Легковесные протокол для синтеза самостоятельной сборки на основе амидов кислых пептидные Amphiphiles (ППД) и связанных с ними биоматериалов

Summary

Синтез amphiphiles на основе амидов кислых пептида (ППД) является важной задачей благодаря наличию нескольких Амин nitrogens, который требует разумного использования защиты групп, чтобы замаскировать этим реактивного функций. В настоящем документе мы описываем снисходительный метод для подготовки этих новых класса самостоятельной сборки молекул.

Abstract

На основе амидов кислых пептидные Amphiphiles (ППД) являются новый класс самостоятельной сборки амфифильных биоматериалов, относящиеся к amphiphiles пептид (ССА). Традиционные PAs обладают заряженные аминокислоты как растворяющие групп (лизин, аргинин), которые подключены непосредственно к сегменту липидов или может содержать область компоновщик из нейтральных аминокислот. Тюнинг пептид последовательность PAs может принести различные морфологии. Аналогично ППД обладают сегмент гидрофобных и нейтральных аминокислот, но также содержат полиаминовых молекулы воды, растворяющие (гидрофильных) групп. Как и в случае с PAs, ППД могут также самостоятельно собрать в разнообразных морфологии, в том числе малые стержни, витой нано ленты и плавленого нано листы, при растворении в воде. Однако наличие первичных и вторичных аминов на молекуле одного полиаминовых представляет значительную проблему при синтезировать ППД. В этой статье мы покажем простой протокол, основанный на прецеденты литературы, для достижения снисходительный синтез энергомощностей с использованием твердой фазы пептидного синтеза (ППУ). Этот протокол может быть продлен для синтеза PAs и других подобных систем. Мы также иллюстрируют шаги, которые необходимы для расщепления от смолы, идентификации и очистки.

Introduction

Самостоятельной сборки пептидные amphiphiles (ССА) являются класс биоматериалов, обычно состоит из следующих сегментов: () гидрофильные голова, (b) компоновщика региона и (c) гидрофобная хвост. Большинство описанных в литературе PAs обладают гидрофильные голова состоит из заряженных или полярных аминокислотных остатков^1,2,3,4. ССА нашли широкий спектр приложений в биомедицине, в том числе Доставка лекарств, диагностики заболеваний, восстановительной медицины, и т.д.⁵. На основе их аминокислотных последовательностей, ПА может сформировать широкий спектр наноструктур, включая сферических мицелл и нано волокна. Недавно мы сообщили класс гибрид на основе амидов кислых пептидные amphiphiles, называют ППД⁶. Морфологии, самостоятельной сборки кинетики и метаболических деградации, эти биоматериалов, были найдены быть связано с их solubilizing начальник группы. Кроме того PPA наноструктур не показывают токсичности к mammalian клеток (линии MiaPaCa2 и клеток HeLa) в концентрациях, протестированных. PPA-основанные nanocarriers являются привлекательными наркотиков-доставки, потому что: (1) полиаминовых поглощение и метаболизм было показано увеличение раковых клеток, (2) Катионный наноструктур можно добиться от англ побег^7,8, что приводит к более циркуляции и жительства в пределах ячейки и (3), они должны иметь собственный метаболизм профиль, когда по сравнению с ПА; Например, они будут более стабильными направлении протеаз, найти в человеческом теле (хотя они может быть чувствительным к другие ферменты, такие как Амин оксидазы)^9,10. Кроме того иметь разнообразные морфологии, физико-химических свойств, наночастиц жесткость и Ассамблея кинетики в зависимости от длины и заряд отдельных PPA молекулы⁶были найдены ППД. Здесь мы описываем подробный протокол для синтеза, идентификации и очистки ППД, которые также могут быть применены к подготовке Пас или аналогичных гибридные пептидных молекул.

Потому что Полиамины обыкновенно не коммерчески доступных в их защищенных форм, и потому, что защита первичные и вторичные амины Полиамины имеет первостепенное значение для спрягать их с аминокислот и других молекул, мы наметили синтетические шаги для обеспечения их защиты. Общая цель настоящего Протокола заключается в обеспечивают простой метод для спрягать полиаминов в аминокислоты. Полиамины отсутствие карбоксильные группы; Таким образом они не могут сочетаться каток амидной или Ван смол. Вместо этого смолы, например 2-chlorotrityl хлорид рекомендуются для синтетических протокола. Основной задачей для синтеза PPA является наличие первичных и вторичных аминов функциональных групп. Для наших целей мы защитили все вторичные амины в полиаминовых сохраняя основной амино-группы на полиаминовых свободной соединительной реакции. Реакция была сделана на прочную поддержку принципам твердой фазы пептидного синтеза (ППУ) для облегчения работы вверх после каждого шага муфтой и deprotection. Следующий протокол предназначен для ручного и автоматизированного синтеза ПРП (хотя проверка некоторых шагов будет сложным в автоматизированной системе). Синтез этих молекул может также осуществляться на автоматизированных синтезатор или с помощью микроволновой реактора (автоматические или полуавтоматические). Схему реакции подведены на рисунке 1.

Рисунок 1: (A) A общей реакции схема для синтеза ППД. (B) представитель Полиамины, которые могут быть использованы для синтезированных ППД, описанных здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

1. общий протокол для синтеза ППД

1. Рассчитайте шкалу синтеза (обычно ммоль). Эта шкала основана на массы целевой суммы PPA. Имейте в виду, что эффективность реакции ППУ постепенно уменьшается с увеличением аминокислотной последовательности. Таким образом эффективность точное реакции трудно вычислить.
2. Рассчитайте вес использоваться согласно загрузки смолы смолы. Загрузка на контейнере или протокол анализа смолы и выражена в ммоль/г. Следующая формула может использоваться для расчета веса смолы:
3. Тщательно взвесить, 2-chlorotrityl хлорид смолы (в нашем случае загрузка является ~0.85 ммоль)
4. Место смолы в фриттированных синтез сосуд со следующими характеристиками: мощность – 50 мл, фриттированных диск – 25 мм, пористость – средний.
5. Добавьте 15 мл Дихлорметан (DCM) смолы.
6. Аффикс синтеза судна в шейкере механические переменной скорости (фляга шейкер/мешалкой) и поверните судов под углом в 45° (или горизонтально) максимизировать агитации.
7. Разрешить бусины смола пухнуть 15 мин отек повышает доходность реакции потому, что она облегчает молекулярной диффузии и доступность для активного узла, повышения эффективности сцепления.
8. Добавить 8 эквиваленты (2 ммоль 0,25 шкалы ммоль) желаемого полиаминовых (Спермин, спермидина, Diethyelenetriamine, 1,3-diaminopropane и т.д.) в смоле и позволить ему реагировать на 5 ч.
   Примечание: Меньший период реакции приведет к сокращению урожайности.
9. Сделать Кайзер тест (см. Таблицу материалы) для подтверждения успешного сопряжения полиаминовых смолы. Успешное сцепления первичных аминов дает фиолетовый/синий цвет, который соответствует бесплатно аминов.
10. Защите группе Первичные амины, с использованием 4 эквиваленты 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), растворенного в безводный метанола (15 мл), встряхнув реакции смесь ночи¹¹.
    Примечание: Меньшее время реакции снижает урожайность.
11. Выполните тест Кайзер. Отсутствие синего цвета из бисера смолы подтверждает успешной защиты. В случае неудачной защиты Первичные амины повторите предыдущий шаг.
12. Слейте DCM и мыть смолы дважды смесью DCM и DMF (2:1, 15 мл).
13. Растворяют 20 эквиваленты (5 ммоль) ди трет бутил ди карбонат (БПЦ) в DCM (20 мл) и позволяют реакции перейти на 3 часа.
14. Делать хлоранила тест (см. Таблицу материалы), чтобы подтвердить полную защиту вторичных аминов. Положительный тест (защита) дает бесцветный или светло-желтого цвета. Бесплатные вторичные амины придают темный зеленый/синий цвет, а первичных аминов красный цвет.
15. Слейте жидкостной смеси и мыть дважды смесью DCM и DMF (2:1, 15 мл).
16. Добавить 2% раствор Гидразин в DMF (10 мл) и трясти за 1 час.
17. Сделать Кайзер тест для подтверждения успешного deprotection Первичные амины.
18. Добавьте требуемый аминокислоты в обратной последовательности, в которой вы бы записывают/рисуют их. Пептиды взяты из N Термини до Термини C но синтезируются в противоположном направлении, C до н. Например, для PPA, требующие следующих пептид ядра - GLFD-, добавьте аспарагиновой кислоты (D), а затем фенилаланин (F), лейцин (L) и наконец глицин (G).
    Примечание: Для большинства аминокислоты, следующие коктейль муфта подходит для привязанность к полиаминовых загружен смолы.
    1. Смешайте 4 эквиваленты (1 ммоль) аминокислоты Fmoc защищенный, 3,95 эквиваленты 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) и 15 эквиваленты diisopropylethyl Амин (DIPEA).
    2. Растворить их в смесь DCM и DMF (1:1, 15 мл) и sonicate коктейль для 2 мин (до полного растворения).
    3. Ждать еще 3-5 мин для обеспечения активации карбоновые кислоты на аминокислоты.
    4. Добавьте смесь реакции судна. Осуществляют реакции для 2-4 ч при комнатной температуре.
       Примечание: Мы нашли следующие эффективные альтернативы HBTU (обычно требующих нижнюю аминокислоты и агент муфты): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima.
    5. Сделать Кайзер тест для подтверждения успешного соединения.
    6. Снятие защиты Fmoc группа из аминокислоты, добавив 20% раствором 4-метил пиперидина (10 мл) в DMF. Сделать это дважды, каждый раз, пожимая реакционную смесь 15 мин.
       Примечание: Эффективной альтернативой для удаления Fmoc-пиперазина/дБу¹².
       1. Почистить DCM (15 мл) между дополнений.
    7. Сделать Кайзер тест для подтверждения успешного де защиты аминокислоты.
    8. Вымойте смолы тщательно, чтобы удалить все следы 4-метил. Вымойте смолы дважды с DMF (10 мл), каждый мыть, продолжительностью 5 мин и наконец с DCM (10 мл) за 10 мин.
    9. Добавить все оставшиеся аминокислоты повторяя последовательно сцепного устройства и снять защиту шаги.
19. Наконец после соединения все необходимые аминокислоты, конъюгат гидрофобные хвост к последней амино кислоты полиаминовых пептид конструкции:
    1. Добавьте 10 эквиваленты желаемого карбоновые кислоты функциональность 9,5 эквиваленты HBTU и 12 эквиваленты DIPEA растворяется в DCM и DMF смесь (1:1, 20 мл).
       Примечание: Имейте в виду, чем некоторые хвосты может понадобиться различные пропорции растворителя (обычно больших % DCM) или того или другого растворителя как N-метилпирролидоном (NMP).
    2. Sonicate коктейль для 5-10 мин до распада (мы видели, она занимает больше времени для хвост, чтобы полностью растворить) и добавить к судну.
       Примечание: Для хвосты, содержащих несколько реактивных сайтов, они будут должны защищаться перед их сцепления.
    3. Осуществляют эту реакцию (муфта гидрофобные хвост) для по крайней мере 5 h, хотя желательно проводить ночь за высокий урожай.

2. PPA расщепления от твердой поддержки

Целью этого шага является расщепление PPA из смолы и для удаления защиты групп БПЦ из аминокислот и амидов кислых отходов.

1. Вымойте смолы с DMF (8 мл в течение 2 мин) и дважды с DCM (8 мл, каждый раз в течение 5 мин). Перед каждой сложения стечь растворителя из судна. После того, как выполняется последний мыть, сухой смолой под вакуумом для 15 мин.
2. Приготовляют раствор расщепления, используя следующие смеси: 28:1:1 trifluoroacetic кислоты (ТФК): H₂O: Triisopropyl Силан (советы). Чтобы сделать 15 мл декольте коктейль добавить 14 мл TFA, 0,5 мл H₂O и 0,5 мл советов.
3. Добавьте это решение расщепления смолы и встряхнуть для 2-4 ч при комнатной температуре.
4. Собирать решения в 25 или 50 мл раунд нижней колбе.
5. Сосредоточиться ТФК в вакууме до 1 – 2 мл с помощью роторный испаритель при пониженном давлении при обогреве смеси при температуре 40 ° C (не превысит 55 ° C, чтобы избежать разложения PPA).
6. После испарения добавьте полученное решение TFA (каплям) круглым дном флакон, содержащий безводный холодной эфира (15 мл). Это сразу же будет выпадать в осадок PPA.
7. Кроме того добавьте оригинальный флакон, где TFA было сосредоточено безводный холодной эфира (5 мл).
8. Sonicate Этот настой восстановить дополнительные твердые и объединить с эфира решения от шага 2.6.
   Примечание: Перенос пипетку можно мыть с небольшой объем DCM. Избегайте введения ДМФ во время процесса, потому что она, как правило, образуют гель подобные вещества.
9. Место колбу (крытая) внутри холодильника и пусть он стоять на ночь, чтобы максимизировать осадков.
10. Соберите осажденного материала вакуумной фильтрации с использованием спеченных диск фильтр воронку. Идеальный поры размеры штрафа или средний.
11. Вымойте преципитат дважды с холодной эфира (5 – 10 мл), чтобы удалить любые остаточные органические.

3. Идентификация сырой продукт, с помощью метода сушеные drop MALDI

1. Подготовка матрицы для анализа в положительных режиме:
   1. Чтобы начать анализ молекулярного веса с помощью матрицы помогает лазерная десорбция/ионизации (MALDI) масс-спектрометрии, добавьте 10-20 мг α-циано-4-Гидроксикоричная кислоты в пробки microcentrifuge.
   2. Добавляют раствор (1:1, 1.0 мл) воды/ацетонитриле с 0,1% Trifluoroacetic кислоты (ТФК). Тщательно перемешать, vortexing.
      Примечание: Эта матрица должна использоваться для положительно заряженных пептиды. MALDI негативные режим похож, но требует матрицы, содержащие 9-aminoacridine с 0.1% аммиака как растворителя добавки.
   3. Добавить 1-2 мкл пример целевого пластиной из нержавеющей стали для MALDI и сухой образца в воздухе. Добавить 1-2 мкл матрицы и высушить его снова.
      Примечание: Пластины имеют круговая маркировка сетке вдоль пластину цель помочь найти особое место.
2. Анализируйте образцы в MALDI инструмент для проверки их личности. Электроспрей ионизации (ESI) является действенной альтернативой подтверждения личности ППД.

4. Очистка ППД, используя очистке препаративный реверс фаза высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

1. Растворяют осадок PPA в минимальное количество ацетонитриле и воды.
   1. Как правило растворяются 100 мг сухой сырой ФПА-менее чем в 5 мл ацетонитриле и воды. Более гидрофобных ППД может потребоваться больший процент Ацетонитрил распустить и возможно, также потребуется больший объем растворителя в целом, в зависимости от чистой заряд ПРП (Таблица 1).
   2. Если не произойдет полного растворения, добавить 1% TFA (АКС или H₂O). Это также можно добавить следовых количеств других совместимых растворителей, включая диметилсульфоксид, метанол или изопропиловый спирт (ограничить их содержание до 5%).

Растворитель	Положительно заряженные ППД		Отрицательно заряженные ППД
	0,1 TFA % в воде		0,1% NH3 в воде
	0,1% TFA в АКС		0,1% NH3 в АКС

Таблица 1: растворителя систем. Предложил жидкостной системы, положительно и отрицательно заряженные ППД.

2. Sonicate с помощью sonicator рога для 20 минут 10 s импульсов с Amp1, 48% или 2-3 ч в ультразвуковой ванне PPA.
3. Затем фильтр с помощью фильтра 0.45 мкм шприц после фильтрации с помощью фильтра шприц из политетрафторэтилена (ПТФЭ) 0,20 мкм. PPA решения должны быть четкими и свободным от всех твердых материалов.
   1. Если фильтрация является слишком сложным, sonicate для длительного периода времени. Настоятельно рекомендуется, что решение PPA является очищенный сразу после фильтрации шприц, как длительного хранения может привести совокупности или gelate, который потребует повторного sonication и, возможно, повторно фильтрации.
4. Во время и после очистки использование ВЭЖХ класс растворители или те, которые фильтруются через 0,25 мкм шприц фильтр/мембраны.
   Примечание: Наиболее распространенных растворителей условий для очистки ППД состоят в градиенте H₂O и АКС.
5. Используйте стандартный инструмент ВЭЖХ реверс фаза для этого протокола. Она должна включать элюции градиента программист, двоичные жидкостной системы доставки, УФ детектор способен обнаруживать на 220 и 254 Нм и коллекционер программируемый дроби. Максимальную скорость потока должна быть 50 мл/мин.
6. Использование C-18 обратная фаза столбец для разделения. Могут использоваться столбцы следующих размеров в зависимости от массы твердых очищенная и чистой заряд ФПА (Таблица 2).

PPA заряд	Размер частиц	Размер столбца	Масса сырой PPA
+ ve заряженных	5 мкм	150 x 30 мм	170 мг
-ve заряженных	5 мкм	150 x 30 мм	170 мг
+ ve заряженных	5 мкм	150 x 21.2 мм	90 мг
-ve заряженных	5 мкм	150 x 21.2 мм	90 мг

Таблица 2: предложил колонок: Размеры, размеры частиц и максимальная нагрузка на инъекцию для C18 обратный фазы ВЭЖХ столбцы

7. Придать PPA с тома, определяется как способность столбца и объем впрыска цикла ВЭЖХ. Запустите метод ВЭЖХ градиента согласно настройкам, показано в таблице 3 (элюции время 40 мин).

Время	Сольвент (ацетонитриле)	B растворителя (вода)	Скорость потока (мл/мин)
0	5%	95%	Скорость потока зависит от столбца упаковки и его размер.
2	5%	95%
35	95%	5%
38	100%	0%
40	5%	95%

Таблица 3: предлагаемые градиент: Предложил обратная фаза градиент показаны относительные состав воды против Ацетонитрил в течение времени. Скорость потока будет зависеть от характеристики столбца.

8. Проанализировать фракций, собранные на различных пробирки с использованием MALDI и определить, какие трубы (или трубки) содержит PPA. Это оценивается путем изучать молекулярный вес, найдены в каждой тюбике.
   1. Проверьте чистоту фракций на аналитической ВЭЖХ. Использовать систему ВЭЖХ градиент, оснащенных УФ детектор на 220 Нм.
   2. Если примесей, сделайте дополнительный цикл очистки, ВЭЖХ. Для использования с аналитической ВЭЖХ, используя онлайн конвертер столбца может быть уменьшен выше градиента, используемого для препаративных ВЭЖХ. Каждая фракция много быть ≥95% чистой для определения физических характеристик или биологической оценки.
9. Сбор фракций в большой круглодонные колбу или испарения колбу и удалить все ацетонитриле и большая часть воды. Окончательное решение ППА должна быть не более 10 мл.
10. Передача этого концентрата до 50 мл пластиковых пробирок. Быть сообщил, что ПРП моющее средство подобных веществ; Таким образом пузырьки будут создаваться во время испарения растворителя. Мы обнаружили, что добавление этилового спирта уменьшается формирования пузыря.
11. Вакуумные концентрат концентрат. Во время вакуумного испарения большое количество PPA могут придерживаться стен контейнера. Восстановите это неоднократно промыв стены колбу водой ВЭЖХ. Общий объем концентрированной PPA и rinsate должно быть не более чем 30 мл.
12. Место водный раствор внутрь 50 мл трубки.
13. Вспышки заморозить это решение PPA в жидком азоте:
    Примечание: Flash замораживания результатов в небольшие кристаллы льда, которые будут быстрее возвышенное в лиофилизатор. Кроме того медленнее замораживания может позволить формирование собственн-собранные супрамолекулярных структур. Другой вариант (но менее желательным) является постепенно заморозить в морозильной камере-80 ° C или заморозить с помощью сухого льда + смесь ацетона
    1. Перед установкой пластиковых пробирок в лиофилизатор, перфорации или ослабьте крышку трубки чтобы влага избежать образец и получить собранные в холодильной. Установите блок лиофилизации, набор до-54 ° C и 0,016 мбар.
       Примечание: Еще один вариант заключается в снять крышку и место wipe (с резинкой) на верхней части открытия. Кроме того мы обнаружили, что замораживание образцов в угол или разорвать лед на небольшие порции позволяет быстрее и лучше лиофилизации за счет увеличения площади поверхности.
    2. Если тело начинает таять, это может означать, что присутствуют следы органических растворителей (обычно ацетонитриле). Повторите шаг, замораживания и оценить состояние лиофилизация.
    3. Если таяние сохраняется, существует два возможных решения:
       1. Сплит образца в две части (чтобы быть помещены в трубках), разбавляют водой и заморозить снова. Не использовать это решение часто, потому что большое количество органических растворителей могут повредить оборудование.
       2. Кроме того Поместите образец в колбу и дальше испаряются органического растворителя под вакуумом. Лиофилизации образец, который находится в жидкой форме обычно приводит к натыкаясь и потеря соединения PPA.

5. хранение ППД

1. Магазин ППД в-20 ° C с шапки затянуты и опечатаны с парафина на трубе с помощью правильной метки.
2. Перед использованием вернуть PPA в температуре в вакуумной камере, чтобы избежать конденсации водяного пара по ППД.

Results

После очистки и синтеза и до оценки физико-химических или биологических рекомендуется массы ППД вновь зарегистрированного и чистоту установлено с помощью аналитических ВЭЖХ. Характеризация материалов или биологических оценки, ППД нужно иметь чистоты > 95%. Рисунок 2 показывает ВЭЖХ трассировки (вверху) и MALDI спектров (внизу) подтверждающий наличие продукта. ВЭЖХ аналитических систем будет интегрировать площадь под кривой (AUC)) и AUC > 95% может быть ...

Discussion

Протоколы, описанные здесь может использоваться для синтеза ППД скважин как PAs и связанных пептидной основе молекул (таких, как гибридные PA-peptoids). Хотя синтез пептидов, используя ППУ является простой процедурой, синтез пептидов, содержащие биологические молекулы самонаведения может быть особенно сложным. Полиамины как Спермин, спермидина, diethyelenetriamine, и т.д., может функционировать как самонаведения молекул для ориентации клетки рака¹³. ППАС могут самостоятельно собрать в нан...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Хлортритилхлоридная смола	Сосуд для синтеза AappTec	RTZ001
SynthwareTM	Олдрич	SYNP120050M
Дихлорметан	Acros	AC406920250	Fisher Sci. Каталог #
Wrist Shaker	Boekel Scientific	401000-2
Кайзер тест-набор	Sigma-Aldrich	60017
2-[(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил-амино]-этанол	Sigma-Aldrich	CDS004772
Безводный метанол	Acros	AC610981000	Fisher Sci. Каталог #
Набор для тестирования хлоранила	TCI	TCC1771-KIT	VWR Каталог #
Di-tert бутилдикарбонат	Каталог Acros	AC194670250	Fisher Sci. #
Dimethylformamide	Fisher Scientific	BP1160-4
гидразин	Acros	AC296815000	FIsher Sci. Catalogue #
(2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат)	p3biosystems	31001
4-метилпиперидин	Каталог Acros	AC127515000	FIsher Sci. #
Трифторуксусная кислота	AappTec	CXZ035
Триизопропилсилан	Sigma-Aldrich	233781
Ether Fisher	Scientific	E138-1
α-Циано-4-гидроксикоричная кислота	Sigma-Aldrich	C8982
9-Аминоакридин	Sigma-Aldrich	92817
Fisherbrand  Шприцевые фильтры: мембрана из фторопласта	Fisher Scientific	09-730-21