Характеристика тимус зависимых и тимус независимые иммуноглобулина изотипа ответов в мышей, используя энзим соединенный Assay иммуносорбента

Лимфоциты являются основным игроком в гуморального иммунитета и единственный тип клеток млекопитающих, которые способны производить антитела, также называются иммуноглобулины (Ig)^1,2. Антитела секретным клетками B обеспечивают грозным защиту против вторжения патогены через различные механизмы, включая обезвреживание, опсонизацию и активации комплемента, ведущих к защитного иммунитета³. Секреция антител клетками B достигается только после полной активации конкретных клеток B, которая обычно требует двух различных сигналов³. B клеточного рецептора (BCR) выразил на поверхности клеток конкретных наивный B³путем прямого связывания антигена (Ag) передается сигнал 1. В зависимости от источника сигнала 2 клетки B активации можно разделить на тимус зависимые (ТД) или тимус независимые (TI)^3,4. В ответ антигена TD 2 сигнала обеспечивается активированные родственных CD4 T вспомогательный (T_H) клетки, которые Экспресс CD154, лигандом CD40 выразил на B клетки^1,2,3co-stimulatory рецептор. В ответ TI антигена, сигнал 2 приходит от либо участия Толл подобные рецепторы (TLRs в случае типа 1 TI Ag) или обширные cross-linking БКРС (в случае 2 типа TI Ag) на B-клеток^3,4. Тип 1 TI (TI-1) антигены являются микробной лигандами TLRs, включая бактериальных липополисахаридов (LPS), вирусной РНК и микробных CpG ДНК^4,5. Антигены TI (TI-2) тип 2 имеют очень повторяющихся структуру и способны доставить длительное и стойких сигнализации B ячейку на несколько cross-linking БКРС^4,6. Типичными примерами TI-2 антигенов пневмококковой полисахаридов и конъюгированных Гаптены полисахарид^6,7. ТД и TI антигены можно добиться надежной реакции антиген специфически IgM и может также вызвать производство коммутацией isotype антитела (IgG, IgA и IgE) с помощью, предоставляемой антиген представляющих клеток (БТР), таких как дендритные клетки (DCs)^{1 ,2,3}. Кроме того TD и TI антигены способны вызвать памяти ответы с помощью АСУ ТП, но TD антигены являются более эффективными в склонение памяти клетки B поколение^3,8.

В этом протоколе TD и TI Ig ответы являются вызвало у мышей внутрибрюшинного (и.п.) иммунизации с конъюгированных Гаптены модель антигены 2,4,6-trinitrophenyl-замочной скважины магнитные Гемоцианин (ТНП-KLH) и ТНП полисахарида (нейтральный, сильно ветвистый и высокой масса), соответственно^9,10,11. ТД антигены обычно используются с адъювантом для расширения производства антител¹². Здесь в нашем протокол, ТНП-KLH вводят квасцов, часто используемых адъювант в иммунизации исследования¹². Другие примеры адъювантов, которые могут быть использованы в полной или неполной адъювантной Фройнд 's (CFA или IFA), A монофосфатный липидов / Трегалоза dicorynomycolate («РМБИ» адъювантной) и CpG oligodeoxynucleotides,^, и т.д.^{13 14}. после иммунизации, сера мыши собирают в разное время точек и ТНП специфических антител в сыворотке количественно с помощью Ig изотипа специфичные иммуноферментного анализа (ИФА)^{9,10, 11}.

ELISA является на основе плиты assay, который широко используется в качестве инструмента диагностики в медицине, а также аналитический инструмент в биомедицинских исследований^,1516. Он используется для обнаружения и количественного определения аналитов включая антитела, гормоны, цитокины, chemokines и различные антигены и т.д. ELISA может выполняться в нескольких различных форматах, в том числе прямые, косвенные, сэндвич и конкурентоспособной ELISA^15,16. В общем он включает иммобилизации антигена к твердой поверхности, обычно микротитровальных 96-луночных пластины, которые инкубировали с основного антитела. После инкубации несвязанные антитела смыты. В прямой ELISA, основное антитело непосредственно конъюгированных для фермента (обычно пероксидаза или щелочной фосфатазы), которые могут расщеплять Хромогенный субстрат приносить видимый цвет изменения, такие как определяется документом обнаружения сигнала Спектрофотометр^15,16. Напротив если энзим соединенный вторичные антитела используется для связывания основное антитело, то это рассматривается как косвенные ELISA^15,16. Прямые ELISA является быстрее, тогда как косвенные ELISA является более чувствительным^15,16. В сэндвич ELISA пластины покрыты «захват» антитела используются для иммобилизации антигена интереса в образцах, а затем захватили антиген может быть обнаружен еще один «обнаружения» антител в прямой или косвенной форме^{15, 16}. сэндвич ELISA предлагает высокую специфичность, так как обнаружено два различных антител антигена антиген. В конкурентных ELISA конкурс устанавливается между образца антигена и плита прыгните антигена для привязки к основное антитело, а затем концентрации антигена в образце количественно измеряя снижение сигнала от субстрата ^{15 , 16}. конкурентные ELISA может производиться с использованием упомянутых выше прямого или косвенного формат и полезен для обнаружения небольших антигены с только один epitope^15,16.

Альтернативные методы для измерения антитела включают в себя радио-иммуноферментного анализа (RIA), electrochemiluminescence (ЭСЛ) пробирного и поверхности плазмон резонанса (СРП) пробирного¹⁷. РИА был первый иммуноанализа разработали что меры присутствие антигена (или антитела) с высокой специфичности и чувствительности с использованием radiolabeled реагенты^18,19. Однако из-за проблем радиоактивных токсичности, затраты на утилизацию, срок годности и специальных лицензий для работы с радиоактивными материалами, ELISA лучше и более удобный метод для распространенных использует^20,21. ECL является весьма деликатным методом в котором инициируются с помощью электричества для создания высокой реакционной способностью видов из стабильных прекурсоров на поверхности электрода хемилюминесцентный реакции и может использоваться для измерения количества аналитов (таких как антигены или антитела)²². Однако ЭСЛ требует специального инструмента и таким образом не используется так широко как Элиза²³. СРП является прямым assay, который может использоваться для измерения Связывание лиганда (например., антитела) для иммобилизованных молекул (например., антигены) на сенсоре чип поверхности²⁴. СРП очень конкретно определяет взаимодействия в режиме реального времени и не требует использования маркированных реагентов как ELISA. Однако SPR также требует специального оборудования и имеет более низкую чувствительность чем ELISA¹⁷. Ввиду ограничений, обусловленных альтернативных методов, ELISA является наиболее подходящим и удобным для нашей цели в настоящем Протоколе. Здесь мы описывают использование сэндвич ELISA для анализа общего уровня изотипа Ig и процедурах косвенного ELISA для анализа антиген специфические Ig изотипов.

Этот протокол соответствует руководящим принципам Комитета по этике институциональных исследований на животных по Rutgers University. Все мыши используются в соответствии с низ руководящие принципы и животных протоколом, утвержденным на институциональный уход животных и использования Комитетом.

1. Подготовка мышей и Коллекция наивного мыши Sera

1. Держите всех мышей для иммунизации экспериментов в конкретного возбудителя бесплатный животных фонда.
2. Использование пола согласованной, молодых взрослых (8-12 недель) нокаут и помёте контроль мышей, которые разделяют те же родители и клетки для иммунизации исследований.
3. План иммунизации и расписание сбора сыворотки, как показано на рисунке 1.
4. Урожай наивно сыворотки каждой мыши на 7 дней (-7 дней) до иммунизации. Выполните процедуры ретро орбиталь кровотечение и сыворотки подготовки как описано ниже в шаге 4.

2. Подготовка TNP-полисахарида (TI антигена) и ТНП KLH (TD антиген)

1. Растворите антигена порошков в стерильных PBS (рН 7,4) тщательно, чтобы сделать 0.5 мг/мл TNP-полисахарида запасов и 1 мг/мл TNP-KLH фондовых решений. Аликвота каждый антиген складе решения в пробки microfuge стерильные на 0,5 мл и держать аликвоты на-80 ° C для длительного хранения. Избегайте несколько замораживания и оттаивания аликвоты антигена.
2. В день инъекции, рассчитать объем TNP-полисахарида (50 мкг/100 мкл/мышь) или TNP-KLH согласно количество мышей (100 мкг/100 мкл/мышь) необходимо вводить. Оттепель соответствующее количество TNP-полисахарида или TNP-KLH аликвоты при комнатной температуре (RT).
3. Для ТНП-KLH инъекций сначала разбавляют квасцов адъювантной (40 мг/мл) 3 тома из стерильных PBS до конечной концентрации 10 мг/мл. Убедитесь, что смесь адъювантной квасцов хорошо приостановлено до растворения.
4. Объединить равным объемом 10 мг/мл квасцов адъювант суспензии из шага 2.3 и талой TNP-KLH раствор (1 мг/мл) в 5 мл полипропиленовые трубы, хорошо перемешать и инкубировать при 37 ° C за 30 минут подготовить этот TNP-KLH/квасцов Смешайте свежую до инъекции.

3. Иммунизация мышей

1. Выполнение инъекции внутрибрюшинного (и.п.) TNP-полисахарида или TNP-KLH/квасцов иммунизировать мышей с 1 мл инсулиновые шприцы в кабинете биобезопасности. Вставьте иглу примерно под углом 30°, предпочтительно в нижнем правом квадранте каждой мыши, чтобы предотвратить инъекции в внутренних органов.
2. Придать и.п. 100 мкл TNP-полисахарид на мышь на день 0 для иммунизации TI Ag (рис. 1А).
3. Придать и.п. 200 мкл TNP-KLH/квасцов смеси (свежеприготовленные на шаге 2.4) на мышь на день 0 для TD Ag иммунизации. Повторите же инъекции на 21 день как руля иммунизации для исследования памяти (рис. 1Б).
4. После инъекции возвращение каждой мыши в его клетке и держать все вводили мышам в состоянии определенного возбудителя бесплатно.

4. ретро орбиталь кровотечение и подготовка сыворотки

1. Урожай мыши Сера в разное время точках: TNP-полисахарида иммунизации, собирать мыши сывороток на день -7 и 7 (рис. 1А); TNP-KLH/квасцов иммунизации Соберите мыши сывороток на день -7, 7, 14 и 28 (рис. 1Б).
2. Для ретро орбиталь кровотечение анестезировать каждой мыши с изофлюрановая 5% для 1 – 2 мин в кабинет биобезопасности²⁵. Выполняйте педали рефлекс для обеспечения адекватной анестезии каждой мыши.
3. Удерживайте кнопку мыши, осознающие в одной руке с указательным и большим пальцем, потянув кожу вокруг глазного яблока, назад, так что глазного яблока выступает из сокета²⁵. Вставка номера гепаринизированным пипетка Пастера или капиллярную трубку под углом 45 °, во внутреннем углу глазницы под глазного яблока²⁵.
4. Применять нежные понижательное давление и вращайте пипетки или трубку осторожно, чтобы ворваться в Вену и собрать 150 – 200 мкл крови в пипетку или трубки. Немедленно передать трубу отцентрифугировать стерильные 1,5 мл крови и вернуть его клетке, чтобы восстановить мыши.
5. Пусть образцы сидеть на RT для 1-2 ч до коагуляции крови.
6. Центрифугуйте образцы коагулированного крови на 13 000 x g 10 мин при 4 ° C. Передать новые трубки отцентрифугировать стерильные 1,5 мл четких сыворотка поверх сгусток крови.
7. Повторите шаг 4.6 еще один раз, чтобы удалить остаточные сгусток крови и собирать четких сыворотка.
8. Алиготе сыворотки в пробки microfuge стерильные 1,5 мл на 50 мкл/трубки и хранить сыворотки-80 ° c.
9. Альтернативные глаз кровотечения в разное время точек, таким образом, чтобы каждый глаз Блед максимум дважды в течение всего эксперимента. На терминале кровотечение Соберите до 1 мл крови от каждой мыши до эвтаназии. Усыпить мышь с 5% CO₂ следуют шейки матки дислокации.
   Примечание: Splenic клетки могут быть собраны для потока гранулярных анализы и в пробирке исследования культуры. Мы также готовим геномной ДНК от splenocytes проверить генотип каждой мыши.

5. мыши Ig изотипа специфичные ELISA

1. Подготовьте буферов и решения перед ELISA.
   1. Подготовка 500 мл муфты буфера (PBS, рН 7,4).
   2. Подготовка 500 мл промывочного раствора (PBS-T (0,05% 20 анимации), рН 7,4).
   3. Подготовка 100 мл блокирование буфера (1% BSA в PBS, рН 7,4, температуре 4 ° C).
   4. Подготовка 1 Л субстрата буфера (1 M Диэтаноламина, pH 9,8 (97 мл Диэтаноламина в 1 Л H₂O, рН, скорректированы с помощью 10 М HCl) и 0,5 мм MgCl₂). Защите субстрат буфера от света, заключив бутылки с алюминиевой фольгой. Хранить при 4 ° C.
   5. Подготовка 100 мл раствора (3 M NaOH) стоп.
2. Слой пластины ELISA:
   1. Для всего сыворотки изотипа Ig ELISA, пальто 96-луночных иммуно пластины с 10 мкг/мл isotype-конкретных захвата поликлональных коза анти мыши Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A или E) Abs в муфты буфера (PBS) на 100 мкл/хорошо.
   2. Для изотипа Ig TNP-конкретных ELISA пальто 96-луночных иммуно пластины с 10 мкг/мл ТНП₍₃₈₎- BSA в PBS на 100 мкл/хорошо.
   3. Для высоким сродством изотипа Ig TNP-конкретных ELISA пальто 96-луночных иммуно пластины с 10 мкг/мл ТНП₍₃₎- BSA в PBS на 100 мкл/хорошо²⁶. Инкубируйте пластины на 4 ° C на ночь.
3. После инкубации покрытие мыть тарелки 2 раза с 200 мкл/хорошо PBS-t. Отменить буфера мытья и пятно сухой плиты (Коснитесь каждую пластину вниз в стеке бумажных полотенец) после каждой стирки.
4. Блок пластин: добавить 200 мкл/хорошо блокирование буфера (1% BSA в PBS) в пластины с покрытием и инкубировать пластины для 1 h на RT.
5. В то время как блокирование пластины, подготовьте разведений стандартов изотипа Ig и образцов сыворотки в блокирование буфера в отдельный, неочищенные 96-луночных пластины на 150 мкл/хорошо.
   1. Подготовить стандарты изотипа Ig 250 нг/мл в качестве отправной стандартной концентрации (St01) и сделать 7 – 10 1:2 серийных разведений Ig стандартов (St02 St07 или St10, Рисунок 2A).
   2. Подготовьте мыши сыворотки пробах в разведении 1: 100 или 1: 500 фактор как начального разбавления и сделать 3 или 4 в 1:10 серийных разведений для всего изотипа Ig или 1:5 серийных разведений для изотипа Ig TNP-конкретных каждого образца сыворотки (рисA). Для МГЭ ELISA подготовить образцы сыворотки мыши на коэффициент разбавления 1:2 как начального разбавления и сделать 3 1:5 серийных разведений каждого образца сыворотки.
6. После блокирования, мыть тарелки из шага 5.4 три раза с 200 мкл/хорошо PBS-t и помарки сухой плиты после каждой стирки.
7. Передавать 100 мкл/также разреженных стандартов изотипа Ig (подходит для захвата и обнаружения Abs) и пробы разреженных сыворотки из шага 5.5 пластины, подготовленный на шаге 5.6. Инкубируйте пластины с стандарты и образцы на 4 ° C на ночь.
8. Мыть тарелки 3 раза с 200 мкл/хорошо PBS-t и помарки сухой пластины после каждой стирки.
9. В каждой пластинке, добавить 100 мкл/колодец 10 мкг/мл соответствующие щелочной фосфатазы (AP)-конъюгированных изотипа специфичные коза анти мыши Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A, или E) Abs, разбавленных в блокировки буфера.
10. Инкубировать пластины с AP-конъюгированных Abs для 1-2 ч на RT. Для обнаружения IgE Инкубируйте пластины для 1-2 ч при 37 ° C.
11. Подготовка 1 мг/мл раствора субстрата, растворяя две таблетки фосфатазы субстрата 5 мг в 10 мл буфера субстрата.
12. Вымойте каждой пластины 5 раз с 200 мкл/хорошо PBS-t и помарки сухой плиты после каждой стирки.
13. Добавьте 100 мкл/колодец раствора субстрата в каждой плиты. Разрешить реакции развиваются в РТ, которая обычно занимает всего несколько минут.
14. Прочитайте каждую пластину на 405 нм, используя Считыватель микропланшетов с соответствующего программного обеспечения.
    1. Нажмите кнопку «Параметры» для задания длины волн «Lm1» на "405 нм» и нажмите «OK».
    2. Нажмите кнопку «шаблон», чтобы назначить «пустой» колодцев, скважин «стандартов» и «неизвестный» скважин согласно 96-луночных плиты установки.
    3. Для скважин «стандарты» нажмите «серии», чтобы задать «Первый образец«как «St01», выберите «Начать с» на «верхней» и установить «воспроизводит» как «2». Проверка «Образец Descriptor» и ввода «Стандартное значение»: выберите «единицы«как «нг/мл», набор «начальная стоимость» как «250», набор «шаг» как «2». Нажмите кнопку «ОК».
    4. Нажмите кнопку «Read» читать пластины, когда наиболее сосредоточены стандартных достигает оптической плотности (OD) ~ 1.
    5. Выберите меню «файл» и нажмите кнопку «сохранить» для сохранения файла.
    6. Нажмите кнопку «Чтение» для чтения пластину снова, когда наиболее концентрированным стандартных подходов OD405 ~ 1.5, 2, 2.5, соответственно.
15. Остановите реакции, добавив 25 мкл/хорошо 3 M NaOH. Выполните шаги 5.12 до 5.15 одной пластины одновременно.
16. Анализа ELISA данных с использованием программного обеспечения, связанные с Считыватель микропланшетов:
    1. Проверьте значения OD405 стандартов изотипа Ig чтения файлов и выберите соответствующий чтения с хорошей линейный диапазон стандартов для детального анализа данных.
    2. Выберите программу установки 4-параметр Печать стандартных кривых. Проверьте co эффективный стандартной кривой (R²), которая должна быть > 0,98 для обеспечения качества данных.
    3. Проверьте ли OD405 значения каждого образца уменьшаться с увеличением разведения факторов. Извлечь концентрация всех разреженных образца скважин, нажав «Неизвестными».
    4. Выберите соответствующий хорошо каждого образца с OD405 диапазона линейной калибровочной кривой изотипа Ig для расчета концентрации.
    5. Рассчитать сыворотке концентрацию изотипа Ig каждого образца, используя формулу: Сыворотка концентрация Ig = выбранный хорошо концентрация x коэффициент разрежения.
17. Печать графиков и проводить статистический анализ с использованием соответствующего программного обеспечения по^9,10,11. Сделайте вертикальной точечной графики сыворотки уровнях изотипа Ig для сравнения Ig ответы на один и тот же момент времени. Для TD памяти ответа исследования сделайте время курс ответ кривых для изучения ответов изотипа Ig, до и после руля иммунизации. Использование погрешностей, чтобы показать стандартное отклонение (SD) каждой группы образцов. Чтобы сравнить ответы изотипа Ig между двумя генотипов мышей, используйте непарных t тест для двустороннее данных для определения статистической значимости. Установите значение < 0,05 p как существенно разные.

Мы использовали этот протокол для расследования роли критической регулятор иммунной системы, TRAF3, TI и TD иг изотипа ответы9,10,11. TRAF3 прямо или косвенно регулирует трансдукции сигнала целого ряда врожденная и адаптивного иммунитета рецепторов, включая ФНО рецептор надсемейства, Толл подобные рецепторы и T Мобильный рецептор/CD28, среди прочих27,28. Мы предполагаем, что TRAF3 играет различные роли в различных иммунных клеток подмножеств регулировать ответов антитела. Чтобы проверить эту гипотезу, мы определили TI и TD иг изотипа ответы с помощью условного TRAF3 нокаут мышей, которые имеют Traf3 ген специально удалены в лимфоцитов, Т-клетки или миелоидных клеток, соответственно9,10, 11. Представитель иммунизации и сыворотки Коллекция расписаний для исследования TI и TD иг изображены на рисунке 1. Представитель IgG1 и IgG2b ИФА результаты показаны на рисунке 2 и на рисунке 3 , чтобы проиллюстрировать, как работает ELISA. К ним относятся плита установки образцов (рисA), изображение пластины после добавления субстрата AP (рис. 2B), читать результаты OD405 и разбавленных стандартов (рис. 2C, 2D), значения стандартных растворов (Рисунок 2E, 2F), стандартные кривые (рис. 3A, 3В), значений разреженных образцов (рис. 3C, 3D) и расчет сыворотки IgG1 и IgG2b концентрации в пробах (рис. 3E, 3F). Рисунок 4 показывает представитель результаты всего Ig изотипов в сера наивно мышей. Мы показали статистически повышенной базальной сыворотке IgA, IgM, IgG2b, IgG3 и IgG2a в клетки B специфических TRAF3- / - (B-TRAF3- / -) мышах, по сравнению с пола и возраста соответствием TRAF3-достаточно помёте управления мышей (БМО). Этот hyperglobulinemia B-TRAF3- / - мышей вызвано отсеке расширенной клетки B в периферических лимфоидных органов из-за длительного выживания зрелых TRAF3- / - B клетки9. Рисунок 5 показывает представитель результаты TI и TD иг изотипа ответы мышей иммунизации с TNP-полисахаридный и ТНП-KLH, соответственно. Эти результаты показали значительно выше TI, ТНП конкретных IgG3 также повышенных ТД, ТНП конкретных IgG2b уровней и в миелоидных клеток конкретных TRAF3- / - (M-TRAF3- / -) мышах чем в LMC. Такое увеличение TI IgG3 и ТД IgG2b ответы в М-TRAF3- / - мышей, вероятно, из-за увеличения производства провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и IL-12 TRAF3- / - макрофагами и DCs, после иммунизации11. Рисунок 6 показывает представитель результаты TD первичной и ответы памяти мышей TNP-KLH иммунизации. Эти результаты показали, частично снижение первичной реакции TD IgM и дефектных IgG1 первичной и памяти ответы в Т клеток конкретных TRAF3- / - (T-TRAF3- / -) мышах. Дефектные TD первичной и ответы памяти T-TRAF3- / - мышей результата от нарушение активации TRAF3- / - CD4 Т-клеток на Т-клеточных рецепторов и CD28 совместного участия10. Вместе взятые, протокол, описанные в этой статье, позволил нам определить конкретные роли TRAF3 в различных иммунных клеток подмножества в регулировании TI и TD иг изотипа ответы у мышей.

Рисунок 1 : Типичный TI и ТД Ag иммунизации и сыворотки коллекции графики. (A) TNP-полисахарида экспериментов. (B) TNP-KLH экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Представитель IgG1 и IgG2b ELISA. (A) 96-луночных плиты установки включает скважин пустым, 7 серийных разведений (1:2) мыши IgG1 и IgG2b стандартам (St01 St07), и 4 серийных разведений (в 1:10) 8 мыши сыворотки образцы (S1 S8). Концентрация стандартов приводится также в нижней части каждого стандарта. Коэффициент разбавления пробы дается в нижней части каждого образца хорошо. (B) изображение пластины в 5 мин после добавления субстрата AP. Пластину читать результаты IgG1 (C) и IgG2b (D) в 405 нм. Значения концентраций различных разведениях мыши IgG1 (E) и мышь IgG2b и OD405 (F) стандартов. Conc, концентрации; BackCalcConc, обратно рассчитаны концентрации; ОД, оптическая плотность; AvgOD, средний ОД реплицирует; SD, стандартное отклонение; CV, коэффициент вариации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Анализ данных представитель IgG1 и Элиза IgG2b. Стандартные кривые IgG1 (A) и IgG2b (B). Co эффективный R2 -> 0,98 в обоих стандартных кривых. Стрелки указывают линейный спектр стандартных кривых. Значения OD405 и концентрации IgG1 (C) и IgG2b (D) неизвестными (образцы разреженных сыворотки). R, диапазон; Conc, концентрации. Расчёт концентрации в сыворотке крови мыши IgG1 (E) и мышь IgG2b (F) для 8 образцов. ОЙ, не обнаруживаемых это ELISA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Представитель результаты всего Ig изотипов в сыворотке мышей наивными. Sera были собраны от пола совпадают, 10-12 недель наивно LMC и B-TRAF3- / - мышей (n = 10 для каждого генотипа; генетический фон: 129xC57BL/6). Базальные сывороточные уровни общего IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA и IgE определяется ELISA. Статистическая значимость определялась с тестом непарных t двустороннее данных. *, значительно отличаются между LMC и B-TRAF3- / - мышей (p < 0,05); **, очень значительно отличаются между LMC и B-TRAF3- / - мышей (p < 0.01). Эта цифра была изменена от СЕ и др. 9. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Представитель результаты TI и TD иг изотипа ответов на ТНП полисахаридный и ТНП-KLH иммунизации, соответственно. Пола совпадают, 8-12 недель LMC и M-TRAF3- / - мышей (генетический фон: C57BL/6) были иммунизированы с 50 мкг TI Ag TNP-полисахарида (верхней панели, n = 9 для каждого генотипа) или 100 мкг TD Ag TNP-KLH смешивается с квасцов (нижней панели, n = 12 для каждого генотип). Sera были собраны на 7 день после иммунизации. Титры сыворотка анти ТНП IgM, IgG1, IgG2b, IgG3, IgA и IgE были проанализированы ELISA. Статистическая значимость была проанализирована с тестом непарных t двустороннее данных. *, значительно отличаются между LMC и M-TRAF3- / - мышей (p < 0,05). Эта цифра была изменена от Лалани и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 : Представитель результаты TD начальных и памяти Ig ответов на ТНП-KLH иммунизации. Пол совпадают, 8-10 недель LMC и T-TRAF3- / - мышей (n = 10 для каждого генотипа; генетический фон: 129xC57BL/6) прививки были сделаны с 100 мкг Ag TNP-KLH TD, смешанного с квасцов на день 0. Каждая мышь также получил руля иммунизации с же Ag и адъювантной на 21 день после первого иммунизации. Образцы сыворотки были собраны от мышей на день -7, 7, 14 и 28, соответственно. TNP-специфических IgM и IgG1 уровни в образцах сыворотки были измерены по ELISA. Графики показывают результаты 10 пар LMC и T-TRAF3- / - мышей (средний ± SD). Статистическая значимость была проанализирована с тестом непарных t двустороннее данных. *, значительно отличаются между LMC и T-TRAF3- / - мышей (p < 0,05); **, очень значительно отличаются между LMC и T-TRAF3- / - мышей (p < 0.01); , очень значительно отличаются между LMC и T-TRAF3- / - мышей (p < 0,001). Эта цифра была изменена от СЕ и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы имеют без финансовых интересов.