Методическая статья

Контраст соответствия моющего средства в малых угол нейтронного рассеяния экспериментов мембраной протеина структурного анализа и моделирования Ab Initio

DOI:

10.3791/57901

⸱

21 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует как получить модель с низким разрешением ab initio и структурные детали моющих средств солюбилизирован мембранный белок в растворе с использованием малых угол нейтронного рассеяния с контраст подбор моющего средства.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биологических малого угол нейтронного рассеяния инструмент в высоких-Flux изотоп реактора из Oak Ridge национальной лаборатории предназначен для исследования биологических материалов, переработка биотоплива и био вдохновил материалы, охватывающие нанометр до Микрометр длина шкалы. Методы, представленные здесь для изучения физических свойств (например, размер и форма) мембранных белков (здесь, MmIAP, intramembrane аспартил протеазы от Methanoculleus marisnigri) в растворах формирования мицеллы являются моющих средств хорошо подходит для этого инструмента рассеяния нейтронов небольшой угол, среди других. Другие методы биофизические характеристики препятствуют их неспособность решить стиральный порошок взносы в сложной структуре белка-моющего средства. Кроме того доступ к био-Deuteration Lab предоставляет уникальные возможности для подготовки крупномасштабного культивирования и выражая дейтерия меченых белков для расширения рассеяние сигнала от белка. Хотя этот метод не предоставляет структурные детали в высоком разрешении, структурного разрыва для мембранных белков содержит много адресуемой области исследований не требуя вблизи атомных резолюции. Например эти области включают определение олигомерных государств, комплекс формирования, конформационные изменения во время возмущений и складные/разворачивающихся событий. Эти расследования может быть легко достигнуто путем применения этого метода.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мембранные белки кодируются с примерно 30% от всех генов1 и представляют собой значительное большинство целей для современных лекарственных препаратов. 2 эти белки выполняют множество жизненно важных клеточных функций,3 , но несмотря на обилие и важности — представляют только около 1% от общей структуры, депонируется в совместную исследований для протеина структурного биоинформатики (RCSB) Банк данных. 4 из-за их частично гидрофобная природа, структурные определения белков мембранных привязкой был чрезвычайно сложным. 5 , 6 , 7

Как многие биофизические методы требуют монодисперсных частиц в растворе для измерения, изолируя мембранных белков из родной мембраны и стабилизации этих белков в растворимые мнемосхемы родной мембран был активной областью исследований в последние годы десятилетия. 8 , 9 , 10 эти исследования привели к разработке многих Роман амфифильных сборок солюбилизировать последнего мембранных белков, таких как nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 и amphipols. 16 , 17 однако, использование моющего средства мицеллы остается одним из наиболее распространенных и простой подходов для удовлетворения требований растворимость данного белка. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 к сожалению, нет единого моющего средства или Волшебная смесь моющих средств в настоящее время существует удовлетворяющего всех мембранных белков; Таким образом эти условия должны проверяться эпирически для уникальных потребностей каждого белка. 26 , 27

Моющие средства самостоятельно собрать в растворе выше их концентрации мицеллообразования критической форме статистические структуры, называемые мицеллы. Мицеллы состоят из многих стиральный порошок мономеров (обычно начиная от 20-200) с гидрофобным алкил цепи, образуя ядром мицеллы и гидрофильные головы группы организованы в слое оболочки мицеллы, стоящих перед водного растворителя. Поведение моющих средств и формирования мицеллы классически был описан Чарльзом Tanford Гидрофобным эффектом,28 и размеров и формы мицелл из часто используемых моющих средств в мембранных белков исследования были характеризуется, с помощью малых угол рассеяния. 29 , 30 моющего средства Организации о мембранных белков также были изучены, и образование комплексов протеина-моющее средство (PDC) ожидается молекулами моющего средства, окружающих белка в договоренность, которая напоминает аккуратно моющего средства Мицеллы. 31

Один добавил, что преимущество использования моющих средств, что результирующая мицеллы свойств может быть манипулирован включения других моющих средств. Многие моющие средства экспонат идеальное смешивание, и выберите пункт Свойства смешанные мицеллы даже может быть предсказано от компонентов и соотношение смешивания. 22 однако, присутствие моющего средства может по-прежнему создают проблемы для биофизические характеристики, способствуя общий сигнал. Например с рентгеновской и рассеяние света методы, сигнал от моющих средств в PDC практически неотличима от белка. 32 с одной частицы крио электронной микроскопии (крио ЭМ) расследования обычно полагаются на ловушку частицы (замороженных); структурные детали белка по-прежнему скрываются определенного моющих средств или высокой концентрации моющего средства, который добавляет к фону. 33 альтернативные подходы к интерпретации полную структуру PDC (включая моющих средств) были сделаны через вычислительных методов, которые стремятся восстановить моющее вокруг данной мембранный белок. 34

В случае рассеяния нейтронов ядро оболочка расположение моющего средства в мицеллы производит форм-фактор, который способствует наблюдаемых рассеяния. К счастью компоненты решения могут быть изменены таким образом, что они не способствуют чистой наблюдаемых рассеяния. Этот процесс «контраст соответствия» достигается путем замены дейтерия для водорода для достижения рассеяния длина плотности, что соответствует фона (буфер). Разумный выбор моющего средства (с доступных транс коллегами) и их соотношение смешивания должны рассматриваться. Для моющего средства мицеллы эта замена могут выполняться с использованием моющих средств с той же головы группы, но имеющие транс алкильной цепи (d хвост вместо h хвост). Так как моющие средства перемешанных,35 их агрегатов будет иметь рассеяния длина плотности, что моль фракция взвешенный средний из двух компонентов (h хвосты и d хвосты). Когда этот контраст средней согласуется с этим глава группы, чтобы удалить все взносы в наблюдаемых рассеяния единообразные статистические структуры могут совпасть полностью.

Мы представляем здесь протокол манипулировать нейтронов контраст стиральный порошок мицелл, включив химически идентичны стиральный порошок молекул дейтерия меченых алкильной цепи. 19 , 36 , 37 это позволяет полный Одновременный контраст соответствия мицеллы ядро и оболочка, которая является уникальной возможностью рассеяния нейтронов. 35 , 38 с этим значительно изысканный уровнем детализации, контраст соответствия можно включить иначе неосуществимым исследования мембранных белков структур. Кроме того этот контраст соответствующий подход может быть распространен на другие системы, связанные с моющим средством, например полимер обмен реакции39 и нефть вода диспергентов,40 или даже другие solubilizing агентов, таких как bicelles,41 nanodiscs,42 или блок сополимеры. Аналогичный подход 43 A как указано в этой рукописи, но применение одного вида моющего средства с частичным дейтерия замен на алкильной цепи и/или руководитель группы, был недавно опубликован. 37 в то время как это можно ожидать улучшения случайное распределение водорода и дейтерия во всем моющего средства по сравнению с подходом, представленные здесь, ограниченное количество доступных позиций на моющее средство для замещения и двухступенчатый стиральный порошок синтеза требуются создает дополнительные проблемы для рассмотрения.

Шаги 1 и 2 протокола подробно ниже часто перекрываются, так как начальный эксперимент планирование должно быть сделано представить предложение качества. Однако, считается представления предложений здесь как первый шаг, чтобы подчеркнуть, что этот процесс должен быть запущен задолго до начала эксперимента нейтронов. Следует также отметить, что необходимого шага, который должно быть подкреплено предложение, должен иметь биохимические и физические характеристики (в том числе чистоту и стабильности) образца, поддерживая необходимость нейтронных исследований. Общее обсуждение малых угол нейтронного рассеяния (SANS) выходит за рамки этой статьи. Краткий, но тщательное введение доступен в работе ссылка, которую Характеризация материалов Кауфман,44 и всеобъемлющий учебник сосредоточена на биологических малых угол решение рассеяния недавно был опубликован. 45 далее рекомендовал чтение приводится в разделе обсуждения. Малоуглового рассеяния использует так называемые рассеяния вектора Q в качестве центральной количество, которое описывает процесс рассеяния. Эта статья использует широко признанного определения Q = 4π sin (θ) / λ, где θ — половина угол между входящей и рассеянного пучка и λ является длина волны нейтронного излучения в ангстремы. Существуют другие определения, что использовать различные символы, такие как ' вектор рассеяния и что могут отличаться 2π фактор или с помощью нанометров вместо Ангстрем (см. также обсуждение рис. 10).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. подготовить и представить нейтрона фонда луч время и предложение инструмент

  1. Обратитесь к онлайн-ресурсы для выявления помещений рассеяния нейтронов, которые обеспечивают общего пользователя нейтрона луч время доступа, например Oak Ridge национальной лаборатории (ORNL). Карта нейтрона объектов и сведений о нейтронных исследований во всем мире доступна онлайн. 46 осознавать, что эти учреждения, как правило, имеют регулярные звонки предложений; Это определяет, когда в следующий раз луч будет доступен. Нейтроны используются для разнообразных приложений; Поиск для малого угол нейтронного рассеяния (SANS) инструментов, особенно те, с возможностями для биологических образцов.
  2. Используйте ресурсы, предоставляемые услуги нейтронов, чтобы помочь навигации нейтронов луч время предложение представление процесса. Проконсультироваться с ученый нейтронного рассеяния (NSS), связанный с данным документом, для которого будет применяться. Обзор нейтронов объекта текущей информации о предложение звонки, сроки и советы для представления; для Оук-Ридж это доступно онлайн. 47 представить луч время предложение после всех руководящих принципов для успешного представления.
  3. Если транс белка требуется (см. 2.2), зал рассеяния нейтронов часто поддерживаются лаборатории и опыта, посвященный производству транс материалов. Чтобы запросить доступ к био-Deuteration Lab (BDL) на ORNL, выберите BDL как второй инструмент в системе предложение. В то время как предложение SANS рассматривается целесообразность и научного комитета по рассмотрению, BDL запросы только анализируются на предмет целесообразности. Чтобы помочь с BDL обзор целесообразности, представить полную информацию запроса формы48 , описывающий протокол выражения протеина и оценкам урожайности (доступно онлайн).
  4. После успешного рецензирования предложения время луча подтверждают награжден дату пучка до начала эксперимента. Убедитесь, что в предложении для надлежащего рассмотрения правильно перечислены все образца и буфер данные и формулы. Любые изменения в предлагаемый экспериментальный план, включая изменения в составе выборки и буфера, требуют уведомления объекта.
    Примечание: Изменения следует как можно скорее обсудить с назначенным NSS.

2. Определите нейтрона контраст матч точек и необходимые контраст для измерения протеина

  1. Сбор информации (от поставщика продукта информации, интерактивных баз данных, опубликованных значений и т.д.) связанных с атомной композиции и томов для моющего средства системных компонентов сочетаться контраст. Эта информация используется для определения нейтронного рассеяния длина плотности (ПВР) и таким образом контраст очка матча (CMPs) в растворе, который имеет решающее значение для получения качества данных и структурной информации для мембранных белков интерес в контексте PDC. Таблица, Резюмируя, физические свойства и контраст очков матч для моющих средств, широко используемых в биофизические исследования мембранных белков включены (Таблица 1).
  2. Определить SLDs нейтронов с помощью веб-приложения, мульча: модули для анализа контраст вариации данных49 (доступны онлайн50 -бесплатно). Ссылка на руководство пользователя расположен на домашней странице. Доступ к веб-сайт и прочтите сопроводительную документацию. Рисунок 1 и на рисунке 2 представлен обзор контраст модуль ввода и вывода для двух соответствующих примеров.
    Примечание: Другие веб-сайты для расчета SLDs доступны, например поддерживается Национальным институтом стандартов и технологий США (NIST) центр нейтронных исследований. 51
    1. Откройте модуль контраст, нажав «Контраст» расположен в левой навигационной панели. Предоставить текст для названия проекта и введите детали ниже двух компонентов (например, стиральный порошок начальник группы и хвост) как ' Субблок 1' и ' субъединица 2'.
    2. Введите молекулярную формулу для каждого компонента в текстовом поле «Формула».
      Примечание: переключатель ам ' должен быть выбран под «Вещества типа» ввести молекулярную формулу. Кроме того используйте буквы «X» в формуле для обозначения атомов водорода легко заменяемые. РНК, белков и ДНК последовательности могут быть введены, если соответствующий «P», «R», или имел ' выбираются переключателями. Если в субъединицы существуют несколько экземпляров компонента, значение для «Nmolecules» может быть изменено соответственно. Практический пример здесь относится к липидов как моющие средства, содержащие два идентичных хвосты, позволяя формула один хвост должен быть заключен с Nmolecules равным 2.
    3. Введите объем в кубических ангстремы для каждого компонента в поле ниже «Тома (Å3)». Используйте Tanford формула28 для алкильной цепи длины n, Vхвост = 27,4 + n * 26,9, рассчитать объем приблизительное хвост, или получить молекулярные тома из продукта информация представлена или опубликованных значений в литература.
    4. Введите сведения для буфера компонентов. Изменить «количество растворенных видов в растворителе» с помощью раскрывающегося меню для добавления или удаления строк для каждого буфера компонента. В случае формирования мицеллы моющих средств, включают в себя бесплатный стиральный порошок мономеров как отдельный буфер компоненты на критических мицеллы концентрации моющего средства (CMC).
    5. Нажмите кнопку «Отправить», чтобы выполнить вычисления контраст нейтронов и генерировать страницы результатов, которая предоставляет таблицу рассеяния длина плотности и контраст матч точек, а также формулы для определения этих параметров в любой заданный процент D2O в буфер. Просмотрите параметры рассеяния с уделением особого внимания CMPs компонента. Если точки матча похожи (в пределах 10% D2O) и бесплатно мицеллы концентрация низкая, то средний CMP может быть используется для сопоставления контраст стиральный порошок взносов. В большинстве случаев CMP стиральный порошок группы голову и хвост будет отличаться более чем на 10-15%, производство ядро оболочка форм-фактор в SANS данных запутывает прямого сбора рассеяние сигнала от белка только.
  3. Оцените контраст между стиральный порошок группы голову и хвост. Когда стиральный порошок головы группы и алкильной цепи хвост CMPs не хорошо подобранная, доступность и включение дейтерия замещенных моющего средства может разрешить рассеяния длина плотности выбора компонентов, чтобы манипулировать. В большинстве случаев это потребует, образуя смешанные мицеллы путем включения идентичные моющего средства с дейтерия замещенных алкильной цепи. Добавление дейтерия повышает плотность рассеяния длина ядро формируется алкильной цепи хвосты. Требуемой конечной точки, в данном случае, такова, что начальник группы оболочки CMP и алкильной цепи ядро CMP имеют примерно равные значения.
    1. Поднимите CMP ядром мицеллы стиральный порошок равным примерно СС оболочки глава группы, определяя соответствующие соотношения смешивания между h хвосты и d хвосты, обеспечивающее полный контраст, совпадающие с головы группами. Предпосылкой для этого определения является знание CMP для дейтерия замещенных алкильной цепи хвост. Имеющиеся аналогом н додецил β-D-maltoside (DDM) доступен со всех алкильной цепи водорода заменены дейтерия (d25-DDM). Повторить расчеты контраст, описанные в шаге 2.1 для имел хвост ' вместо «h хвост».
    2. Рассчитайте коэффициент моль h-хвост к d хвост, необходимых для соответствия контраст с головы группой CMP. С этой решимостью может помочь следующая формула:
      CMPголова = CMPh хвост * χh хвост + CMPd хвост * χd хвост
      где CMP — рассеяния длина плотности и χ — объёмная для компонента стиральный порошок головы, h хвост, или d хвост. Для буферизации решения DDM включение 44% по весу (43% моль) общей моющего средства как d25-DDM с дейтерия замещенных алкильной цепи производит одну CMP 48,5% D2O head и tail компонентов.
  4. Рассмотреть степень замещения дейтерия для мембранных белков. Для измерения достаточно рассеяние сигнала от белка, CMP для белка должно быть по меньшей мере 15% D2O в растворе от моющих средств CMP и условий измерения. Сигнал увеличивается с площади этой % разницы. Так как CMP немеченого белка обычно происходит с ~ 42% D2O в растворе (CMP похож на многие стиральный порошок начальник группы), дейтерий маркировки белка почти всегда является необходимостью. 52

3. Экспресс и очистить Выделительный протеин интереса

  1. Подготовка среднего фунтов (lysogeny бульон) и расти Escherichia coli (E. coli) клетки укрывательство вектор индуцибельной выражение для белка последовательности целевого объекта.
    1. Подготовьте минимальный СМИ. В H2O или D O2, растворяют 7,0 г/Л (NH4)2так4, 5,25 г/Л Na2HPO4, KH 1,6 г/Л2PO4, 0,50 г/Л диаммония водорода цитрат, 5,0 г/Л глицерина, 1.0 мл/Л 20% w/v MgSO 4·7H2O и 1,0 мл/Л Holme микроконцентраций металлов (0,50 г/Л CaCl2·2H2O, 0.098 г/Л CoCl2, 0,102 г/Л CuSO4, 16,7 г/Л FeCl3·6H2O, 0,114 г/Л MnSO4· H2O, 22,3 г/Л Na2EDTA·2H2O и 0,112 г/Л ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Подготовить соответствующие антибактериальной акций решения с использованием H2O или D2O.
    3. Подготовить раствор изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид с использованием H2O или D2O.
    4. Стерильными фильтр все решения в сухой, стерильных контейнеров с помощью верхней бутылки вакуум и шприц фильтры с размером пор 0,22 мкм.
  2. Адаптировать клеток E. coli к дейтерия меченых средних перед масштабирования для гиперэкспрессия белка транс.
    1. Прививать 3 мл среды фунтов с изолированной колонии из плиты Lysogeny бульон (LB) агар или клетки из замороженных глицерин запас. Рост клеток при 37 ° C в тряску инкубатор на 250 об/мин или уменьшить температуру до 30 ° C или ниже при инкубации на ночь во избежание разрастание культуры.
      Примечание: Процесс адаптации может быть изменено. 55 , 56 , 57
    2. После того, как культура LB выросла до оптической плотности на 600 Нм (600OD) ~ 1, разбавьте 1:20 в 3 мл H2O минимальный средний и расти ОД600 ~ 1. Повторить 1:20 разведений, с использованием минимальной среде, содержащей 50, 75 и 100% D2O (или до желаемый процент D2O).
      Примечание: как D2O содержание увеличивается, темпы роста будут уменьшаться. Отношения между2O процент D в рост средств массовой информации и дейтерий замещения в протеине сообщалось в литературе. 58 , 59 , 60
    3. Продолжать расти культура в биореакторе увеличить доходность транс клеточной массы (рис. 3).
      Примечание: Пошаговые процедуры для биореактора операции были рассмотрены в других местах. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Урожай и лизировать клетки Escherichia coli для очистки добычи и белков мембранных
    1. Пелле клетки центрифугированием в ~ 6000 x g ~ 30-45 мин при 4 ° C.
    2. Смягчают Пелле клеток путем замачивания в буфере на льду ~ 30 мин. Затем нежно ресуспензируйте Пелле ячейки в буфер, нежно дозирование с Серологические Пипетки, или нежно покачиваясь на 2D рокер, до конечной концентрации ~ 1 g мокрой клеточной массы/10 мл буфера.
      Примечание: пример буфера составляет 50 мм HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота), pH 7.5, 200 мм NaCl дополнены таблетки ингибитор протеазы.
    3. Во время охлаждения отток лизируют ресуспензированы клетки с тремя проходит через высокого давления гомогенизатор на 10 000 psi.
      Примечание: В зависимости от масштаба необходимых другие лизис методы могут быть использоваться (например, французская пресса или sonication).
    4. Пелле мусора клетки центрифугированием в ~ 4000-5000 x g 15 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг, пока не уточюнено супернатант.
    5. Ультрацентрифуги (~ 150 000 x g для 30-45 мин) супернатант предварительного шага, который содержит водорастворимые и мембраны фракций. Пелле после ultracentrifugation содержит часть мембраны.
    6. Ресуспензируйте Пелле мембраны в большой гомогенизатор Dounce и снова изолировать часть мембраны, ultracentrifugation (шаг 3.3.5). Повторите этот шаг по крайней мере один раз, чтобы удалить слабо связанных белков.
    7. Солюбилизировать последнего мембраны, плавное покачивание ~ 30 мин при температуре 4 ° C в буфер, содержащий моющего средства для очистки. Солюбилизация является очевидной, когда подвеска превращается из облачно прозрачным. Удаление нерастворимый материал по ultracentrifugation (~ 150 000 x g для 30-45 мин.).
      Примечание: В пример буфера составляет 50 мм HEPES, рН 7,5, 500 мм NaCl, 20 мм имидазола и 4% (w/v) DDM для очистки, Ni2 + аффинной хроматографии.
  4. Очищайте протеин после протокол, ранее разработанных для протонированные форм.
    Примечание: Смотрите Наинг et al. пример очистки протокола для intramembrane аспартил hexahistidine меткой в . м. marisnigri JR1 протеазы (d-MmIAP). Был окончательный выход 65 ~ 1 мг транс от роста культуры клеток 5 Л транс, все из которых использовалась в эксперименте SANS (рис. 4).
  5. Обмен очищенный протеин в «Последний буфер обмена» для соответствия контраст.
    1. Подготовка 200 мл «Последний буфер обмена», содержащий правильную смесь для контраста, сопоставления, например,20 мм HEPES, рН 7,5, 250 мм NaCl и 0,05% всего DDM (0,028% DDM и 0,022% d25-DDM) в 49% D2O.
    2. Сбалансировать размер столбца исключение с > 2 тома (CV) колонки «Окончательный буфера обмена» в 3.5.1, используя систему быстро белок жидкий хроматографии (ПСОК).
    3. После парентерального введения образца, запустите столбце и изолировать фракций, соответствующий протеина интереса.
    4. Концентрат белка до требуемой концентрации выпускных (2-5 мг/мл).
      Примечание: Объем ~ 300 мкл требуется заполнить кювет цилиндрического кварца 1 мм, используемые для сетей SAN.
    5. Заповедник Алиготе соответствует буфера для SANS вычитание фона.
      Примечание: Алиготе могут приниматься непосредственно из подготовленных буфера, или идеально чистой элюции фракция в конце выполнения ПСОК.

4. Сделайте последние приготовления к Луч времени и собрать данных

  1. После того, как предложение было принято и утверждено доступ к сайту, выполните все необходимые подготовки назначенных луч время. Это включает в себя prearrival, веб-обучение на месте Радиологическая лаборатория, а также инструмент конкретной профессиональной подготовки.
    Примечание: Обучение требования могут диктовать прибытия заранее для впервые пользователей. Более подробная информация доступна в Интернете. 66
  2. Загрузить образцы и буферы для сбора данных.
    Примечание: Обзор биологических малого угол нейтронного рассеяния (био-SANS) область окружающей среды образца инструмента показан на рисунке 5.
    1. Загрузить образцы и буферов в кварцевые клетки. Кварц клетки доступны от ученый документа или объекта. Используйте гель загрузки советы для доступа узкое отверстие большинства образец клеток.
    2. Убедитесь, что луч затвор закрыт, затем подход в области окружающей среды образца и место кварц клеток в образце смены. Запишите позицию смены образца для каждой ячейки выборки.
    3. Проверьте область и убедитесь, что путь луча является свободным от препятствий, затем оставить области среды образец и открыть затвор луч.
      Примечание: Тщательно следуйте всем правилам Фонда и правила, подчиняться все проводки и прислушаться к рекомендации ученого инструмента. Образцы не могут быть удалены из пучка и манипулировать после воздействия луча без следующих специальных мер предосторожности. Проконсультироваться с радиологического контроля техник (РКИ) до этих процедур.
  3. Выполнить сканирование таблицы для автоматизации сбора данных
    1. Управлять инструментом, с помощью пользовательского элемента управления на основе LabVIEW программного обеспечения, спектрометр инструмент управления среды (Спайс). Следуйте инструкциям для работы инструмент, предоставляемый ученый рассеяния нейтронов. Обзор окна операции сканирования таблицы приводится на рисунке 6.
    2. После ввода информации, необходимой в соответствующих областях, выполнить сканирование таблицы и начнется процесс сбора данных. Отслеживать прогресс через вкладку «Таблицы сканирования статус».

5. сократить с 2D изображения данных до 1D участок

  1. Идентифицировать каждый образец и буфера данных файл из числа зарегистрированных сканирования. Каждое измерение будет присвоен номер уникальный сканирования. Эта информация полезна во время сокращения данных для идентификации каждого соответствующего образца и пара буфера.
  2. Использование MantidPlot программного обеспечения и сценарий Python для сокращения
    1. С данные учетной записи для доступа к их данным в удаленном кластере анализа предоставляются пользователям рассеяния нейтронов. 67 войти на удаленный кластер анализ и выполнение «MantidPlot» из командной строки. Рисунок 7 и 8 цифра предоставляются для оказания помощи эти шаги.
    2. Получить сценарий уменьшения пользователя от рассеяния нейтронов ученый (обычно это произойдет во время эксперимента); Этот сценарий основан на Python и будет содержать все необходимые калибровки и масштабирования корректировок для уменьшения изображения 2D рассеяния в 1D участок рассеянного света как функция угол рассеяния, I(Q).
    3. Откройте предоставленный сценарий уменьшения пользователя в MantidPlot и место соответствующие проверки номера или идентификации для образца и буфера пар в соответствующем списке.
    4. Выполнить сценарий для создания снижение данных как 4 колонки текстового файла (порядок столбцов является Q, I(Q), I(Q) ошибка, ошибка Q) в указанном месте. Щелкните правой кнопкой мыши соответствующую область в MantidPlot и выберите пункт «Печать с ошибками...» для первоначального изучения рассеяния профилей.

6. анализ данных за структурные параметры рассеяния частиц

  1. Передача файла снижение данных от анализа сервера на локальный компьютер с использованием безопасной передачи файлов FTP. Это может быть выполнена с использованием программного обеспечения таких как FileZilla или CyberDuck. На странице входа analysis.sns.gov предоставляются дополнительные инструкции и сведения для подключения к файловой системе сервера анализа.
  2. Скачайте ATSAS программного обеспечения комплект65,68 (весь ATSAS Люкс). 69 70 индивидуальных программ также доступны онлайн для анализа данных SANS, а именно определение структурных параметров и ab initio модели.
    Примечание: Многие параметры доступны для SANS анализ данных биомакромолекулах. 45
  3. Использовать Примус71 для построения данных, буфера масштабирования и вычитание и Guinier анализ.
    1. Запуск ATSAS «Анализ данных SAS» приложения и загрузки снижение данных файлы, соответствующие пары образца и буфера.
      1. Для масштабирования буфера правильно, выберите диапазон данных в высокой Q (Q > 0.5 Е-1) где оба профили похожи и плоский и нажмите кнопку «Масштаб», расположенную под «Деятельности» вкладки. Масштабный коэффициент будет применяться в буфер, таким образом, что эти два плоских областей должны совпадать. Осторожность: должно быть правдоподобной физической причиной что оправдывает масштабирования интенсивности буфер в соответствии с образцом. Если несоответствие является большой, консультироваться ученый инструмент для допустимых подходов к вычитание фона. 44 , 45 , 72
      2. Увеличение диапазона данных для просмотра всех точек. Щелкните «Вычитание» для выполнения этой операции. Щелкните правой кнопкой мыши буфера вычитается datafile в легенде и сохраните этот файл для последующего анализа. Figure 9 возможности использования на вкладке «Операции».
    2. Анализ Guinier вычитается буфер образца данных, используя вкладку «Анализа» приложения «Анализ данных SAS».
      1. Убедитесь, что выбран правильный файл в списке и нажмите кнопку «Радиус инерции». Автоматизированный попытка выполнить Guinier подходят будет оказываться, нажав на кнопку «Autorg».
      2. Расширить круг данных, используемых для включают все данные, низкой Q и начать сужение диапазона данных, забрав high-Q пунктов до Qmax * Rg предел находится ниже 1.3. Используйте график остатков для проверки линейной форме диапазона данных. Guinier подходят дает приблизительные Rg и я0 для рассеяния частиц.
      3. Сделать небольшие изменения в регионе подходят и контролировать чувствительность этих значений для диапазона данных, используемых в форме. Рисунок 10А демонстрирует использование инструмента «Радиус инерции».
  4. Получить функцию распределения вероятности (P(r)) в "Гном". 73 в выходной файл, созданный здесь будет использоваться в качестве входных данных для ab initio процесса моделирования.
    1. Запуск мастера распространения расстояние в закладке «Анализ», получение хорошо подходят для данных имеет важное значение для получения качества модели. Дополнительные сведения о получении точных подходит пожалуйста, смотрите Обзор74 , Putnam, et al.
      Примечание: гном программа предоставляет дополнительные сведения о fit за пределами мастера распространения расстояние. Рисунок 10B показывает правильное использование инструмента «Расстояние распределения», и Рисунок 11 иллюстрирует некоторые из распространенных ошибок.
    2. Определите Dmax, максимальная межатомного расстояния в молекуле.
      1. Оценить значение для Dmax, сняв соответствующий флажок, чтобы заставить Rmax = 0 и указав большое значение для Dmax (150 Å, например). Первый x перехват в участок P(r) дает этой оценки.
      2. Сделать это значение Dmax и диапазона данных, используемых или количество точек, используемых в подходят для оптимизации гном, подходят для данных и результирующая кривая P(r) добавочные изменения.
    3. Продолжать совершенствовать гном fit и сохранения выходных файлов гном с хорошей форме параметрами для последующего ab initio моделирования шаги.
  5. Имитировать SANS профили с высоким разрешением модели PDB с помощью программы CRYSON. 75
    1. Откройте программу и выберите параметр '0'. Выберите имя PDB-файла в браузере файл всплывающего окна. Нажмите enter, чтобы принять параметры по умолчанию, за исключением указания цепи deuteration фракций и часть D2O в растворителе для достижения надлежащего контраста параметров.
    2. Соответствуют модели в набор экспериментальных данных, введя «Y» и выбрав файл данных в браузере файл всплывающего окна. Примите остальные значения по умолчанию, и выходные файлы будут записаны в местоположение файла PDB. «.fit» файл содержит информацию для профиля предсказал рассеяния с высоким разрешением 3D-модели.

7. Создание модели Ab Initio от данных.

Примечание: DAMMIF76 и77 в пакете программного обеспечения ATSAS DAMMIN используется для воссоздания Макетные атом модели (плотин) с помощью имитации отжига процесса от гном, выход, который содержит P(r) данных, или сведения о вероятности или частот межатомного расстояния в пределах рассеяния частиц. Эти программы могут работать в пакетном режиме или на ATSAS-онлайн веб-сервере.

  1. Запуск мастера PRIMUS формы с помощью кнопки «Dammif» на вкладке «Анализа» «Анализа данных SAS» и использовать ручной выбор параметров. Вход для мастера это показано на рисунке 12.
    1. Определить в Guinier диапазоне от fit (шаг 6.3.2) и переходите к следующему шагу, с помощью кнопок навигации. Задать значения посадки с P(r) участка (шаг 6.4) и переходите к следующему шагу.
    2. Предоставляют параметры для ab initio процесса моделирования. Введите префикс для имен файлов вывода модели (например, SANSEnvelope), выбрать либо «быстрой» или «slow» режим моделирования, введите значение для числа моделей (17 рекомендуется для статистической значимости), выберите один из доступных вариантов для частиц симметрии, anisometry и угловой масштаб (если известен). Убедитесь, что флажки проверяются на средние модели с DAMAVER и уточнить окончательную модель с DAMMIN.
    3. Инициировать процесс, используя кнопку «фиксации». Как только процесс завершится, просмотр и сохранение рабочего каталога.
      Примечание: процесс моделирования типичной для одного, небольшой белок может занять несколько часов с типичный персональный компьютер. Файлы хранятся в каталогах временных до тех пор, пока сохраняется.
  2. Наложение и наложения окончательного SANS конверт с связанной с высоким разрешением модели с помощью SUPCOMB в пределах ATSAS. Поместите копию с высоким разрешением модели PDB подогнать на SANS конверт в рабочем каталоге. Выполнение SUPCOMB из командной строки с помощью файлов PDB как два аргумента с структурой шаблона указано первым: supcomb $ HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Примечание: Имя второго файла перечисленные будет переписана как новый файл с «r» добавляется в конец и имеющие новые координаты для наложения на структуре шаблона.
  3. Визуализируйте ab initio модели результаты с помощью PyMOL (pymol.org), программа просмотра 3D молекулярной графики. Рисунок 13 обзор PyMOL операций.
    Примечание: Существуют руководящие принципы публикации для структурного моделирования данных малых угол рассеяния от биомолекул в растворе. 78
    1. Запустите приложение PyMOL и открыть PDB-файлы, соответствующие 3D SANS конверт и по краю SUPCOMB структуры с высоким разрешением для просмотра.
    2. Визуализируйте SANS конверт, представляющий эту модель в качестве поверхности. Нажмите на ' рядом модель и выберите ' Показать: как: поверхность '.
    3. Визуализируйте структуру белка с высоким разрешением позвоночника, представляя эту модель как мультфильм. Выберите в ' кнопку рядом с этой модели и выберите ' Показать: как: мультфильм '. Отображение цепи как радуга от N-C-конечная, выбрав кнопку «C» и ' по цепи: Chainbows'.
    4. Измените прозрачность поверхности представительства для ясности. Выберите из меню «Настройка», ' прозрачности» поверхность» 40% '.
    5. Сделайте белый фон и не непрозрачный. В строке меню «Экран», выберите ' фон»' и выберите «Укрывистая» снимите этот параметр и «Белый» чтобы пометить этот цвет для фона.
      Примечание: дополнительные операции и использует для PyMOL можно найти на PyMolWiki.org.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Луч время и инструмент предложение должно четко передают всю информацию, необходимую для Комитета по обзору, таким образом, чтобы можно было произвести действительный оценку предлагаемого эксперимента. Связь с NSS настоятельно рекомендуется для неопытных пользователей. NSS можно оценить первоначальные осуществимость и руководство предложение представить подчеркнуть возможности, безопасность и потенциал для высокой отдачей науки. Информация, представленная в предложении должно включать спр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Структурная биология исследователи воспользоваться преимуществами дополнительных структурных методов как решение рассеяния для получения биохимических и структурных деталей (например, общий размер и форма) от биомолекул в растворе. SANS является особенно привлекательным техника для определения структуры низким разрешением мембранных белков, одним из основных направлений современной структурной биологии и биохимии. SANS требует количества очищенных белков сопоставимы с кристаллографических испытаний (1 мг/образец). Недавн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы Volker S. Urban, Сай Венкатеш Pingali, Кевин л Вайс и Райан Оливер C. привлекаются через UT-Battelle с US DOE для поддержки программы пользователя науки нейтронов и био-инструмента в Окриджской национальной лаборатории, используемый в этой статье.

Эта рукопись была соавтором, UT-Battelle, ООО, по контракту де-AC05-00OR22725 с нас Департамент энергетики (DOE). Правительство США сохраняет и издатель, приняв статьи для публикации, признает, что правительство США сохраняет неисключительное, оплаченного, безотзывное, во всем мире лицензию публиковать или воспроизвести опубликованной формы этой рукописи, разрешить или другие сделать, для целей правительства США. Доу будет предоставлять общественности доступ к эти результаты федерально спонсируемых исследований в соответствии с планом Доу доступа общественности. 82

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отделение биологических и экологических исследований поддерживает исследования в центре ORNL в структурной молекулярной биологии (CSMB) и био-использования средств, поддерживаемых научный отдел помещений пользователя, Управление основных энергетических наук, Департамента США энергии. Строительные работы на мембранных белков в лаборатории Либерман была поддержана NIH (DK091357, GM095638) и NSF (0845445).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Концентратор Amicon Ultra MWCO 50KDa EMD MilliporeUFC905096лабораторная посуда
цитрат аммония двухосновнойFisher ScientificA663среднекомпонентный
сульфат аммонияEMD Millipore2150средний компонент
Bioflo 310 Биореакторная системаEppendorfM1287-2110оборудование
Кальция хлорида дигидратAcros423525000 средний компонент
КарбенициллинIBI НаучныйIB02025антибиотик
Хлорамфеникол EMDMillipore3130антибиотик
Кобальт (II) хлоридАкросAC21413-0050средний компонент
Сульфат меди (II)АкросAC19771-1000 средний компонент
Оксид дейтерияSigma-Aldrich756822среднекомпонентный
очиститель газа DrieriteW.A. Hammond Drierite Co. Ltd.27068
ЭДТА, динатрий, дигидратEMD Millipore4010среднекомпонентный
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3оборудование
Ä Очиститель kta UPC100GE Healthcare оборудование
ГлицеринSigma-AldrichG5516среднекомпонентный
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR колонкаGE Healthcare 
ИмидазолVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Гексагидрат хлорида железа (III)MP BiochemicalsICN19404590средним компонентом
LB Агар МиллерФишер ScientificBP1425-2
Сульфат магния гептагидратVWR97062-134средний компонент
Моногидрат сульфата марганца(II)AcrosAC20590-5000среднекомпонентный
MaxQ 6000 Инкубированный/охлаждаемый шейкерThermo ScientificSHKE6000-7 оборудование
n-Додецил-D25-&бета;-D-мальтопиранозидАнатрассD310T
n-Додецил-&бета;-D-мальтопиранозидАнатрассD310A
Фосфат калия одноосновнойVWR97062-346среднекомпонентный
RC 6 Plus ЦентрифугаThermo Scientific Sorvall46910оборудование
SIGMAFAST ингибитор протеазы коктейль таблетки, ЭДТА Сигма-ОлдричS8830
Хлорид натрияСигма-ОлдричS3014
Гидроксид натрияСигма-Олдрич795429
Фосфат натрия двухосновнойСигма-ОлдричS7907среднекомпонентный
Стерильный 25 мм шприц фильтр с 0,2&микро; m PES мембранаVWR28145-501лабораторная посуда
Стерильный одноразовый фильтр для бутылочки с 0,2&микро; m PES мембранаThermo Scientific596-4520 Лабораторная посуда
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare 
Колонка Superose-12 10/300 GL GE Healthcare 
Измеритель плотности ячеек Ultrospec 10GE Healthcare 80211630оборудование
Моногидрат сульфата цинкаAcrosAC38980-2500 средний компонент
171167011751750117517301

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35(2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335(2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047(1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488(2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582(2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735(2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SANSPyMOL

Похожие статьи