Method Article

Рассечение Enhancer функции мультиплексной основанный ТРИФОСФАТЫ Enhancer вмешательства в клеточных линиях

DOI:

10.3791/57883

⸱

June 2nd, 2018

 ,  , 
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает шаги, необходимые для проектирования и выполнения мультиплексированных ориентации усилители с отключение синтез белка SID4X-dCas9-краб, также известный как усилитель вмешательства (Enhancer-i). Этот протокол позволяет идентифицировать усилителей, которые регулируют экспрессию генов и облегчает рассечение отношений между усилители, регулирующие общие цели ген.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько усилителей часто регулируют данного гена, но для большинства генов, остается неясным, какие усилители необходимы для экспрессии генов, и как эти усилители в совокупности производят transcriptional ответ. Как миллионы усилители были определены, высок объём инструменты необходимы для определения усилитель функции генома масштабе. Нынешние методы для изучения усилитель функции включают в себя генетические удалений с использованием Cas9 Нуклеаза владеют, но трудно изучить комбинаторной последствия нескольких усилителей, используя эту технику, как несколько последовательных клоновых клеточных линий должны быть сгенерирован. Здесь мы представляем Enhancer-i, ТРИФОСФАТЫ на основе вмешательства метод, который позволяет для функциональных допроса нескольких усилителей одновременно на их эндогенных локусов. Enhancer-i использует два репрессивных доменов, сливается с нуклеиназы недостаточным Cas9, Сид и краб, для достижения усилитель деактивация через гистона диацетилморфина на целевых локусов. Этот протокол использует переходных трансфекции руководство РНК для включения переходных инактивации целевых регионах и особенно эффективен на блокирование индуцибельной транскрипционный анализ ответов на раздражители в настройках культуры ткани. Enhancer-i весьма специфические, как в его геномной ориентации и его влияние на экспрессию генов глобальной. Результаты, полученные из этого протокола помогают понять ли усилитель способствует экспрессии генов, масштабы вклада, и как вклад зависит от других близлежащих усилители.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Крупномасштабные последовательности проектов, таких как кодирование1, план Epigenomics2и FANTOM3 определили миллионы предполагаемого усилители в геноме человека через сотни типов клеток. Предполагается, что каждый промоутер связывает с в среднем 4,9 усилители и каждый усилитель контакты в среднем 2,4 генов3, предполагая, что экспрессии генов часто является результатом интеграции нескольких распределенных регулирования взаимодействия. Значительное нерешенная проблема заключается в определении не только как отдельные усилители вклад экспрессии генов, но как они объединяются, чтобы повлиять на выражение. Генетический подходы обычно используются для выявления связей между усилители в модельных организмов от дрозофилы4 до5мышей. Однако эти эксперименты, длительным и низкой пропускной способности для изучения нескольких усилителей на нескольких генов.

Один из подходов для изучения функции усилитель в крупных масштабах включает массивно параллельной репортер анализов. Эти анализы позволяют для одновременного скрининга тысяч последовательностей ДНК для их способности управлять выражение гена репортера6. Хотя эти анализы показали, что последовательность ДНК одиночку может быть достаточно передать ген регулирования информации7, они приходят с предостережениями о выполняемой вне контекста родной хроматина и гетерологичных промоутера. Кроме того размер последовательности ДНК, анализируются в массивно параллельной репортер анализов, как правило, менее 200 basepairs, которые могут исключить соответствующие окружающие последовательности. Главное как репортер анализов только измерения активности одной последовательности в то время, они не принимают во внимание сложные отношения, которые могут существовать между усилители. Таким образом хотя массивно параллельной репортер анализов могут быть информативным о внутренней деятельности последовательности ДНК, они не информируют обязательно нас функции этой последовательности ДНК в контексте генома.

Недавно развитых ТРИФОСФАТЫ/Cas9 средства8 облегчили исследование регуляции генов, как они позволяют исключить усилители на эндогенный Локус. Однако удаление нескольких усилителей одновременно может привести к геномной нестабильности, и это занимает много времени для создания последовательных усилитель удалений в одну ячейку строки. Кроме того новой геномной последовательности создан на месте удаления, после ремонта, и эта последовательность может получить функции регулирования. Альтернативная версия Cas9 была разработана специально для модуляции экспрессии генов, полагаясь на сплавливания активации9,10 или подавления доменов12 11,Нуклеаза недостаточным формы Cas9 (dCas9). Эти протеины сплавливания идеально подходят для изучения нескольких локусов одновременно, как они физически не изменять последовательность ДНК и вместо этого модулировать эпигенетики для того, чтобы допросить регулирования региона. Наиболее широко используемый репрессивных fusion-краб, которая вербует комплекс совместно репрессор KAP1, поощрение осаждения репрессий связанные гистонов H3 лизин 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-краб, также известный как ТРИФОСФАТЫ вмешательства14, был использован для целевого и экран индивидуальных усилителей за их вклад в выражение гена,1516; Однако он не был оптимизирован для охвата нескольких регионах одновременно. Одна версия мультиплекс ТРИФОСФАТЫ вмешательства для усилителей, мозаика seq17, использует одну ячейку РНК seq как индикация, но эта технология является дорогостоящим и подходит только для изучения весьма выраженным генов из-за низкой чувствительности одну ячейку РНК seq.

Мы стремились разработать метод, основанный на вмешательство ТРИФОСФАТЫ для рассечения комбинаторной усилитель функции в контексте транскрипционный анализ ответа в эстроген. Около половины из эстроген отзывчивым гены содержат 2 или более усилителей, обязательность эстрогеновых рецепторов альфа (ER) поблизости18, предполагая, что несколько усилителей может участвовать в ответ эстрогена и понимая логику регулирования потребует одновременно на нескольких усилителей. Как первоначальные исследования с использованием ТРИФОСФАТЫ вмешательства на промоутеров предложил, что не все промоутеров одинаково реагировать на репрессии, краб опосредованной19, мы рассудил, что добавление различных репрессивных домена dCas9 может облегчить деактивации различные усилители. Мы выбрали Sin3a взаимодействия домена из Mad1 (SID)20 как это приводит к набору гистона комплексы21, которые удаляют ацетильной группы на гистонов, которые связаны с транскрипционный анализ активности. Важно отметить, что SID домена было эффективным средством снижения экспрессии генов, когда сливается с dCas922 и23сказки, и Sin3a было показано, быть мощным фактором репрессивных совместно в различных усилитель последовательности контекстов24. Мы использовали SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) для 10 различных усилителей, обязательность ER и определения сайтов связывания ER (ERBS), которые необходимы для эстрогена транскрипционный анализ ответов 4 генов18. Мы также нацелены комбинации усилители для выявления сайтов, которые сотрудничают в производстве эстроген транскрипционный анализ ответа. Мы обнаружили, что до 50 сайтов могут потенциально быть направлены одновременно с изменения выражения гена обнаружению. С помощью чип seq и РНК seq, мы продемонстрировали, что Enhancer-i является весьма специфический метод для изучения нескольких усилителей одновременно.

В этом протоколе мы описывают шаги, необходимые для выполнения Enhancer-i, гибкий метод, который позволяет функциональные исследования нескольких усилителей одновременно в условиях культуры ткани. Enhancer-i тесно связано с генетическим удаления, но обеспечивает временной деактивации, который зависит гистона комплексы (ГДА). Обеспечивая руководство РНК через переходные трансфекции отличие от стабильной интеграции через вирусных векторов, этот протокол позволяет избежать осаждения и потенциального распространения H3K9me3. Этот дизайн руководство РНК детали протокола и клонирование через Гибсон Ассамблеи, transfection из руководство РНК с помощью липофекция, и анализ экспрессии генов в результате изменений, ПЦР. Мы также включают в себя методы для оценки специфика Enhancer-i таргетинг на уровне генома и транскриптом. Хотя этот метод был разработан для изучения гена регулирование ER связаны расширители в человеческих раковых клеток линии, это применимо к рассечение любой млекопитающих усилитель.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. поколение клеток линии стабильно выражения SID4X-dCas9-краб

Примечание: Трансфекции условий и концентрации наркотиков, представленные здесь были оптимизированы для клеток Исикава, на линию клеток рака эндометрия, выращенных в СМИ RPMI 1640 с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (полная RPMI). Другие клеточные линии может потребовать различных трансфекции условий и концентрации наркотиков. Пользователи также могут выполнять переходные трансфекции эксперименты в одичал тип клеток, вместо создания стабильной клеток линии, с плазмида, выражая SID4X-dCas9-KRAB наряду с руководство РНК, выражая плазмиды; Однако результаты от переходных transfections может быть сложно воспроизвести, как SID4X-dCas9-KRAB уровни могут различаться по transfection.

  1. Пластина Исикава клетки в по крайней мере 2 скважин 6-ну пластины при впадении (приблизительно 300.000 Исикава клетки) 30-50% в 3 мл полной RPMI.
    1. Аспирационная СМИ из клеток. Вымойте клетки один раз с ПБС (рН 7,4). Аспирационная PBS и добавить трипсина (4 мл на 10 см блюдо или 5 мл раствора для в T-75 колбу).
    2. Инкубируйте клетки ~ 5 минут при 37 ° C, проверяя каждые 2 мин, для отдельных ячеек и слегка покачивая судна.
    3. После того, как клетки отдельный, Пипетка trypsinized клетки вверх и вниз несколько раз и пипетки нежно вниз стороне корабля освободить любые вложенные ячейки.
    4. Клетки перехода к 15 мл Конические трубки и спина клетки вниз на 5 мин на 250 x g.
    5. Аспирационная трипсина и Ресуспензируйте клетки в 5-10 мл средства массовой информации. Используйте пипетку P1000 не присоединяться скопления клеток, при необходимости.
    6. Подсчитать количество ячеек и определить объем необходимых для пластины ~ 300 000 ячеек на Ну в общем объеме 3 мл. Добавьте клетки 2 отдельных скважин 6-ну плиты. Заполните каждый хорошо для 3 мл с полным RPMI.
    7. Осторожно встряхните пластину каждые 5 минут в первые 15 мин после покрытия для обеспечения что клетки равномерно распределены на плите. Используйте Микроскоп чтобы убедиться, что клетки разошлись с середины колодца.
  2. В течение 24 ч обшивки выполните следующие transfections, используя соответствующие трансфекции реагент для линии клетки интереса. Для Исикава ячеек используйте процедуру, как описано ниже.
    Примечание: Этот протокол предполагает использование катионных на основе липосом трансфекции реагентов. Электропорация предоставляет альтернативный метод для типов клеток, которые очень чувствительны к эти реагенты или что экспонат низкого трансфекции эффективность с липофекция. Трансфекция условия должны быть оптимизированы для линии клетки интереса перед Enhancer-i экспериментов.
    1. В 1,7 мл трубки Эппендорф, разбавляют 2,5 мкг SID4X-dCas9-KRAB плазмиды и 800 нг плазмида, выражая флуоресцентного белка в сыворотке свободных средств массовой информации, такие, что окончательный объем в трубе-155 мкл и конечная концентрация плазмида 0,020 мкг/мкл.
    2. В другой трубки разбавляют 3,3 мкг плазмиды, которые не содержат неомицин сопротивления кассету, например pCMV-GFP, в сыворотке свободных средств массовой информации таким образом, что окончательный объем в трубе-155 мкл и конечная концентрация плазмида 0,020 мкг/мкл.
    3. Вихревой каждая трубка кратко и спин вниз с помощью отцентрифугировать.
    4. Мкл 9.9 трансфекции реагента (Таблица материалов) к каждой трубе. Смешайте vortexing кратко на низкой скорости. Спин трубы вниз с отцентрифугировать.
    5. Инкубируйте трубы при комнатной температуре по крайней мере 5 минут, но не более 20 мин.
    6. В области биобезопасности кабинета добавьте 150 мкл смеси подготовлены ДНК: Реагент каплям один колодец на пластину 6-хорошо. Повторите для другой трубки подготовленных ДНК: Реагент микс. Mix плиты закрученного мягко и возвращение пластину в инкубаторе.
  3. В день 2 пост трансфекции изменить СМИ и дополнить с G418 до конечной концентрации 600 нг/мкл. Эта концентрация может должны быть оптимизированы для типа ячейки.
  4. Измените полное RPMI СМИ и дополнить с G418 каждый день в течение 2-4 недель до управления transfected клеток мертвых и скважин, содержащие SID4X-dCas9-KRAB стать вырожденная. Точное количество времени, необходимое для клеток для восстановления будет зависеть от время удвоения клеток.
  5. Когда клетки становятся вырожденная, проход к T-25 или T-75 судно в полный RPMI с низкой дозы G418 (300 нг/мкл для Исикава клетки). Во время этого отрывка сделайте 2 аликвоты ~ 100000 клеток каждого (примерно 1/10й 6-ну плиты) в 2 отдельных 1,7 мл пробирок Эппендорф для изоляции РНК и ДНК, соответственно. Спиновые эти трубы вниз (5 мин., 250 x g), удалите трипсина, закупорить и замораживания труб при-20 ° C для использования в будущем.
  6. Изолировать геномной ДНК, используя имеющиеся наборы и выполнять ПЦР, используя «pAC95_PCR» или «SID4X_PCR» грунтовки (Таблица 1) для проверки наличия синтез белка в в линии клеток. Используйте в качестве позитивного управления геномной ДНК, извлеченные из родительской строки как отрицательный контроль и SID4x-dCas9-KRAB плазмида ДНК. Используйте мастер смесь высокой верности полимеразы с 50-100 нг геномной ДНК и следующих условий Велоспорт: 98 ° C за 30 сек, 25 циклов (98 ° C 10 s, 58 ° C за 30 s, 72 ° C на 2 мин), 72 ° C за 5 мин , удерживайте при 4 ° C.
  7. Чтобы проверить выражение синтез белка на уровне РНК, выполните ПЦР РНК, извлеченные из строки ячейки, используя коммерчески доступные наборы. Использование «dCas9_qPCR» грунтовки (Таблица 1) и протокол ПЦР Одношаговая, заданное на шаге 6.3 настоящего Протокола.
  8. Чтобы проверить выражение уровень протеина сплавливания, выполните западной помарки на лизатов от линии клеток. Использование анти флаг или анти-Ха антитела для обнаружения синтез белка.

2. Руководство РНК дизайн

Примечание: Этот протокол разработан для использования с РНК руководство U6, клонирование вектор созданный лабораторией церковь и доступна на Addgene (Addgene 41824). Чтобы создать версию этого вектора, содержащие puromycin сопротивления, что позволило для той же клонирования стратегии как 41824, мы переехали несколько клонирования сайта из этого вектора в вектор pGL3-U6-sgRNA курьер puromycin (Addgene 51133). Addgene 41824 или наша версия с puromycin (Addgene 106404) совместимы с клонирования стратегию, изложенную ниже.

  1. Получите basepairs 600-900 последовательности ДНК для каждого нормативной области интереса. Использование сайтов связывания фактор транскрипции и/или хроматина доступность для руководства о том, где для определения области интереса (рисунок 2A).
    Примечание: Хотя в примере на рисунке 2A усилителей вверх и вниз по течению, это также возможно ориентироваться нормативных элементов, расположенных в пределах интронов.
  2. Поместите все последовательности, полученные в один текстовый файл, используя формат FASTA.
  3. Определите по крайней мере один отрицательный контроль региона, который, как ожидается, не изменить над экспериментальных условиях, таких как промоутер гена, которое выражается не в линии клетки интереса. Получить последовательность ДНК для этого региона и добавить его в текстовый файл в формате FASTA.
    Примечание: Мы используем руководство РНК, ориентация IL1RN промоутер25 как отрицательный контроль для всех регионов, которые мы нацелены. Пользователи могут также выбрать intergenic последовательность вблизи региона интерес, которые не содержат сайтов связывания фактор транскрипции как отрицательный контроль. Однако если одновременно являются мишенью нескольких локусов, один отрицательный контроль регион упрощает экспериментальный дизайн и интерпретации результатов. Если целевой усилитель intronic, это может быть полезным для целевого intronic региона в том же локусе, который не содержит элемент предполагаемого регулирования как элемент дополнительные негативные, как dCas9 fusion может вмешиваться в транскрипции.
  4. Определите положительный контроль регионов, таких как промоутеров, которые являются предполагаемые цели регулирования областей интереса, или промоутеры из генов, которые высоко транскрибируется в линии клетки интереса. Получить последовательность ДНК для этих регионов и добавить его в текстовый файл в формате FASTA.
  5. Используйте такие программы, как e хрустящий26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) на последовательности ДНК, чтобы найти руководство РНК с низкой вне целей (в идеале 0-3). Руководство РНК состоит из 20 нуклеотидов, вверх по течению protospacer прилегающие мотив (PAM), которая принимает форму «НЭС» для dCas9 от S. pyogenes.
    1. На сайте e хрустящий выберите организм интерес, раскрывающемся меню. Сборка генома появляется справа от имени вида.
    2. Установите переключатель Вход — FASTA последовательность . Скопируйте FASTA последовательности от выше и вставить их в диалоговом окне. Убедитесь, что заголовок FASTA включена для каждой последовательности.
      Примечание: До 50 последовательности можно запрашивать одновременно.
    3. В раскрывающемся меню выберите переключатель среднего и единый дизайн .
    4. Нажмите кнопку начать поиск sgRNA. Откроется новая вкладка браузера, и результаты будут отображаться. Скачайте кандидат последовательности, нажав на кнопку скачать табличный отчет Excel формате для всех запросов последовательностей вместе.
    5. Откройте табличный отчет с помощью Excel или программы для редактирования текста.
  6. Используйте UCSC генома браузер БЛАТ кандидат полнометражного gRNA последовательностей (23 basepairs) генома.
    1. В браузере перейдите к UCSC генома браузер веб-сайт (http://genome.ucsc.edu). В разделе наши инструментынайдите слова, БЛАТ и нажмите на него. Откроется средство поиска БЛАТ.
    2. Используйте раскрывающиеся меню, расположенный под Генома БЛАТ Поиск текста для выбора организма и геном Ассамблеи интереса.
    3. Скопируйте руководство РНК последовательности из табличного отчета, порожденных e хрустящий и вставьте их в диалоговом окне. Убедитесь, что каждая последовательность имеет уникальный заголовок FASTA, затем нажмите кнопку Отправить в нижней части диалогового окна.
      Примечание: До 25 последовательности может рассматриваться одновременно. На странице Результатов поиска БЛАТ появится рядов каждого гида последовательности РНК, с каждой строки, представляющие выравнивание. В идеале должно быть одно выравнивание для каждого руководства РНК, показывающее уникальности этого руководства РНК.
    4. Избегайте гиды, которые присоединяются в несколько мест в геноме, если это возможно.
    5. Для изучения руководство РНК локализации и распространения в пределах региона интерес, нажмите на ссылку браузера в разделе действия для одного из запрашиваемых руководство РНК. Генома браузер появится и будет сосредоточена на выбранной руководство РНК. Используйте кнопки масштаба в верхней части страницы, для визуализации распределения других руководство РНК выявленных e Крисп в регионе интереса.
  7. Выберите 4 желательно non перекроя руководство РНК последовательности, которые распространяются во всем регионе интереса (рис. 2B). Если области интереса превышает 600 bp, рекомендуется добавить 1-2 дополнительные руководства. Избегайте руководство РНК с homopolymeric тянется и экстремальных GC содержание, как эти возможности могут препятствовать руководство РНК, процесс клонирования и уменьшить руководство РНК ориентации эффективности.
  8. После того, как были выбраны гиды, создайте файл, содержащий полное руководство РНК последовательности (23 нуклеотидов) для каждого нужного руководства и затем удалите нуклеотидов 5', а также PAM (НЭС) из 3' конца. Этот шаг облегчает oligo заказа.
  9. Добавить следующую последовательность к 5' концу последовательности олигонуклеотида: GTGGAAAGGACGAAACACCG.
  10. Добавьте следующую последовательность 3' конца последовательности олигонуклеотида: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
    Примечание: Конечной последовательности должны быть 59 нуклеотидов долго и посмотрите как это: GTGGAAAGGACGAAACACCG-цель (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
  11. Убедитесь, что каждый регуляторные элементы быть ориентированы с Enhancer-i имеет по крайней мере 4 уникальных олигонуклеотиды, предназначенные для него. Закажите эти последовательности вместе с «U6_internal» грунтовки, перечисленных в таблице 1.

3. Руководство РНК клонирования

Примечание: Руководство РНК клонирования через Ассамблеи Гибсон оказался весьма эффективным в наших руках, приносит сотни колоний на пластину, с несколько если любые колоний в только переносчиками. Такая эффективность имеет решающее значение для поддержания сложности во время клонирования пула. Еще одним преимуществом Гибсон Ассамблеи клонирования является, что пользователям не придется беспокоиться о присутствии энзима ограничения, вырезать сайт в руководстве РНК, они пытаются вставить в вектор клонирования U6. Тем не менее этот протокол может быть адаптирован для традиционных энзима ограничения на основе клонирования при желании.

  1. Воссоздания oligos руководство РНК в конечной концентрации 100 мкм в ультрачистая вода (РНКазы, DNase бесплатно). Там должно быть по крайней мере 4 отдельных руководство РНК oligos для каждого региона интерес.
  2. Для каждого регулирования региона интерес создайте пул всех oligos, соответствующий области интереса. В трубке Эппендорф объединить 5 мкл каждого индивидуального восстановленный руководство РНК oligo для каждого региона. Mix бассейна хорошо vortexing, а затем удалить 1 мкл и разбавляют этот аликвота 1: 200 в ультрачистая вода.
    Примечание: При желании эти бассейны ориентации отдельных областей регулирования могут быть далее объединены для создания комплекса бассейн на несколько областей. До 50 нормативных регионы могут быть направлены одновременно в единый пул (рис. 3 c).
  3. Выполните короткий ПЦР с праймерами U6 придавать гомологии регионов oligos до Гибсон Ассамблеи. Около 40 баз будет добавляться к каждому oligo, уступая ~ 100 bp продукт, который содержит достаточных гомологичностью к U6 вектора на обоих концах.
    1. Для каждого руководства РНК бассейн создан 20 мкл ПЦР с сочетанием высокой верности полимеразы Мастер и следующие компоненты: 1 мкл разбавленного oligo бассейна от шага 3.2, 1 мкл U6 вперед праймера (10 мкм), 1 мкл U6 обратный грунтовка (10 мкм) и воды до 20 мкл.
    2. Инкубировать в тепловая велосипедист с соблюдением следующих условий: 98 ° C за 30 сек, 10 циклов (98 ° C 10 s, 55 ° C за 30 s, 72 ° C на 2 мин), 72 ° C за 5 мин и провести на 4 ° C.
    3. Запуск 5 мкл реакции на 1-2% агарозном геле с низкой молекулярной массой лестницы. Конечный продукт должен быть ~ 100 basepairs (рис. 2 c).
    4. Очистить расширения реакции с набором на основе столбцов очистки ДНК и элюировать в 20 мкл буфера комплекта.
      Примечание: Как продукт короткий, Избегайте использования основанных на шарик чистой ups, которые призваны исключить небольшие фрагменты, менее чем в 100 bp.
    5. Количественно очищенная ДНК с помощью флуориметр или спектрофотометра (ожидается выход составляет 10-20 нг/мкл). Руководство РНК вставок может храниться при температуре-20 ° C, или может быть использован сразу в Ассамблее Гибсон с линеаризованного вектора U6.
  4. Чтобы подготовить получателей U6 клонирования вектор для Ассамблеи Гибсон, настройте дайджест энзима ограничения. Если многие реакции Гибсон Ассамблеи должны выполняться, установите несколько дайджесты для обеспечения достаточного урожая отрезока вектора.
    1. Используйте 20 единиц AflII фермента и 1 мкг плазмида в 20 мкл реакции с буфером соответствующего энзима ограничения. Инкубируйте при 37 ° C для 1-2 ч.
    2. Очистить дайджест с бисером или на основе столбцов комплект для очистки ДНК и элюировать в 20 мкл буфера. Количественно очищенная ДНК с помощью флуориметр или спектрофотометра. Образцы могут быть заморожены при-20 ° C для последующего использования.
  5. Гибсон Ассамблеи на подготовленный вектор и вставить.
    1. Настройка Гибсон Ассамблеи реакции на льду. Использование 50 ng вектора и 7 ng вставки в 20 мкл реакции. Разбавьте вставки 1:10 в ультрачистая вода для облегчения закупорить. Настройка реакции Ассамблеи только Гибсон вектор, с использованием 50 ng вектора и замена вставки с водой.
    2. Инкубировать Гибсон Ассамблеи реакций 15 мин при 50 ° C, а затем провести на 4 ° C.
    3. Передачи собранных продуктов на льду. Разбавьте собранных продуктов 1:4 в ультрачистая вода на льду. К примеру добавьте 5 мкл Гибсон Ассамблеи продукта 15 мкл ультрачистая вода.
  6. Преобразование разреженных Гибсон сборки продукции.
    1. Оттепель сведущие клетки высокой эффективности на льду и сделать 25 мкл аликвоты для каждого преобразования. Если комплекс бассейн на несколько сайтов, оттепель достаточное количество клеток в различных труб для выполнения нескольких независимых преобразований один и тот же комплекс gRNA пул.
    2. Для каждого разбавленного продукта добавьте 1 мкл этой разбавления до 1,7 мл Eppendorf трубка, содержащая 25 мкл компетентных клеток. Смешайте кратко стряхивая трубки. Инкубируйте трубы на льду за 30 мин.
    3. Тепловой шок клетки для 30 s при 42 ° C, затем немедленно передать в лед на 2 мин.
    4. Добавить 300 мкл SOC СМИ (Триптон 2%, 0,5% экстракт дрожжей, 10 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 10 мм MgCl глюкозы2, 10 мм MgSO4и 20 мм) и пусть клетки восстановить за 1 ч при 37 ° C при встряхивании (300 об/мин). В это время теплый плиты агара с ампициллин/carbenicillin до 37 ° C в инкубаторе. Используйте одну пластину для каждого преобразования.
    5. Пластина 50 мкл клеток и поместите пластины в инкубаторе 37 ° C на ночь. Для бассейнов, ориентации отдельных сайтов непосредственно в 3-5 мл LB отвара (Таблица материалов), содержащий ампициллина/carbenicillin (1 мг/мл) и инкубировать на ночь с встряхивания на 250 об/мин при 37 ° C для minipreps.
  7. Урожай клетки и изолировать ДНК.
    1. Для больших руководство РНК библиотеки, предназначенные для нескольких сайтов используйте скребок тарелку для сбора всех колоний от каждой индивидуальной пластины в один maxiprep (150 мл жидкого культура). Это может быть облегчено лить ~ 5 мл фунтов с соответствующего антибиотика в 50 мл трубки сокола и выскабливание колоний в трубу. Для библиотеки, предназначенные для отдельных сайтов Очистите пластины в алкалический (3-5 мл жидкого культура).
    2. Инкубируйте этих культур с соответствующим антибиотиком для 3-5 ч при 37 ° C с встряхивания на 250 об/мин.
    3. Выполните с помощью комплекта, что приводит к свободной эндотоксина парфюмерные экстракции ДНК.
    4. Количественно ДНК с помощью флуориметр или спектрофотометра. Плазмиды могут быть использованы непосредственно в трансфекции или температуре-20 ° C для использования в будущем.
  8. Чтобы подтвердить присутствие руководство РНК последовательности в рамках U6 вектор для небольших бассейнов ориентации одного сайтов, используйте Сэнгер секвенирования на подготовленный алкалический грунтом «U6_PCR_R» перечислены в таблице 1. За счет объединения руководство РНК, 19 basepair gRNA последовательности даст смешанных баз, но U6 промоутер и руководство РНК леса вокруг этой последовательности должны быть неповрежденными.

4. transfection Enhancer-i

Примечание: Для успешной блокады эстроген ответа с помощью Enhancer-i в клетках Исикава, необходимо лишить клетки эстроген для 5-7 дней до трансфекции, поддерживая их в фенола Красного бесплатно RPMI с 10% древесный уголь раздели FBS и 1% пенициллин/стрептомицина. Клетки должны быть культивировали в этой СМИ во время и после трансфекции, если пытаясь блокировать ответ эстрогена. Мы рекомендуем использовать бесплатные трипсина фенола Красного для прохода клеток в полной фенола Красного бесплатно RPMI.

  1. За день до трансфекции, плиты клетки (одичал тип или стабильно выражения SID4X-dCas9-KRAB) в 24-ну пластины на 30-50% confluency (~ 60 000 ячеек на колодец для клетки Исикава). Плиты достаточно клетки, что transfections может быть выполнена в двух экземплярах и включают скважин для transfected с руководством управления РНК.  Убедитесь, что ячейки равномерно распределяются между хорошо встряхнув нежно пластины после ячейки покрытия как шаг 1.1.7.
    Примечание: Этот протокол предполагает использование катионных на основе липосом трансфекции реагентов. Электропорация предоставляет альтернативный метод для типов клеток, которые очень чувствительны к эти реагенты. Трансфекция условия должны быть оптимизированы для линии клетки интереса перед Enhancer-i экспериментов.
  2. Следующий день, подготовьте transfections согласно инструкции реагента трансфекции выбора. Для клеток Исикава, использование 550 нг всего плазмиду для каждой скважины 24-ну плиты. Разбавьте плазмид в конечной концентрации 0,020 мкг/мкл в сыворотке свободных СМИ (1,1 мкг ДНК в 52 мкл общего объема для transfecting 2 скважин). Используйте 3 мкл Реагента трансфекции для каждого 1 мкг ДНК, вихрь и инкубировать как описано в шаге 1.2. Добавьте 25 мкл окончательный смеси в каждой скважине.
    Примечание: Для сочетания целевых сайтов, используйте тот же вес плазмиду для каждого отдельного узла, а затем заполнить оставшиеся вес с управления плазмида (пустой руководство РНК клонирования вектор или руководство РНК, таргетинг на отрицательный контроль регион как IL1RN Промоутер). Для переходных transfections используйте в соотношении 3:2 Cas9 фьюжн: руководство РНК плазмиды. Плазмиды, содержащие флуоресцентные Репортеры могут быть добавлены для мониторинга эффективности transfection.
  3. Изменить в 36 h пост трансфекции, средства массовой информации, с помощью фенола Красного бесплатно RPMI с 10% древесный уголь раздели FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (для ячеек Исикава) и поставок puromycin (конечная концентрация: 1 мкг/мл) и неомицин (конечная концентрация: 300 нг/мл). Если клетки чувствительны к трансфекции реагента, средства массовой информации могут быть изменены ранее, но антибиотики должны быть добавлены не ранее чем через 24 ч пост transfection.
    Примечание: Подождите по крайней мере 24 часа после добавления антибиотик до уборки клетки. Выражение изменения вследствие Enhancer-i могут быть обнаружены как рано, как 48 h пост transfection и до 5 дней после transfection. При работе с Исикава клетки, которые были лишены эстрогена, выполнения 8-h 10 Нм 17β-эстрадиола (Е2) индукции на следующий день после лечения антибиотиками и затем сразу же урожай клетки.

5. ячейка урожай и извлечение RNA

  1. Подготовьте литического буфера с 1% β-меркаптоэтанол (BME). Убедитесь, что смесь достаточно лизис BME (300 мкл для каждой хорошо собирают).
  2. Аспирационная СМИ, с помощью вакуум отсос.
  3. Вымыть клетки один раз с равным объемом 1 x PBS (500 мкл) и аспирата удалить столько PBS как можно скорее.
  4. Добавьте 300 мкл раствора лизис BME каждой скважины с использованием многоканальные пипетки. Пипетка лизис решение вверх и вниз 8 - 10 раз и перевод на глубокой скважины пластины или 1,7 мл Eppendorf трубки на льду. РНК могут быть получены сразу, или лизатов могут быть заморожены на-80 ° C для последующей обработки.
  5. Чтобы извлечь РНК из лизатов, использование коммерчески доступных комплект, который включает в себя DNase лечения. Элюировать минимальный рекомендуемый объем ультрачистая вода (РНКазы, DNase бесплатно) или Элюирующий буфер и количественного определения РНК. Для небольшого числа образцов используйте флуориметр или спектрофотометра. Для большого количества образцов используйте флуоресцентный зонд, который обнаруживает РНК и меру на тарелку читателя. Образцы могут быть заморожены при температуре-80 ° C, до или после количественной оценки.

6. Количественная оценка изменения выражения гена с помощью одношагового ПЦР и РНК seq

  1. Получите ПЦР Праймеры для генов интерес и для уборки по крайней мере один ген, который выражается возле уровня целевых генов и не меняется в экспериментальных условиях. В идеале эти грунты охватит Экзон экзона Джанкшен, чтобы избежать амплификацию геномных ДНК.
    1. Проверьте эти грунты на РНК, полученных от линии клетки интереса. Использование расплава анализа кривой для проверки производства одного продукта. Если один продукт не производится, тест дополнительным букварь пар.
  2. Для каждого Enhancer-i и управления руководство РНК лечение образца определите, сколько гены должны быть assayed в этом образце. Этот набор генов должны включать уборки генов, например CTCF или GAPDH.
  3. Настройка реакции ПЦР.
    1. Разбавить все образцы же концентрации в воде, что 50 нг всего РНК легко накапаны и есть достаточно разбавленный РНК для каждой реакции. Например разбавляют РНК до ~16.6 нг/мкл и использовать 3 мкл РНК в каждой реакции. Держите РНК на льду при настройке мастер смеси.
    2. Подготовьте отдельный мастер смеси для каждого гена измеряется с помощью коммерчески доступных одношаговый ПЦР комплекты. Используйте 20 мкл реакции тома с 1 мкл каждого праймера (10 μM раствор). Настройка этих реакций на льду.
    3. В реакции пластина, которая подходит для тепловая велосипедист добавьте образцы РНК, после чего мастер смеси. Печать с sealer пластины и смешайте нежно vortexing или закупорить. Кратко центрифуга пластину (140 x g 60 s) для обеспечения что жидкость находится в нижней части скважины.
    4. Инкубировать пластины в тепловой циклователь следующим образом (или как комплект инструктирует): 48 ° C за 30 мин., 95 ° C в течение 10 мин, 40 циклов (95 ° C в течение 15 сек, 60 ° C в течение 1 мин).
  4. Получение значения Ct для каждого гена, измеренных в пределах каждого образца. Используйте метод сравнительного Ct для определения изменения в экспрессии генов.
    1. Вычтите Ct уборки гена от Ct каждого гена интереса для каждого образца для создания нормализованных значений Ct.
    2. Для управления рассматриваются образцы длится в среднем нормализованных значений Ct для каждого гена. Журнал базы 2-масштаба раза репрессий вычисляется путем вычитания нормализованных Enhancer-i рассматривается пример Ct для каждого гена от то же значение для управления рассматривается пример для соответствующего гена.
  5. Чтобы определить глобальные изменения в экспрессии генов, после лечения Enhancer-i, подготовьте образцы для последовательности РНК, использование коммерчески доступных комплект совместим с технологией виртуализации пользователя. Использование ~ 500 нг РНК для исходного материала и подготовиться по крайней мере 2 биологических реплицирует библиотек.

7. Проверка конкретных геномной таргетинг по SID4X-dCas9-краб с помощью чип seq

Примечание: SID4X-dCas9-KRAB синтез белка содержит тег epitope флаг и тег epitope HA, но лучшие результаты для чип seq были получены с антителами против флага. При желании пользователь может выполнять дополнительные эксперименты чип seq для транскрипционных факторов, потенциально затронутых Enhancer-i, или H3K27ac, Марк деятельности усилитель, который снизился на Enhancer-i. Однако каждый чип seq эксперимент требует 10 х 106 клеток, так план соответственно.

  1. Transfect клетки с Enhancer-i бассейнов.
    1. Пластина 10 х 106 клеток в культуре ткани блюдо 15 см. Каждое блюдо представляет 1 чип seq эксперимент 1 фактор интереса.
    2. Следующий день, transfect клетки, с помощью 20 мкг ДНК всего за блюдо. Для transfections в клеточных линий, стабильно выражения SID4X-dCas9-краб ДНК должны быть плазмида пул руководство РНК, ориентация всех сайтов, представляющих интерес и, при необходимости, плазмиды, выражая флуоресцентный белок. Для переходных transfections используйте в соотношении 3:2 dCas9 синтеза белка: руководство РНК бассейн. Для чип seq других TFs или изменения гистона выполните по крайней мере один дополнительный контроль руководство РНК трансфекции на другое блюдо.
    3. Лечить блюда с puromycin (1 мкг/мл) и неомицин (300 нг/мл) на пост трансфекции 24-48 ч. Подождите по крайней мере 24 часа до уборки хроматина.
  2. Урожай хроматина от блюд.
    Примечание: Для изучения последствий Enhancer-i ER геномной привязки в клетках Исикава, выполнить лечение 1 ч 10 Нм E2 на блюда transfected с управления руководство РНК и Enhancer-i до урожая. Для изучения воздействия Enhancer-i на H3K27ac, выполнить 8 h 10 Нм E2 индукции на блюда transfected с управления руководство РНК и Enhancer-i до урожая.
    1. Применить 500 мкл 37% формальдегида, к каждому блюду (конечная концентрация 1%). Вихрем пластины кратко. Дайте постоять 10 мин при комнатной температуре пластины.
    2. Добавьте 1 мл 2,5 М глицин (конечная концентрация 125 мм). Вихрем пластины кратко.
    3. Слить СМИ с формальдегидом и глицина. Добавление равным объемом (~ 20 мл) холодной ПБС.
    4. Слить PBS. Аспирационная с вакуумным аспиратором удалить столько PBS как можно скорее. Место блюда на льду.
    5. Добавить 3-5 мл холодного 1 x PBS или Фарнхам литического буфера (5 мм трубы рН 8,0, 85 мм KCl, 0,5% NP-40) с 1 x ингибитор протеазы (добавлены непосредственно перед использованием) для каждой пластины. Скрип блюдо с скребок пластины и передать решение 15 мл Конические трубки на льду.
    6. Пелле хроматина, спиннинг вниз трубы в центрифуге для 5 мин при 4 ° C, в 1000 x g. отменить супернатант и хранить окатышей на-80 ° C для использования в будущем или продолжить с чип seq протокол выбора с использованием антител против флага или антител против других факторы транскрипции или изменения гистона интерес (H3K27ac, H3K9me3).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показана схема рабочего процесса, описанного в протоколе. Чтобы определить, что вклад ER-прыгните усилители вблизи эстроген регулируемых гена MMP17, который имеет 3 сайтов связывания поблизости как определяется чип seq (рисунок 2A), руководство РНК были разработаны для каждого региона. Дизайн руководство РНК, 600-900 bp окно последовательности, окружающих каждый ER сайт связывания интерес был выбран и введен в программу дизайн руководство РНК. В результате руководство РНК последовательности с 0-2 предсказал от цели, которую сайты были выровняны к генома человека с помощью БЛАТ. Четыре non перекроя руководство РНК, которые охватили регион определяется чип seq и Гиперчувствительность DNaseI были выбраны для ориентации (рис. 2B). Дополнительные последовательности (Таблица 1) был добавлен в каждом конце для облегчения течению клонирование и в результате 59 нуклеотидов фрагменты были заказаны. По прибытии руководство РНК были разведен и пуле сайта, и короткие ПЦР была выполнена для добавления гомологии регионов до Гибсон Ассамблеи. Рисунок 2 c показывает ожидаемое руководство РНК продукт после короткого PCR используя праймеры «U6_internal» (Таблица 1), которые будут добавлять к каждому концу 59 basepair 20 basepairs последовательности руководство фрагмент РНК, что приводит к basepair ~ 100 последовательности. После Ассамблеи Гибсон эти руководства РНК бассейны были преобразованы в бактерии и плазмида minipreps был подготовлен следующий день. 2D рисунок показывает результаты от усилитель рассечение эксперимент, где несколько усилителей поблизости MMP17 предназначены только и в сочетании с использованием Enhancer-i. Сайты, мишенью Enhancer-i указаны с черным шестиугольника. Руководство РНК плазмид, ориентация на указанные сайты были transfected в эстроген лишен Исикава клеточной линии стабильно выражения SID4X-dCas9-краб. Два дня спустя, средства массовой информации было изменено и puromycin был добавлен для обогащения для transfected клеток. Следующий день, клетки были собраны после 8 h 10 Нм эстрадиола лечения. РНК был изолирован, и одношаговые ПЦР была выполнена. В этом примере сайтов 1 и 2 являются необходимыми для полного эстрогенных ответ MMP17, в то время как сайт 3 не содействовать в этих условиях (Рисунок 2D, полосы ii-iv). Когда активны только сайты, 2 или 3 (vi и vii), эстроген ответ похож на когда сайты не являются активные (viii), предполагая, что эти сайты не могут способствовать независимо друг от друга. Сайт 1 может внести некоторое выражение само по себе (v), но наибольшую активность наблюдается, когда сайтов 1 и 2 являются активными (iv).

Манипулировать 10 улушителей вблизи 4 различных генов одновременно (рис. 3A), комплекс бассейнов руководство РНК были созданы, содержащий 42 усилитель гидов и 16 промоутер гидов. Руководство РНК oligos были объединены до первоначального руководство РНК расширение ПЦР (шаг 3.3), и результирующий продукты PCR были очищенный и в сочетании с пустым puromycin U6 клонирования вектор с использованием Гибсон Ассамблеи. После Ассамблеи Гибсон несколько независимых преобразования были выполнены и покрытием. Пластины были царапины в LB и позволено расти 2-4 ч до maxiprep. Рисунок 3B показывает представитель сокращений в экспрессии генов, ПЦР, когда эти руководство РНК бассейны были transfected в эстроген лишен Исикава клеточной линии стабильно выражения SID4X-dCas9-Краб и рассматриваются как описано выше (Рисунок 2D). Сокращение от Enhancer-i аналогичны получены путем ориентации промоутер предполагаемого целевой гена. Рисунок 3 c показывает эффект разбавления руководство РНК на снижение эстрогена ответа с помощью Enhancer-i. 1:50, разбавления руководство РНК пула ориентация усилитель вблизи G0S2 все еще дает значительное снижение экспрессии генов, предполагая, что Enhancer-i может использоваться для цели до 50 сайтов одновременно. Однако Деактивация может быть разбавлен, указав, что сотни сайтов не может быть ориентировано одновременно, если более чувствительных методов обнаружения.

figure-results-1
Рисунок 1. Протокол схемы мультиплекс усилитель рассечение, используя Enhancer-i. Руководство РНК (красный и синий) разработаны с использованием е хрустящий и выбранные с помощью браузера геноме UCSC. 4 руководство РНК выбраны, которые охватывают регионы интереса (транскрипционным фактором сайтов связывания как определяется чип seq). Руководство РНК олигонуклеотиды, которые объединили в регионе интереса (красный и синий) проходят ПЦР для добавления гомологии регионов (оранжевый) перед Ассамблеей Гибсон и трансформации. Результате плазмида бассейны являются transfected через липофекция в клеточных линий, стабильно выражения SID4X-dCas9-Краб или одичал тип клеток в сочетании с SID4X-dCas9-KRAB плазмиды. Руководство РНК плазмида бассейны можно transfected индивидуально для одного сайта на время, или в сочетании для нескольких сайтов одновременно. Transfected клеток лечатся антибиотиками для обогащения для ячеек, содержащих руководство РНК. На ~ 72 h пост трансфекции собирают клетки. Нуклеиновые кислоты могут быть извлечены для ПЦР, РНК seq или чип след пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Руководство дизайн и усилитель рассечение РНК для MMP17. (A) генома браузер скриншот ER альфа прыгните усилители (серый) направлены возле MMP17. Эта цифра была изменена от Карлтон, и др. 18. Руководство РНК (B) конструкций для привязки сайтов183. Привязки сайта для ER как определяется чип seq является целевой и 4 руководство РНК плитка через этот регион. DNaseI чувствительность сигнала, который охватывает привязки сайта, также может использоваться для определения последовательности целевых объектов для руководства РНК дизайн. Чип seq и DNaseI HS данные были получены из Исикава клетках, обработанных с 10 Нм эстрадиола на 1 ч. (C) представитель руководство РНК последовательности, которые готовы для Ассамблеи Гибсон, пройдя короткое ПЦР для добавления гомологии регионов. (D) измеряется относительное выражение MMP17 через ПЦР после ориентации отдельных регионов с Enhancer я и 8-h10 Нм эстрадиола лечения. Выражение является относительно CTCF и выражение уровня MMP17 в клетках, не получавших эстрадиола. Руководство управления RNAs целевой промоутер IL1RN. Все планки погрешностей представляют SEM, двойной звездочки показывают p < 0,01 и одной звездочки показывают p < 0,05 в паре t теста. Эта цифра была изменена от Карлтон, и др. 18. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Ориентация несколько усилителей вблизи различных генов одновременно с пул Enhancer-i. (A) схема привязки сайтов и промоутеров направлены в пуле Enhancer-i. (B) влияние на выражение как измеряется ПЦР после лечения E2 на клетки Исикава transfected с Enhancer-i плазмида бассейн (зеленый), промоутер i плазмида бассейн (синий) или управления оформления (белый)18. Значительное сокращение на всех генов наблюдается с Enhancer-i. Эта цифра была изменена от Карлтон, и др. 18. (C) transfected воздействие на уровни выражения G0S2 после лечения E2 на Исикава клетки с различными объемами руководство РНК, ориентации G0S2. Значительное сокращение можно увидеть даже с небольшим количеством руководство РНК (1:50 разрежения), о том, что до 50 сайтов могут одновременно объектом. Все планки погрешностей представляют SEM, двойной звездочки показывают p < 0,01 и одной звездочки показывают p < 0,05 в паре t теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

ИмяПоследовательность
U6_internal_FTTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_RGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_FCCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_RAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_FGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_RAAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_FGTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_RAGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_FAGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_RCGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_FCAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_RTCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

Таблица 1. Праймеры для расширения руководство РНК и последовательности, ПЦР и обнаружения синтез белка.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает простой и гибкий метод для рассечения функция усилитель на эндогенный Локус геномной без физически изменения последовательности ДНК. Хотя схожая по концепции с ранее опубликованные протоколы вмешательства ТРИФОСФАТЫ, используя dCas9-KRAB27, Enhancer-i отличается от этих протоколов в 3 основных направлениях. Во-первых Enhancer-i использует взаимодействующих домен SIN3A MAD120 для достижения усилитель деактивации. Деактивация усилитель могут быть спасены с помощью ингибиторы ГДАЦ, о том, что основным механизмом деактивации HDAC зависимых. В отличие от ТРИФОСФАТЫ вмешательства с dCas9-краб Enhancer-i не приводить к осаждения H3K9me3. Это, вероятно, связано с тем, что Enhancer-i опирается на переходных внедрения руководства должность РНК, с клетками, собирают на 3 дня transfection. В ТРИФОСФАТЫ вмешательства наблюдается рост в H3K9me3 в 7 дней поста трансдукции12. Наконец протокол Enhancer-i обеспечивает стратегию несколько сайтов одновременно и контролировать эффективность таргетинга. Мозаика seq17dCas9-KRAB используется для нескольких усилителей одновременно, но этот метод опирается на одну ячейку РНК последовательности для определения изменения выражения, в многих генов (например, эстроген отзывчивым генов) незамеченными из-за низкой чувствительность одноклеточных РНК след Enhancer-i обеспечивает надежный метод для изучения усилители, индивидуально или в комбинации для любого гена.

Наиболее важным этапом Enhancer-i является трансфекции, которые должны быть оптимизированы для линии клетки интереса. Этот протокол основывается на puromycin лечение, чтобы обогатить transfected клеток, но вполне возможно, что совместно transfecting руководство РНК с флуоресцентный белок и сортировка для флуоресцентных клеток с помощью проточной цитометрии может оказаться лучше метод обогащения для некоторых клеток типы. Мы рекомендуем, мониторинг уровня экспрессии руководство РНК и SID4x-dCas9-KRAB путем ПЦР для подтверждения transfection и устранения неполадок. Если руководство РНК уровни являются низкими (цикл порог > 30), пользователи могут также рассмотреть альтернативные руководство стратегии производства РНК как в vitro транскрипция28. Это также возможно, что несмотря на высокий gRNA, руководство РНК ориентации белка SID4x-dCas9-краб является неэффективным, в этом случае выбор различных руководство РНК последовательности могут быть необходимы. Выполняя чип seq на синтез белка с хроматина от Enhancer-i рассматриваются клеток, можно контролировать эффективность таргетинга. Если есть высокий сигнал SID4x-dCas9-KRAB в регионе интереса, и обнаруживаются изменения не выражение в его предполагаемых целевых генов, то скорее всего региона не способствуют выражение этого гена в условиях учился.

Одним из потенциальных ограничений Enhancer-i является что мимо эффекты могут накапливаться, если слишком много сайтов ориентированы одновременно. Тем не менее ТРИФОСФАТЫ стратегии вмешательства на нокдаун имеют меньше с цели эффекты, чем RNAi29, особенно когда используется поликлональных клеточная линия, выражая dCas9-краб. Хотя мы видели пробить геномной привязки SID4X-dCas9-краб, при таргетинге 10 сайтов одновременно, мы не выявили изменения выражения гена в результате этих событий привязки. Как некоторые усилители могут связаться несколько промоутеров и/или другие усилители, вполне возможно, что многие гены могут изменить выражение после нападения на один усилитель, хотя неясно, если эта форма регуляции генов является общим. Чтобы убедиться, что изменения выражения наблюдается из-за ориентации конкретных усилитель и не пробить эффекты, пользователи могут выполнять Enhancer-i с двух отдельных наборов non перекроя руководство РНК, ориентации того же региона. Кроме того генетические удаление в регионе с использованием нуклеиназы компетентных Cas9 далее может подтвердить его влияние на экспрессию генов.

Как функции Enhancer-i через диацетилморфина гистонов вполне возможно, что его деактивации возможности ограничены для усилителей, которые имеют ощутимый уровень ацетилирование гистонов. Существует целый ряд альтернативных репрессивных слияния, которые могут быть более эффективными в плане ориентации на конкретные усилители. ДНК метилтрансфераза сплавливания до dCas9 может использоваться для уменьшения экспрессии генов, когда направлены на дистальном усилители30, но репрессии часто не является временным. Еще один репрессивный фьюжн использует домен друг GATA1 (FOG1), что приводит к гистонов H3 лизин 27 trimethylation и подавляет экспрессии генов на уровнях, аналогичных dCas9-краб в различных клеток линии и промоутеров31. Интересно, что добавление больше копий FOG1 dCas9 сократить репрессивных потенциал на промоутеров, предполагая, что одна копия SID домена может обеспечить более усилитель деактивации чем 4 копии, в настоящее время используется в Enhancer-i. Вполне возможно, что некоторые локусов могут пользоваться двойной ориентации различные комбинации выше dCas9 сплавливания. К примеру стабильные долгосрочные репрессий достигается за счет одновременного трансдукции dCas9-DNMT3a и dCas9-KRAB32. Большинство этих репрессивных сплавливаний только мишенью в одном локусе одновременно, и остается неясным, какой является наиболее эффективным в манипуляции нескольких усилителей одновременно.

Enhancer-i, при этом соответствующий метод для изучения комбинации усилители для горстки генов, еще несколько ограничены в пропускной способности, если пользователь желает изучить предполагаемый расширители для сотен генов. Будущего применения этой техники будет включать технологии на основе изображений для количественного определения нескольких генов в нескольких образцов одновременно. Важно отметить, что эти технологии совместимы с прямым детектированием молекул РНК от lysate, устраняя необходимость в длительной изоляции РНК. Эти приспособления будут способствовать допроса больших наборов усилители.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH/NHGRI R00 HG006922 и NIH/NHGRI R01 HG008974 для ю.г. и охотник институт рака. J.B.C. была поддержана NIH учебной программы в генетике T32GM007464.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ZR 96-well Quick-RNA KitZymo ResearchR1053
Power SYBR Зеленая РНК-to-CT 1-ступенчатаяприкладная биосистема4389986
фермент рестрикции AflIINEBR0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix с HF буферомNEBM0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621L
FuGENE HDPromegaE2312
DNA Clean & Концентратор НаборZymo ResearchD4013
Buffer RLT PlusQiagen1053393
b-эстрадиолSigma-AldrichE2758
Человек: клетки ИсикавыECACC99040201
H3K27ac кролик поликлональныйактивный мотив 39133
H3K9me3 кролик поликлональныйAbcam ab8898
ФЛАГ мышь моноклональнаяSigma-Aldrich F1804
ER альфа кролик поликлональныйСанта Крузsc-544
pGL3-U6-PGK-Puro плазмидаAddgene 51133Shen et al., 2014
gRNA_cloningVector плазмидаAddgene 41824Mali et al., 2013
AflII U6 пуромициновая плазмидаAddgene 106404Carleton et al., 2017
SID4X-dCas9-KRAB плазмидаAddgene 106399Carleton et al., 2017
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM6250-10ML
UltraPure DNase/RNase-Free Diстиллированная водаThermoFisher Scientific10977-023
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, с шариками захвата мРНК KAPAKapa BiosytemsKK8420
Мини-таблетки ингибитора протеазы и фосфатазыThermoFisher ScientificA32959
Раствор формальдегидаSigma-Aldrich252549-25ML
Селективный антибиотик Geneticin (G418 Sulfate) (50 мг/мл)ThermoFisher Scientific10131035
LB БульонThermoFisher Scientific10855001
Quick-DNA Miniprep Kit D3020
Быстрозарядная фиолетовая лестница для ДНК с 2 бревнамиNEBN0050S
Research

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).">Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).">Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  3. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).">Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  4. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).">Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).
  5. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).">Lam, D. D., et al. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).
  6. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).">Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  7. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).">Savic, D., et al. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).
  8. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).">Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).">Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  10. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).">Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).
  11. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).">Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  12. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).">Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  13. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).">Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).
  14. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).">Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  15. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).">Fulco, C. P., et al. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).
  16. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).">Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  17. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).">Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).
  18. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).">Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).
  19. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).">Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  20. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).">Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).
  21. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).">Alland, L., et al. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).
  22. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).">Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  23. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).">Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).
  24. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).">Stampfel, G., et al. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).
  25. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).">Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  26. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).">Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  27. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).">Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).
  28. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).">Romanienko, P. J., et al. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).
  29. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).">Smith, I., et al. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).
  30. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).">Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  31. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).">O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  32. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).">Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR InterferenceEnhancer FunctionGuide RNA DesignMultiplex Enhancer InterferenceTransient TransfectionGene Regulation AnalysisdCas9 RepressionEnhancer DeactivationTissue Culture SettingsGenomic Targeting

Related Articles