины, иммунизации Ags, мыши изотипа Ig-антитела и стандартов. Следует позаботиться о том, чтобы избежать использования тканевой культуры рассматриваются пластины для ELISA. Разведениях стандартов и образцы сыворотки следует в отдельных необработанной плиты (раунд внизу) и затем добавлен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы имеют без финансовых интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано национальными институтами здравоохранения грантов R01 CA158402 (P. Xie) и R21 AI128264 (P. Xie), Министерство обороны Грант W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), пилот награду от рака института Нью-Джерси через Грант номер P30CA072720 от национального института рака (P. Xie), Буш биомедицинских Грант (P. Xie), Виктор Stollar стипендий (A. Лалани) и Анна б. и Джеймс б. Leathem стипендий (S. Zhu).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| VersaMax Настраиваемый считыватель микропланшетов | MDS Аналитические технологии | VERSAMAX | Оборудование для считывания пластин |
| SOFTmax PRO 5.3 | MDS Аналитические технологии | SOFTmax PRO 5.3 | Программное обеспечение для считывателя пластин |
| GraphPad Prism | GraphPad Программное обеспечение для построения графиков и статистики | ||
| TNP-AECM-полисахарид (FICOLL) | Biosearch Technologies | F-1300-10 | A TI Ag для иммунизации |
| TNP-KLH | Biosearch Technologies | T-5060-5 | A TD Ag для иммунизации |
| TNP(38)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (коэффициент конъюгации: 38) | Покрытие Ag для специфичного для TNP ИФА |
| TNP(3)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (коэффициент конъюгации: 3) | Покрытие Ag для высокоаффинных TNP-специфичных Ig |
| Imject квасцов | Fisher Scientific | PI-77161 | Адъювант квасцов для иммунизации |
| Falcon Полипропиленовые трубки | Fisher Scientific | 14-959-11A | Для инкубации инсулинового шприца TNP-KLH/квасцов |
| BD | Fisher Scientific | 14-829-1B | Для внутримышечной инъекции мышам |
| Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom | Fisher Scientific | 14-245-61 | Для ИФА |
| необработанные 96-луночные микропланшеты, круглодонные | VWR | 82050-622 | Для серийных разведений стандартов и образцов |
| Фосфатазный субстрат, 5 мг Таблетки | Sigma | S0942-200TAB | AP субстрат |
| Диэтаноламин | VWR | IC15251690 | компонент субстрата AP буфер |
| Козий антимышиный IgM | SouthernBiotech | 1020-01 | Capture Ab для мыши IgM |
| Goat антимышь IgG1 | SouthernBiotech | 1070-01 | Capture Ab для мыши IgG1 |
| Козья антимышь IgG2a | SouthernBiotech | 1080-01 | Capture Ab для мыши IgG2a |
| Козья антимышь IgG2b | SouthernBiotech | 1090-01 | Capture Ab для мыши IgG2b |
| козья антимышь IgG3 | SouthernBiotech | 1100-01 | Capture Ab для мыши мышь IgG3 |
| Козий антимышиный IgA | SouthernBiotech | 1040-01 | Capture Ab для мыши IgA |
| козий антимышиный IgE | SouthernBiotech | 1110-01 | Capture Ab для мыши IgE |
| AP-Goat антимышиный IgM | SouthernBiotech | 1020-04 | Detection Ab для мыши IgM |
| AP-Goat антимышиный IgG1 | SouthernBiotech | 1070-04 | Detection Ab для мыши IgG1 |
| AP-Goat антимышиный IgG2a | SouthernBiotech | 1080-04 | Detection Ab для мыши IgG2a |
| AP-Goat антимышиный IgG2b | SouthernBiotech | 1090-04 | Detection Ab для мыши IgG2b |
| AP-козий антимышиный IgG3 | SouthernBiotech | 1100-04 | Detection Ab для мыши IgG3 |
| AP-Goat антимышиный IgA | SouthernBiotech | 1040-04 | Detection Ab для мыши IgA |
| AP-Goat антимышиный IgE | SouthernBiotech | 1110-04 | Detection Ab для мыши IgE |
| Мышиный IgM стандартный | BD Biosciences | 553472 | TNP-специфичный IgM, клон G155-228 |
| Мышиный IgG1 стандартный | BD Biosciences | 554054 | TNP-специфичный IgG1, клон 107.3 |
| Мышиный IgG2a стандартный | BD Biosciences | 556651 | TNP-специфичный IgG2a, клон G155-178 |
| Мышиный IgG2b стандартный | BD Biosciences | 554055 | TNP-специфичный IgG2b, клон 49.2 |
| Мышиный IgG3 стандартный | BD Biosciences | 553486 | KLH-специфичный IgG3, клон A112-3 |
| Мышиный IgA стандартный | BD Biosciences | 550924 | IgA, индуцированный минеральным маслом, клон MOPC-320 |
| Мышиный IgE стандарт | BD Biosciences | 557079 | TNP-специфичный IgE, клон С38-2 |
Ссылки
- Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
- Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
- Murphy, K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
