Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Трехмерный (3D)-напечатан шаблон для высокой пропускной способности Zebrafish эмбриона одевающ

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57892

⸱

1 июня 2018 г.

 ,  , 
1College of Environmental Science and Engineering, State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, Tongji University, 2UNEP-Tongji Institute of Environment for Sustainable Development, Tongji University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для проектирования и изготовления zebrafish эмбриона, одевающ шаблон, следуют подробные процедуры на использование такой шаблон для высокой пропускной способности zebrafish эмбриона одевающ в 96-луночных плиту.

Аннотация

Данио рерио является глобально признанных пресной воды организм часто используются в биологии развития, экологической токсикологии и болезней человека соответствующих исследований. Благодаря его уникальными особенностями, включая большие плодовитость, прозрачность эмбрионов, быстрое и одновременное развитие, и т.д.данио рерио эмбрионы часто используются для больших масштабах оценки токсичности химических веществ и наркотиков/соединение скрининга. Типичная скрининг процедура включает нереста взрослых рыбок данио, отбор эмбрионов и одевающ эмбрионов в несколько хорошо пластины. От там эмбрионы подвергаются воздействия и токсичности химических, или эффективность препаратов/соединений может оцениваться относительно быстро основаны на фенотипическую наблюдений. Среди этих процессов одевающ эмбрионов является одним из самых длительных и трудоемких шагов, которые ограничивает уровень пропускной способности. В этом протоколе мы представляем новаторский подход, который делает использование шаблона выстраивающихся 3D-печать Наряду с вакуумной манипуляции, чтобы ускорить этот трудоемкий этап. Протокол в настоящем документе описывается общий дизайн выстраивающихся шаблон, подробный экспериментальной установки и шаг за шагом процедуры, после чего представитель результаты. При реализации, этот подход должен оказаться полезным в различных исследовательских приложений с помощью zebrafish эмбриона как тестирование субъектов.

Введение

Как организм популярная модель данио рерио широко используется в области медицины и токсикологии1,2,3,4. По сравнению с платформами в пробирке , данио рерио предлагают гораздо большей биологической сложности, что один или два типа клеток не может предложить. Помимо того, что весь организм, модель, данио рерио большая плодовитость, быстрых и одновременных эмбрионального развития и высокий орган полупрозрачность дали уникальные преимущества этой модели использоваться для больших масштабах токсичности или наркотиков/соединение скрининг5. Сотни зародышей одна пара взрослых рыбок данио каждую неделю превосходят любой другой весь Животные модели и сделали это подходит для высокой пропускной способности скрининга.

Типичная скрининг процедура, с помощью данио рерио включает в себя значительное количество ручной работы, такие как взрослых рыбок данио нереста, отбор эмбрионов и одевающ эмбрионов в соответствующих емкостях, где они подвергаются воздействию путем погружения в воду. Мониторинг развития эмбрионов и наблюдаемых конечные точки как смертность, выводимости и аномалий часто оцениваются вручную и используется в качестве предварительных опознавательные токсичность химических веществ или признаки эффективности наркотиков или соединений. Чтобы ускорить процедуру проверки, были изучены ранее подходов, таких как автоматическое создание образов и анализа компьютерных изображений. К примеру Микроскопы с высоким содержанием изображений возможности были адаптированы для выполнения автоматизированных ярко поле или флуоресценции изображений на zebrafish эмбриона на различных этапах своего развития от 96/384 хорошо пластины6. Microfluidic приборы, в сочетании с Микроскопы были использованы для позиции данио рерио личинок через текущую манипуляцию нейронов мозга7для воображения. Эти подходы могли бы значительно повысить эффективность поглощения изображения по сравнению с традиционной ручной работы. Кроме того с большим количеством изображений создаются, инструменты анализа изображений также были разработаны для ускорения обработки данных, как это продемонстрировано Лю et al. и ту et al. 8 , 9.

Как уровень пропускной способности анализа изображений и изображения увеличивается, стало ясно, что тариф ограничивая шаг для отбора лежит в процессе подготовки zebrafish эмбриона для экспозиции, который обычно означает, одевающ их в 96 - или 384-ну пластины. Чтобы решить это узкое место, видение руководствуясь робототехника были разработаны Мандрелл et al. 10 и нас11 ранее, чтобы заменить ручной обработки, но инструменты были довольно сложные и есть глубокий кривой обучения для осуществления таких методов. Таким образом чтобы обеспечить легкий к употребление подход становится одним из важных факторов для дальнейшего улучшения уровень пропускной способности данио рерио скрининга и является главной целью этой работы.

В этой работе мы разработаны и изготовлены эмбриона, одевающ шаблон 3D печати. Такой шаблон выстраивающихся был разработан чтобы завлечь zebrafish эмбриона в скважины, которые подходят с стандартных 96-луночных пластины. Вместо выбора эмбрионов и одевающ их в отдельные хорошо один за другим, один может выполнить эмбриона изобличения и массив все 96 эмбрионов в многослойные пластины одновременно. Используя этот шаблон и следующий протокол, одно может значительно повысить эффективность одевающ эмбрионов в многослойные пластины, которые бы в срок увеличить потенциал скрининга по крайней мере в десять раз, по сравнению с ручной работы. Протокол, в описанный ниже включает в себя общий дизайн для одевающ шаблон, данио рерио нереста, коллекции эмбриона и одевающ. Рисунок 1 показывает общий дизайн выстраивающихся шаблона. Рисунок 2 показывает обзор протокола пошаговую инструкцию по использованию шаблона, описанные в частях 3 и 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Проектирование и изготовление Zebrafish эмбриона одевающ шаблон

  1. Дизайн выстраивающихся шаблон с 12 на 8, 96-луночных макет, который подходит для стандартных 96-луночных пластины. Использование измерения, перечисленных на рисунке 1A для камеры захвата верхней эмбриона (см. также дополнительный файл).
    1. Используйте измерения, показано на рисунке 1B и 1 D для захвата хорошо.
    2. Использование измерения в Рисунок 1 c для нижней вакуумной камеры.
    3. Использовать измерения, на рисунке 1B для воздуха в / выход.
  2. Использовать 3D-принтер (с точностью до 0,1 мм) для печати шаблона; Смотрите Таблицу материалов для рекомендованных смолы использоваться для печати.
    Примечание: 3D принтеры с точностью 0,1 мм, рекомендуется для изготовления выстраивающихся шаблона (см. Таблицу материалы). Предлагаемые цвета для поверхности шаблона — темно-серый или черный.

2. Zebrafish эмбриона нереста

  1. Место две пары мужчин и женщин рыбы в спаривания поле за один день до нереста. Отдельные мужчины и женщины, ясно пластиковый делитель.
  2. Взлет разделители утром смесь рыбы мужского и женского пола.
  3. Удаление рыбы мужского и женского пола и собирать zebrafish эмбриона с помощью мелкоячеистое сито. Мыть эмбрионов с яйцо 250 мл воды (см. Таблицу материалы).
  4. Передавать собранные эмбрионов Петри (90 мм в диаметре) с Holtfreter на решение (см. Таблицу материалы) и удаление мертвых и неоплодотворенных эмбрионов, с помощью стереомикроскопом.
  5. Место эмбрионы в инкубаторе 28,5 ° C. В 4 ч оплодотворение (hpf), наблюдать эмбрионы и удалите любые мертвых и нездоровой эмбрионов. Эмбрионы теперь готовы к следующему шагу.

3. Подготовка одевающ шаблон

  1. Вымойте шаблон 2 – 3 раза с 500 мл деионизированной водой и положить его в сушильной печи (45 ° C) 5 мин.
  2. Лента в нижней камере с куском уплотняющей пленки (Рисунок 2Шаг 1).
  3. Подключение вакуумного насоса через выход воздуха в нижней части шаблона.
    Примечание: Рекомендуемая макс вакуум для вакуумного насоса является 0,1 МПа. Следует помнить о силе вакуума используется. Если отрицательное давление будет слишком сильным, вырежьте крестообразное отверстие на уплотнение фильм для снижения давления.

4. одевающ Zebrafish эмбриона в плиту 96-луночных

  1. Использование пипетки пластиковые передачи, место приблизительно 150 эмбрионов в шаблон, как показано в рисунке 2, шаг 2.
  2. Подсоедините вакуумный насос для выпуска воздуха и используется для создания отрицательного давления в камере, герметичные уплотнения фильм на шаге 3.3.
  3. Встряхните весь шаблон по горизонтали до тех пор, пока каждый хорошо имеет одного эмбриона захваченного (рис. 2, шаг 3).
    Примечание: Если Holtfreter раствор высыхает, прежде чем эмбрионы оказались в ловушке в каждой скважине, добавить дополнительные Holtfreter решение в камере изобличения и повторите этот шаг.
  4. Отменить решение дополнительных Holtfreter и эмбрионов, которые не попадают в скважинах (рис. 2, шаг 4).
  5. Выключите и отсоедините вакуумного насоса.
  6. Переверните стандартных 96-луночных пластины против шаблон (рис. 2, шаг 5) и поверните оба в то же время (рис. 2, шаг 6).
  7. Нажмите в нижней части шаблона или подключить воздух розетки для сжатого газа пыли может передать всех захваченных эмбрионов из шаблона 96-луночных пластины (рис. 2, шаг 6).
  8. Повторите шаг 4.1 до 4,8 подготовить дополнительные несколькими хорошо пластины.
  9. Снимите уплотнение пленку и вымыть шаблон 3 раза сверху вниз с 500 мл деионизированной воды для использования в будущем.
    Примечание: Не используйте любые органические растворители, как этанол, чтобы очистить шаблон.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 3 показывает типичный шаблон выстраивающихся 3D-печати. Этот шаблон использует фоточувствительный смолы в качестве сырья и был сделан на 3D принтере; слой черной краской был применен для обеспечения лучшей контрастности цвета эмбрионов. Положение 96 скважин (12, 8) был разработан для стандартных 96-луночных плитой. Аналогичным образом шаблон хорошо 384 (24 х 16) также могут быть разработаны и изготовлены с использованием того же метода. Положительная ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Есть два критических шагов в настоящем Протоколе, которые требуют пристального внимания для успешной реализации 3D-печати шаблон для одевающ zebrafish эмбриона.

Наиболее важным фактором в разработке выстраивающихся шаблон является хорошо захвата. Делает уверен Есть только один эмбрион, захваченных в каждой скважине, следует обратить пристальное внимание на диаметр и глубина скважины захвата и диаметр через отверстия. Рекомендуемый диаметр находится в 1,5-2 раза диаметра типичной эмбриона (вклю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы были заполнены патент на шаблоне описано 3D-печати.

Благодарности

Эта работа была поддержана программа «1000plan молодежи», запуска средства от Университета Тунцзи и NSFC Грант # 21607115 и 21777116 (Лин).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Завод по производству рыбок данио-рериов Шанхае Haisheng Biotech Co., Ltd.Z-A-S5
Сопрягаемый ящикShanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Бутылка для мытья, 500 млSangon BiotechF505001-0001
Хлорид натрияVetecV900058-500G
Хлорид калияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016318
хлорид кальцияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
бикарбонат натрия Vetecv900182-500G
Гидрат метилена синего TCIM0501
Соляная кислотаSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011008
Морские солибыстрого приготовления ОкеанSS15-10
ПипеттерFisherbrand13-675M
Контролируемая капля Пастер Пипетка Fisherbrand13-678-30
МикроскопOLYMPUSSZ61
Биохимический инкубаторShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.LRH-250
3D-принтерUnionTechLite600
Светочувствительная смолаUnionTechUTR9000
Вакуумный насосShanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.SHB-IIIA
Адгезивная ПЦР-пластина УплотнителиSolarbioYA0245
96-луночная пластинаCostar3599
Мульти 8-канальный пипетка 30 - 300 μ lEppendorf3122000.051
Пылесборник сжатого газаShanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.ST1005
DI ВодянаяThermo GenPure Pro UV/UF
ShanghaiYiheng Scientific Instrument Co., Ltd.Система BPG-9106A
Водаиз объекта s водная система
Яичная водаразбавленная 60 мг " Мгновенный океан» морская соль и 0,25 мг/л метиленового синего в 1 л DI воды
Holtfreter' Растворите7,0 г хлорида натрия (NaCl), 0,4 г бикарбоната натрия (NaHCO3), 0,1 г хлорида калия (KCl), 0,235 г хлорида кальция (CaCl22H2O) в 1,9 л воды DI. Отрегулируйте pH до 7 с помощью HCl и отрегулируйте объем до 2 л с помощью Di water
сушильная печь

Ссылки

  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
  3. Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
  4. Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
  5. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
  6. Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
  7. Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  8. Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
  9. Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).
  10. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  11. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Шаблоннапечатанный на 3D-принтеревысокопроизятельный скринингвакуумное манипулированиеполучение эмбрионовотбор эмбрионов96-луночный планшетзахват эмбрионовперенос эмбрионовстерилизация шаблона
Трехмерный (3D)-напечатан шаблон для высокой пропускной способности Zebrafish эмбриона одевающ
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.