Методическая статья
В отсутствие морфологические критерии или не информативный цитогенетика трудно диагноз MDS. MFC могут помочь уточнить процесс диагностики MDS. Чтобы стать полезным для клинической практики, анализ MFC должна основываться на параметры с достаточной специфичность и чувствительность, и данных, должна быть воспроизводимой между различными операторами.
Рабочая группа, начатый в рамках французской ассоциации цитометрии (АФК) был разработан для того, чтобы согласовать применение многопараметрических проточной цитометрии (MFC) для диагностики заболеваний миелоидного во Франции. Протокол, представленные здесь был согласованным и прикладной между сентября 2013 года и ноября 2015 года в шести французский диагностических лабораторий (больницы университета Сент-Этьен, Гренобль, Клермон-Ферран, Ницца и Лилль и Institut Паоли-Calmettes в Марсель) и стандартизации костного образец подготовки и сбора данных. Для нейтрофилов, monocytic и эритроидные линий с костного мозга от «здоровой» доноров лиц (лица без каких-либо доказательств кроветворных заболеваний) были разработаны три созревания баз данных. Надежный метод анализа для каждого миелоидного линии должны быть применимы для рутинной диагностики. Новых случаев можно проанализированы таким же образом и сравнивается обычных баз данных. Таким образом могут быть определены количественные и качественные фенотипические аномалии и те выше 2SD, по сравнению с данными нормального костного образцов следует рассматривать свидетельствует о патологии. Основным ограничением является выше изменчивость между данными, с помощью моноклональных антитела, полученные с методами на основе гибридомной технологии и в настоящее время используется в клинической диагностике. Установление критериев для технической проверки полученных данных может помочь повышению полезности MFC для диагностики MDS. Установление этих критериев требует анализа в базе данных. Сокращение следователь субъективности в анализе данных является важным преимуществом данного метода.
В отсутствие фенотипические маркеры для диспластических изменений, происходящих в миелоидных клеток во время посвящения MDS и прогрессии был предложен новый подход в последние годы на основе оценки путей созревания (измененное выражение Миелоидные антигенов в ходе производства зрелой миелоидных клеток) или ненормальные распределения различных типов клеток внутри костного мозга (БМ) клетки отсеков1,2.
Эта статья представляет новый метод для стандартизированных приложений MFC с целью обнаружения диспластических изменений в отсеках BM миелоидных клеток, связанных с миелодиспластические синдромы (MDS) или другие миелоидного гематологических заболеваний. Это исследование также показывает полезность использования созревания баз данных для анализа данных MFC.
Стандартизация процедуры подготовки образца, сбора данных и анализа с использованием базы данных позволит идентификации наиболее актуальных фенотипические патологий, связанных с диспластических изменений в BM миелоидных клеток. Таким образом для разработки стратегии анализа, который может использоваться в последующих анализа требуются статистически выбранных подмножеств, основанные на четко обозначенные и общепризнанным форматов (автоматический сепаратор населения (APS) диаграммы, гистограммы и точка участков) раундов. Открытие надежные фенотипические аномалии в MDS облегчит диагноз в случаях с или без минимальной морфологических дисплазии и цитогенетического aberrancies. Выявление дискриминационных параметров, позволяя для уменьшения иммунофенотипических панелей может упростить текущей оценки2, позволяя их применимость в лаборатории клинической патологии.
Этот метод ограничивает субъективной интерпретации данных цитометрии, как был подан сигнал в MDS диагноза3. Этот шаг является необходимым условием для разработки автоматизированных средств обработки и анализа потока данных4.
MDS включает в себя разнородную группу расстройств клоновых гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), в которых Сплайсосома мутации сотрудничать с конкретными эпигеномные модификаторы приносить фенотип MDS. Сейчас известно, что, наряду с HSC мутации, другие механизмы участвуют в MDS патофизиологии, например аберрантных иммунной опосредованного воспаление и взаимодействия между злокачественными СКК и стромы микроокружения BM. Однако эти механизмы по-прежнему не ясны. Широкой клинической и биологической неоднородности MDS делает диагностики и выбора оптимальной терапии вызов. В течение последнего десятилетия, несколько исследований показали, что MFC зачастую является более чувствительные для обнаружения дисплазии2 чем морфологии, но технические и экономические трудности делают эту технику трудно стандартизировать, с результатами часто в зависимости от опыт работы переводчиком3. Кроме того неясно, как MFC может склонить чашу весов к MDS в случаях с или без минимальной морфологических дисплазии и в отсутствие цитогенетических отклонений или в спорных случаях такие гипоклеточные MDS, с низким Доменная игр, от других не клоновых BM расстройств, таких как недостаточность костного мозга (т.е., апластическая анемия). Он также по-прежнему трудно дифференцировать пограничных случаев MDS с избытком взрывов от острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). По всем этим причинам клинические руководства не интегрировать MFC тестирования в MDS окончательный диагноз. В 2011 году США национальной всеобъемлющей рака сеть (NCCN) рекомендовал MFC для оценки доли CD34 + клеток, обнаружение клонов пароксизмальная Ночная гемоглобинурия и присутствие цитотоксических Т-клеток клонов в MDS гипоклеточные5. Эти две последние ситуации также включать терапевтической цели потому что клинических данных показали хорошую реакцию этих больных до6иммуносупрессивной терапии. 2017 NCCN Руководство, ссылаясь на рекомендации Международной рабочей группы (МРГ), перечисленные аберрантных Иммунофенотипирование обнаружения библиотекой MFC среди совместно критериев для MDS диагноз, но без внесения каких-либо характеристики6. Кроме того недавно опубликованном ВОЗ классификации гласит, что MFC выводы только не достаточно, чтобы установить первичный диагноз MDS в отсутствие убедительных морфологических и/или цитогенетических данных7. Однако MFC может использоваться как дополнительное испытание показаны dysregulation миелоидных клеток созревания шаблоны и количественного определения «расстояние от нормальных» для пациента в определенное время в течение заболевания.
Этот метод применим в клинических лабораториях заинтересован в оценке дисплазии в BM миелоидных клеток с помощью MFC иммунофенотипирование, для уточнения диагноза в MDS или других миелоидного расстройств с диспластические аномалии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перечисленные ниже протокол был одобрен «Comité de защиты des Personnes» (независимый Комитет по этике) 1 Sud Est с университет Больница Сент-Этьен, Франция.
1. цитометр параметры
Примечание: Параметры цитометр были выполнены согласно Франции потока рекомендации, в соответствии с EuroFlow процедура «операционной EuroFlow стандартный протокол (СОП) для установки инструмента и компенсации (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
2. BM пробоподготовки
Примечание: Выполнение стирки протокол перед процедурой окрашивания клеток.
3. сбор данных
4. анализ данных
Примечание: Для создания нормальной BM баз были используемые файлы от здоровых доноров и частных лиц без каких-либо доказательств кроветворных заболеваний следующим 11 из 18 файлов для Neutrophils_NM базы данных, 10 из 18 файлов для базы данных Monocytes_NM и 14 из 18 файлы базы данных NRC_NM. Файлы удаляются, показали различные технические проблемы, как представлено в разделе представитель результаты. Файлы индивидуально были проанализированы с использованием программного обеспечения Infinicyt (Таблица материалов), отвечающей различным стратегиям, изображенные на рисунке 1A(1-3) для нейтрофилов линии (профиль Neutrophils_Maturation.inp), на рисунке 2 A Моноцит линии (профиль Monocytes_Maturation.inp), и Рисунок 3A(1-2) для эритроидных клеток линии (профиль NRC_Maturation.inp).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В исследование были включены 54 BM образцы собраны в K-ЭДТА антикоагулянтом. MFC данные были проанализированы в отсутствие любой информации о пациентах. Ретроспективное исследование показало, что BM образцы из 7 здоровых доноров (5 кобелей и 2 суки с средний возраст 47,4 [35-48], 11 человек с никаких доказательств кроветворных заболеваний (8 мужчин и 3 женщины с средний возраст 57,9 [35-72]) и 36 случаев с различными патологических состояний: 1 случай с анемии и низкого креатинина, 3 слу...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Качество BM аспирата может повлиять на окончательные результаты. Гемодилюции аспирата BM может исказить распределение ячейки на разных стадиях созревания ввиду отсутствия прародителей или прекурсоров. Возможно используя основную лизировать метод может помочь в нормализации BM пунктаты для гемодилюции в поток гранулярных анализы. Кроме того критические шаги для оценки BM миелоидного дисплазии подачей cytometry являются образец обработки и окрашивания, сбора данных и интерпретации2,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов. Цитометрии отдел, Лаборатория гематологии больницы университета города Сент-Этьен является членом консорциума EuroFlow.
Антитела, используемые в данном исследовании были предоставлены BD бионауки. Авторы хотели бы поблагодарить своего коллегу, д -р Паскаль Flandrin-Gresta, от отдела молекулярной биологии, Лаборатория гематологии, университета больнице Сент-Этьен, Франция, которые предоставили экспертов для интерпретации данных NGS для второго MDS случай. Авторы благодарны за клинициста гематологов за их интерес и участие в этом исследовании и для больных и здоровых доноров за их согласие на участие в этом исследовании. Авторы хотели бы также поблагодарить фонд «Реми де Les масс» для финансовой поддержки для публикации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Проточный цитометр BD FACSCanto II | BD Biosciences, CA, США | SN: V33896301336 | 3-лазерный, конфигурация 4-2-2, Фильтры и зеркала: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Модель No: 320002001 | низкоскоростные центрифуги; емкость 60 пробирок FACS |
| Пипетки 10&микро; L и 200&микро; L | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 мл Falcon tubes | |||
| полипропиленовая трубка для FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, США | 655874 | клон L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, США | 560777 | клон HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 нм/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, США | 656146 | клон CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Мышиный Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, США | 347406 | клон L138 Mouse BALB/c x C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 нм/ Em max 578 нм) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, США | 347222 клон 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) | |
| Мышиный Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, США | 339217 | клон 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 нм/ Em max 785 нм) |
| Мышиный Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, США | 333143 | клон D12 мыши BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 нм/ Em max 660 нм |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, США | 646783 клон HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 нм/ Em max 785nm) | |
| Мышиный Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, США | 555452 | клон E11 мыши IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 нм/ Em max 520 нм) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, США | 644385 | клон 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Флуорохром PE (Ex max 496 нм/ Em max 578 нм) |
| Мышиный Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | клон UP-H2 мыши BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 нм/ Em max 578 нм) |
| Мышиный Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, США | 641394 | клон MoP9 мыши BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 нм/ Em max 785nm) |
| Мышиный Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, США | 656151 | клон CLB-IVC7 мыши IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 нм/ Em max 520 нм) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, США 560839 | клон 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 нм/ Em max 578 нм) | |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | клон P67.6 мышь BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 нм/ Em max 578 нм) | |
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, США | 655408 | клон M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 нм/ Em max 785 нм) |
| Лизирующий раствор 10x Концентрат (IVD) | BD Biosciences, CA, США | 349202 | |
| FACSlow Wooath Fluid | BD Biosciences, CA, США | 342003 | |
| FACSDiva CS& Бусины TIVD | BD BD Бионаука, Калифорния, США 656046 | ||
| РАДУЖНЫЕ КАЛИБРОВОЧНЫЕ ЧАСТИЦЫ, 8 ПИКОВ | Cytognos, Саламанка, Испания | SPH-RCP-30-5A | лоты EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAJ01, EAK01 |
| Компенсационные частицы Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, США | арт. #51-90-90012291 | |
| Версии программного обеспечения Diva 6.1.2 и 6.1.3 | BD Biosciences, CA, США | ||
| Фосфатные буферные таблетки с солевым раствором | R& D Systems, Миннеаполис, США | 5564 | |
| Бычий сывороточный альбумин ( BSA) | Sigma-Aldrich, Франция | A9647 | |
| Азид натрия 99% | Sigma-Aldrich, Франция | 199931 | |
| Программное обеспечение Infinicyt версии 1.8.0.e | Cytognos, Саламанка, Испания |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение