Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка дрозофилы личиночной образцов для газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ МС)-на основе Метаболомика

10.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57847

⸱

6 июня 2018 г.

 , 
1Department of Biology, Indiana University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает, как подготовить для анализа на базе GC-MS Метаболомные дрозофилы личинки.

Аннотация

Последние достижения в области метаболомики создали плодовой мушки Drosophila melanogaster как мощный генетическая модель для изучения животных метаболизма. Объединив широкий спектр дрозофилы генетических инструментов с возможностью обследования крупных swaths посреднических метаболизма, метаболомики подход может выявить сложные взаимодействия между диета, генотип, события истории жизни и экологические сигналы. Кроме того метаболомики исследования можно обнаружить роман ферментативные механизмов и раскрыть ранее неизвестные соединения между казалось бы различных метаболических путей. Для того, чтобы содействовать более широкому использованию этой технологии среди сообщества дрозофилы , здесь мы предоставляем подробный протокол, который описывается, как подготовить дрозофилы личиночной образцы для газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС)- на основе анализа Метаболомные. Наш протокол включает описание личинок проб, экстракции метаболитов, химические деривации и GC-MS анализа. Успешное завершение этого протокола позволит пользователям измерить относительное обилие небольших полярных метаболитов, включая аминокислоты, сахара и органические кислоты участвуют в гликолизе и ТСА циклов.

Введение

Плодовой мушки Drosophila melanogaster стала идеальной системы для изучения молекулярный механизм, который регулировал промежуточный метаболизм. Не только большинство метаболических консервируют между дрозофилы и людьми, но ключевых питательных датчики и регуляторы роста, такие как инсулин, Tor и myc, также активны в лету1,2. В результате дрозофилы может использоваться для изучения метаболизма основу заболеваний человека, начиная от диабета и ожирения нейродегенеративные и рака. В этой связи развития личинок дрозофилы предоставляет идеальные рамки для изучения метаболизма программа, известная как аэробного гликолиза, или Варбург эффект. Так же, как многие опухоли использовать аэробного гликолиза для создания биомассы из углеводов, так что делать дрозофилы личинки активировать аэробного гликолиза для поощрения развития роста3,4,5. Эти сходства между личинок и опухоли метаболизм установить дрозофилы как модель для понимания как аэробного гликолиза, регулируемых в естественных условиях.

Несмотря на тот факт, что лету стала популярная модель для изучения метаболизма большинство исследований дрозофилы полагаются на методы, которые предназначены для измерения отдельных метаболитов3, например, Трегалоза, триглицеридов или СПС. Поскольку конкретный протокол необходим для измерения каждого метаболит, на основе анализа исследований трудоемкий, дорого и предвзятым по отношению к тех соединений, которые могут быть измерены с помощью коммерческих комплектов. Решение этих ограничений возникла из поля метаболомики, который обеспечивает более эффективное и объективное средства изучения метаболизма дрозофилы . В отличие от исследования, на основе анализа анализ одного Метаболомные может одновременно измерять сотни малых молекул метаболитов и обеспечить полное понимание организма метаболический статус6,7. Этот метод значительно расширил сферу исследований метаболизма дрозофилы и представляет будущее этой формирующейся поле8.

Метаболомные исследования проводятся главным образом с помощью трех технологий: (i) ядерного магнитного резонанса (ЯМР), (ii) жидкие хроматография масс-спектрометрия (LC-MS) и9(iii) газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС). Каждый подход имеет свои преимущества и недостатки, и все эти технологии были использованы для успешного изучения метаболизма дрозофилы . Поскольку исследования, проведенные в нашей лаборатории ориентирована на небольшие, полярные метаболиты, мы прежде всего использовать метод, основанный на GC-MS. GC-MS предоставляет пользователю целый ряд преимуществ, включая высокую воспроизводимость, пик разрешение, чувствительность, и доступность стандартных электрона воздействия (EI) спектральных библиотеки, который позволяет для быстрой идентификации обнаружил метаболических особенности10,11. Подготовка образцов для ГХ-МС, однако, является довольно сложной и требует пристального внимания к деталям. Образцы должны быть собраны, промывают, весил и заморожены в манере, которая быстро утоляет метаболических реакций. Кроме того весь каркас устойчив к гомогенизации стандартных протоколов и требует бисерная мельница для обеспечения оптимального метаболит добычи. Наконец образцы анализируемой GC-MS должны пройти химический деривации до обнаружения12. В то время как ранее опубликованные методы описывают все эти шаги3,13,14, визуальный протокол, который позволит начинающего пользователя можно воспроизвести создавать высококачественные данные по-прежнему необходима. Здесь мы продемонстрируем подготовить дрозофилы личиночной образцы для анализа на базе GC-MS метаболомики. Этот протокол позволяет пользователю можно воспроизвести измеряют многие из небольших полярных метаболитов, которые составляют центральный углерода метаболизм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. яйцо коллекция

  1. Собирайте взрослого мужчины и женщины Девы желаемого генотипов. Индивидуально, возраст этих животных в пищевой пузырек с стандартным Блумингтон СМИ для 3-5 дней.
  2. Настроить соответствующие вязки путем передачи 25 мужчины и 50 девственной новый флакон пищи.
    Примечание: Минимум шесть независимых вязки должен быть создан для каждого генотипа. Только один образец будут собраны из каждого спаривания (т.е. шести пробах из шести независимых вязки).
  3. Подготовьте патоки яйцекладка шапки.
    1. Смешайте 115 мл патоки и 29 g агар с 700 мл, H2O в колбе 2 Л.
    2. Отварите меласса агар смесь на горячей плите.
    3. Охладите до 70 ° C.
    4. Добавить 25 мл кислоты смеси (20 мл 85% фосфорной кислоты и 209 мл пропионовой кислоты в 1 Л H2O; Магазин в коричневой бутылке) и 10 мл 10% p гидрокси бензойная кислоты метилового эфира в 95% этаноле.
    5. Наливайте патоку агар в крышку и нижней части ткани культуры блюдо2 35 x 10 мм.
      Примечание: Перед заливкой патоки плиты агара, быть уверены, что крышки или база 35 x 10 мм2 пластины подходят snuggly в рот дрозофилы запасов бутылки (описанные в шаге 1.6). В зависимости от марки плит используется база не может быть полезной.
  4. Сделать свежие дрожжи пасты, добавляя дистиллированную воду до активных сухих дрожжей (5 г дрожжей/7 мл воды) до смесь становится вставки, которые могут легко распространиться на твердой поверхности (например, последовательность арахисовое масло).
  5. Распространения примерно 1,5 г дрожжей пасты на поверхности яйцекладка шапку патоки.
  6. Совать четыре отверстия воздуха в противоположных сторонах пластиковой 6 oz. дрозофилы запасов бутылка иглой 22 G.
  7. Передача недавно растяжением мух от флакона продовольствия в культуру бутылки.
    Примечание: Мухи могут быть переданы либо помощью CO2 , как временный цистит или путем проведения в верхней части флакона в рот бутылки и резко выстукивать в нижней части бутылки против benchtop.
  8. Быстро место патоки яйцекладка колпачок с пастой из дрожжей на поверхности в рот дрозофилы запасов бутылку. Использование ленты лаборатории для обеспечения яйцекладка колпачок на месте.
    Примечание: Если мухи были наркотизированных до их передачи, бутылки должно уделяться горизонтально benchtop до тех пор, пока все мухи выздоровели. После того, как мухи являются полностью мобильными, поместите бутылку в инкубаторе патоки яйцекладка крышкой в нижней части культуры.
  9. Замените крышку яйцекладка мелассы по крайней мере один раз в день в течение первых двух дней инвертирование запасов бутылка, выстукивать в нижней части бутылки против benchtop, удаление старых яйцо колпачок и сразу же размещение новый колпачок яйца в рот бутылку. Утилизируйте старые яйцекладка Кап.
    Примечание: Этот шаг гарантирует, что женщины не держат свои яйца и позволяет для коллекции синхронизированы населения.
  10. Поместите новый колпачок яйцекладка в складе бутылку после дня 3, заменить после 2 h и отбросить. Снять и заменить крышку второй яйцекладка после четырех часов. Метки в нижней части этой яйцекладка колпачок с Дата, время и генотип.
    Примечание: Яйца, собранные во время этого окна 4 h будет использоваться для анализа. Этот шаг синхронизации имеет решающее значение для анализа определенных этапах своего развития. Яйца могут быть собраны таким образом, в течение нескольких дней.
  11. Вставьте колпачков яйцекладка в 60 x 15 мм2 Петри пластины и место в инкубаторе на желаемую температуру и влажность.
  12. Инспектировать яйцекладка шапки каждый день для решения проблем с голода, плотность населения или загрязнения.
    Примечание: Личинки должны иметь доступ к достаточному питанию для обеспечения непрерывного развития. При необходимости, пасты свежих дрожжей может распространяться на все яйцекладка шапки, которые будут использоваться в эксперименте. Кроме того если слишком высока плотность населения личинок, личинки начинают бродить из плиты культуры. Эти образцы не должны использоваться для анализа Метаболомные, потому что высокая плотность населения и промежуточные приступы голода, опытные Бродя приведет к несогласованности данных. Плотность ~ 80 – 100 середина второй instar личинки (L2) на пластину или 40 – 50 среднего третьего возраста личинок (L3) каждой пластины рекомендуется. Образцы, которые заметно загрязненные бактерий или грибов должны быть отброшены.

2. личиночной проб

  1. Возраст до желаемого стадии личинки. Если сбор L3 личинок, ресинхронизация образцы на L2-L3 линьки. Ресинхронизация обычно достигается с помощью ранее описанных метод, использующий передней дыхальца как вехи развития15. Кроме того середине L3 личинки могут быть синхронизированы с помощью Репортер ген sgs3 16.
    Примечание: В этой связи мы находим середине L2 личинки (~ 60 h после откладки) идеально подходит для большинства анализов, потому, что на данном этапе развития личинок все еще относительно синхронной, тщательно собранные образцы имеют достаточное питание развивать этот timepoint и количество животных каждого образца является управляемым (см. ниже). Дополнительная синхронизация шаг необходим для личинок L3, потому что многочисленные экдистероидов импульсов, которые возникают в ходе развития L3 иметь драматический влияние на метаболизм и будет создавать артефакты в несинхронизированные населения.
  2. Используйте рассечения иглы аккуратно поднять дрожжи пасты от агар. Место дрожжей на новый колпачок агар патоки.
    Примечание: Большинство личинки едят на стыке между агар патоки и вставить дрожжей.
  3. Используйте небольшой кистью для сбора личинок от вновь подвергаются поверхности агара патоки. Поместите личинки в 1,5 мл пластиковых пробирок на льду.
    Примечание: Соответствующие выборки для каждой стадии развития являются следующие: 50 первых Инстар личинки (L1); 25 середине L2 личинки; 20 ранних L3 личинки; 15 середине L3 или поздно L3 личинок.
  4. Вымойте и замораживание образцов (шаги 2.3 через 2.8) в небольших партий (четыре-шесть образцов) во время сбора большой образец набора. Образцы должны быть заблокированы в течение 20 мин размещения личинок в трубах.
    Примечание: Мы рекомендуем использовать Eppendorf 1.5 мл пробирок Flex, потому что другие трубки может помешать с передачей образца на шаге 3. Образцы должны быть собраны в пробирках, отцентрифугировать. Не собирать образцы в трубах из бисера, описано в пункте 3.1. Керамический бисер сохраняют промывочного раствора NaCl, что приводит к неточных измерений массы и вводит примесей в образце.
  5. Добавьте 1 mL ледяной 0,9% NaCl в трубу, закройте крышку и вертикально флип трубки тщательно мыть личинки.
  6. Поместите трубку обратно на льду для ~ 30 s. В это время личинки будет опускаться на дно трубки, но дрожжей будет оставаться во взвешенном состоянии. После того, как все личинки сформировали сыпучих гранул, удалите раствор NaCl, с помощью пипетки 1 мл.
  7. Повторите шаг 2.4 и 2.5 дважды, или до тех пор, пока окончательное промывочный раствор является ясно.
    Примечание: Дополнительные мыть шаги может оказаться необходимым, если собранные образец содержит чрезмерное количество дрожжей.
  8. Центрифугуйте образцы на 2000 × g 1 мин при 4 ° C.
  9. Удалите все остаточные решения с помощью пипетки 200 мкл.
  10. Немедленно заморозить образца в жидком азоте.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена на этот шаг. Образцы могут быть сохранены на срок до 3 месяцев при температуре-80 ° C.

3. Передача образцов труб из бисера

  1. Каждой личиночной образца должны быть переданы из трубки отцентрифугировать 1,5 мл трубки screwcap 2 мл, содержащих 1,4 мм керамический бисер. В рамках подготовки этого передачи используйте маркер этанола доказательство для ярлык на стороне 2 мл screwcap шарик трубки (маркировка на крышке будет уничтожено во время шага 4.4).
  2. Масса трубки помечены шарик, используя аналитический баланс точно измерять 0,01 мг.
  3. Если личинок образцы хранятся при температуре-80 ° C, место пробоотборные трубки в жидком азоте до их передачи.
  4. Используйте длинный пинцет, чтобы удалить 1.5 мл образца из жидкого азота Дьюара.
  5. Носить перчатки нитриловые, захватить замороженные трубы, инвертировать и резко фунт крышку трубки против benchtop выбить замороженные Пелле. Сразу же влить гранулы в предварительно тарированного 2-мл пробирку шарик screwcap. Если гранулы не выбить, возвращение трубки для жидкого азота и повторить.
    Примечание: Личиночной гранулы не будет выбить из всех труб отцентрифугировать. Если с помощью трубки не рекомендуется, определите, если личиночной гранулы могут быть смещены до сбора образцов для анализа.
  6. Быстро Измерьте масса личинок Пелле, бисера и трубки. Немедленно Поместите образец трубки в жидкий азот. Личинок Пелле масса будет использоваться для нормализации Метаболомные данные.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена на этот шаг. Образцы могут быть сохранены на срок до 3 месяцев при температуре-80 ° C.

4. Пример извлечения

  1. Поместите образец трубки в benchtop-20 ° C прохладнее.
  2. Добавление 0,8 мл метанола 90% prechilled (-20 ° C), содержащий 2 мкг/мл d4 янтарной кислоты в каждую пробирку. Вернуть образец benchtop-20 ° C прохладнее.
    Примечание: D4-Янтарная кислота выступает в качестве внутреннего стандарта. Используйте только ВЭЖХ класса H2O и метанола. Так как метанола и других органических растворителей летучие и трудно точно измерить с помощью пипетки перемещения воздуха, мы рекомендуем использовать позитивные Перемещение пипетки для этот шаг и все следующие шаги.
  3. Настройка отрицательный контроль путем добавления 0,8 мл метанола 90% prechilled (-20 ° C), содержащий 2 мкг/мл d4 янтарной кислоты в пустой шарик трубку.
  4. Однородности выборок для 30 секунд на 6,45 м/с, с использованием бисера мельница гомогенизатор, расположенный в комнате управления температура 4 ° C.
    Примечание: Неспособность быстро и полностью гомогенизировать личиночной Пелле является распространенным источником изменчивости в анализе метаболомики. Использовать только гомогенизаторы, которые способны уничтожить замороженные личинки ткани в течение 30 s.
  5. Вернуться гомогенизированных образцов труб benchtop-20 ° C прохладнее и инкубировать их в морозильной камере-20 ° C для по крайней мере 1 час.
  6. Центрифуга трубы на 20 000 × g или максимальной скорости 5 минут при температуре 4 ° C для удаления полученный осадок.
  7. Перевести 600 мкл супернатант в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл. Не беспокоить осадок. Если осадок Пелле становится выбили во время закупорить супернатанта, возвращение всех супернатант в трубку и повторите шаг 4.6.
  8. Место пробоотборные трубки в вакуумной центрифуги. Будьте уверены, что все трубы открыты до герметизации центрифуги. Сухие образцы при комнатной температуре, пока удаляется весь растворитель (этот шаг обычно занимает ~ 16 h для завершения).
    Примечание: В случае необходимости, протокол может быть приостановлена на этот шаг. Высушенные образцы можно хранить при температуре-80 ° C.

5. Химическая деривации

  1. Если высушенных образцов хранятся при температуре-80 ° C, место закрытой пробоотборные трубки в центрифугу вакуума и сухой в течение 30 мин. Этот шаг должен выполняться до открытия образец трубки.
    Примечание: Этот шаг удаляет конденсации, который собирает на внешней стороне трубки отцентрифугировать при удалении из морозильной камеры. Эта часть протокола чрезвычайно чувствителен к H2O и дополнительной меры предосторожности должны приниматься держать все реагенты как можно более сухой.
  2. Приготовляют раствор гидрохлорида 40 мг/мл methoxylamine (МОКС) в безводного пиридина. Используйте только безводного пиридина. МОХ и пиридина хранить в эксикаторе и подготовить решение мох ежедневно.
    Предупреждение: Мох и пиридина являются токсичными. Готовить это решение в зонта.
    1. Использование тепловой пушки сухой стеклянный шприц 1 мл.
    2. Вставьте иглу шприца в бутылку безводного пиридина. Удаление 1 мл пиридина и добавить отцентрифугировать трубка, содержащая 40 мг мох.
    3. Промойте бутылку безводного пиридина аргоном. Печать бутылки и вернуться в эксикаторе.
    4. Растворите мох в пиридина, инкубации трубку в тепловой смеситель при 35 ° C для 10 мин при 600 об/мин.
  3. Мкл 40 40 мг/мл мох в растворе безводного пиридина сушеные образца.
  4. Вортекс для 10 s и кратко центрифуги (10000 x g 20 s).
  5. Инкубируйте на 30 ° C в течение 1 ч при 600 об/мин в тепловой смеситель.
  6. Центрифуга для 20 000 × g или максимальная скорость за 5 мин для удаления частиц.
  7. Перевести 25 мкл супернатант в автоматический пробоотборник флакон с microvolume вставкой стекла 250 мкл деактивирован.
  8. 40 мкл N- метил -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA), содержащей 1% TMCS.
    Предупреждение: MSTFA является токсичным. Выполните этот шаг в зонта.
    Примечание: Если возможно, этот шаг может быть дополнено Герштель Автоматический пробоотборник.
  9. Поместите колпачок на автоматический пробоотборник флакона и печать с помощью средства разглаживания.
  10. Образца при 37 ° C Инкубируйте 1 час при встряхивании (250 об/мин).
  11. Подготовьте стандартное решение (ФИЕЛД) жирные кислоты метил эфира как ранее desceribed3. Добавьте 3 мкл ФИЕЛД Автоматический пробоотборник флакон с использованием роботизированной Автоматический пробоотборник непосредственно перед введением.
    Примечание: Помимо используются для калибровки сдвиг времени удержания и проверить производительность инструмента. Если не робот Автоматический пробоотборник, Фиелд могут быть добавлены во время шага 5.8.

6. GC-MS обнаружение

Примечание: В большинстве случаев, пользователь будет проводить этот шаг с помощью Фонда основных масс-спектроскопии. Этот протокол предназначен для использования с 30 м, GC столбец со столбцом гвардии 5 м.

  1. Случайный порядок выборки.
  2. Подготовьте GC-MS.
    1. Набор скорости потока газа перевозчик гелия до 1 мл/мин.
    2. Установите температуру входе до 250 ° C.
    3. Программа GC для выполнения следующих градиента температуры:
      1. Первоначальная температура до 95 ° C с провести 1 мин.
      2. Повысьте температуру до 110 ° C со скоростью 40 ° C/мин при проведении 2 мин.
      3. Увеличение до 250 ° C на рампе 5° C/мин.
      4. Увеличение до 330 ° C со скоростью 25 ° C/мин при окончательном провести 4 мин.
    4. Установка растворителей задержки до 3,5 мин.
      Примечание: Время может быть изменено согласно системе GC-MS. Этот шаг призван предотвратить повреждение детектор MSTFA и мох.
  3. Inject 1 мкл derivatized образца в ГХ-МС (разделение в соотношении 10:1).
    Примечание: Inject 2 мкл пример, при слишком низкой интенсивности пиков. Порядок впрыска образцов следует рандомизированы.
  4. Работают масс-спектрометр в режиме полного сканирования массового диапазоне 50-500 м/z.

7. анализ данных

  1. Анализируйте Метаболомные данные с помощью либо целевых или нецелевых подход. Целевой анализ сосредоточена на измерении обилие определенный набор метаболитов, таких как измерения лактата, которые мы опишем ниже. В отличие от нецелевого анализ использует беспристрастный подход для выявления любых метаболических функция, которая значительно изменилась между двумя наборами образца.
    Примечание: Наша лаборатория главным образом использует свободные программы MetAlign17 и18,MetaboAnalyst19 для анализа данных. Так как адекватное описание контроля качества, нормализации и шаги обработки данных выходит за рамки этой рукописи, мы ссылаемся пользователя более подробные протоколы, которые посвящены обработки данных20,21, 22. Кроме того диаграмма, описывающие шаги, необходимые для этого анализа можно найти в других8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Дегидрогеназа лактата (dLDH) мутантов, которые не имеют dLDH активность4и генетически соответствием контроля были собраны в середине L2 личинок и обработаны согласно протоколу, описанных выше. По сравнению с элементами управления, мутант личинки демонстрируют значительные изменения в лактата и пирувата, L-2-hydroxyglutarate4. Спектры были приобретены с системой Agilent GC6890-5973i МС. Пример ГХ-МС спектры генерировать с нашими прот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метаболомика предоставляет беспрецедентную возможность для обследования метаболических реакций, которые составляют промежуточный метаболизм. Чувствительность этой технологии, однако, отображает данные подвержены генетический фон, развития подсказки и разнообразные экологического стресса, включая температуру, влажность, плотность населения и наличия питательных веществ. Таким образом, высокое качество и воспроизводимость метаболомики анализ требует, что образцы собраны в высоко контролируемых условиях. Хотя несколько обзо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Спасибо для членов Фонда спектроскопии массы университета Индианы и Университет Юты метаболомики Core фонда для оказания помощи в оптимизации этого протокола. СГН поддерживается путем национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под награду номер R35GM119557.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Несульфированная черная патокаGood Food, INC
Drosophila Agar Type IIGenesee Scientific66-103
PyridineEMD MilliporePX2012-7
Methoxyamine hydrocholoride (MOX)MP Biomedicals, LLC155405
MSTFA с 1% триметилхлорсиланомSigma69478
Флейшман s Активные сухие дрожжиAB Mauri Food Inc2192
6 унций бутылочка дрозофилыGenesee Scientific32-130
Смесь для гомогенизации мягких тканей (2 мл тюбиков) Omni InternationalАртикул:19-627
Вкладыш для флаконов, 250 & микро; L деактивированное стекло с полимерными ножкамиAgilent5181-8872
Янтарная кислота-2,2,3,3-d4Sigma293075
SpeedVacThermo SC210A
o-фосфорная кислотаFisher ScientificA242-1
Пропионовая кислотаSigmaP5561
p-гидроксибензойная кислота метиловый эфирGenesee Scientific20-258
Bead RuptorOmni InternationalАртикул:19-040E
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000012
Шейкер MultiTherm с блоком 24 X 12 ммBenchmark ScientificH5000
MethanolSigma34860
1,5 мл центрифужная пробиркаEppendorf22364111
Falcon 35 X 10 мм чашка для культуры тканейCorning Incorporated353001
колонка GCPhenomexZB-5MSi

Ссылки

  1. Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
  2. Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
  3. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  4. Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
  5. Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
  6. Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
  7. Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
  8. Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
  9. Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
  10. Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
  11. Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
  12. Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
  13. Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
  14. Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
  15. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
  16. Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
  17. Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
  18. Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
  19. Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
  20. Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
  21. Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
  22. Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
  23. Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метаболомика методом ГХ-МСэкстракция метаболитовхимическая дериватизациягомогенизация в бисерном измельчителевакуумное центрифугированиедериватизация метоксиламиномсилилирование MSTFAподготовка пробирок для автосамплераанализ главных компонентов
Подготовка дрозофилы личиночной образцов для газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ МС)-на основе Метаболомика
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.