Method Article

Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ

DOI:

10.3791/57920

⸱

September 15th, 2018

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

микро РНК (интерферирующим) являются короткие и очень гомологичных последовательности РНК, выступающей в качестве post-transcriptional регуляторы messenger РНК (мРНК). Текущие методы обнаружения Мирна различаются по чувствительности и специфичности. Мы описываем протокол, который сочетает в себе в situ Гибридизация и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

микро РНК (интерферирующим) являются одноцепочечной РНК стенограмм, которые привязку к messenger РНК (мРНК) и препятствовать их перевода или содействовать их деградации. На сегодняшний день, адаптивной были причастны большое количество болезней и биологических процессов, который означало необходимость надежного обнаружения методов Мирна стенограмм. Здесь мы описываем подробный протокол для digoxigenin меченых (DIG) Locked нуклеиновой кислоты (LNA) на основе выборки Мирна обнаружения, в сочетании с иммуноокрашивания белка на мыши сердце секций. Во-первых мы провели в situ гибридизация технику с помощью зонда для определения Мирна-182 выражение в разделах сердца от управления и гипертрофии сердца мышей. Далее мы провели иммуноокрашивания для сердца тропонина T (cTnT) белка, на те же разделы, совместно локализовать Мирна-182 с клетки cardiomyocyte. Используя этот протокол, мы смогли обнаружить основанный Мирна-182 через щелочной фосфатазы колориметрические пробирного и cTnT через флуоресцентной окраски. Этот протокол может использоваться для обнаружения выражение любого Мирна интерес через DIG-меченых LNA зонды и соответствующих белков на разделах ткани сердца мыши.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

микро РНК (интерферирующим) являются короткие (18-25 нуклеотидов), одноцепочечной, некодирующей РНК, которые функционируют как негативные регуляторы экспрессии генов на post-transcriptional уровне путем ингибирования матричная РНК (мРНК) перевод и/или содействия деградации мРНК 1. интерферирующим расшифрованный от интронов или экзонов кодирования или некодирующей генов и являются расщепляется в ядре, DROSHA, чтобы прекурсоров интерферирующим (pre адаптивной), которые являются короткий стебель циклические структуры 70 нуклеотидов2. После цитоплазматических экспорта, pre адаптивной Далее перерабатывается DICER в зрелых ада....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы тканей сердца мыши для этого исследования были получены согласно соответствующим законам и институциональных руководящих принципов и были одобрены Йельского университета институциональных животное уход и использование Комитета.

1. решение подготовка

  1. Подготовить РНКазы бесплатно ddH2O, рассматривая ddH2O 5 Л с 5 мл 0,1% Диэтилпирокарбонат (DEPC) ночь (O/N), при комнатной температуре (RT). Автоклав (121 ° C) для отключения DEPC. Использование DEPC-лечение ddH2O для подготовки течению решений, как указано.
    Предупреждение: DEPC является известный канцероген, обрабатывать только в зонта.
    2. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

микроРНК в situ гибридизация была оптимизирована на мыши сердце разделов с помощью схватка Мирна и U6-мяРНК, который служил в качестве отрицательных и положительных элементов, соответственно. Положительный пятнать указывается в синий, в то время как негативные пятнать обозначается на отсутствие развития цвета (рис. 1A-1В). Конкретное выражение cardiomyocyte Мирна-182 оценивалась в разделах сердца от управления и PlGF избытком мышей. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мирна Стенограмма обнаружения может быть достигнуто через различные методы, которые варьируются в чувствительность, специфичность и количественные власти. Здесь, мы демонстрируем муфта микроРНК в situ гибридизация с иммуноокрашивания и описать протокол, который позволяет для параллельной оценки уровней выражение Мирна и белковых молекул, на те же разделы сердца. Сначала мы покажем, как выполнять в situ Гибридизация зондов Мирна DIG-меченых LNA на разделы парафина встроенных сердца. Далее мы опишем, как .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Атанасиоса Papangelis, за критические замечания по рукописи. FM поддерживается биотехнологии и биологических наук научно-исследовательский совет (СИББН; BB/M009424/1). IP поддерживается грант развития ассоциации ученый американского сердца (17SDG33060002).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ДиэтилпирокарбонатSigma AldrichD5758DEPC
Фосфат буферный физиологический растворSigma AldrichP4417PBS
Tween-20Американский биоаналитическийAB02038неионогенное поверхностно-активное вещество
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinase K, рекомбинантный, ПЦР классаSigma Aldrich3115879001ProK
параформальдегидSigma AldrichP6148PFA
Sodium ChlorideThermoFisherS271NaCl
Magnesium Chloride HexahydrateThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
раствор соляной кислоты, 1 NThermoFisherSA48HCl
Раствор соляной кислоты, 12 НThermoFisherS25358HCl
1-метилимидазолSigma Aldrich336092
N-(3-диметиламинопропил)-N′-этилкарбодиимида гидрохлоридSigma Aldrich39391EDC
Раствор перекиси водорода H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Trisodium citrate dihydrateSigma AldrichS1804Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 зонд обнаруженияQIagenYD006157015'-DIG и 3'-DIG меченый
левамизола гидрохлоридSigma Aldrich31742
Сывороточный альбумин крупного рогатого скотаSigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP ТаблеткиSigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
Хлорид калияThermoFisherP217KCl
DAPI раствор (1 мг/мл)ThermoFisher62248
DAPI Стеклянный покровный колпакThermoFisher12-545EСтеклянный покровный колпак
Пластиковый покровный колпакGrace Bio-LabsHS40 22 ммX40 мм X40 мм X0,25 ммРНК-азы свободный пластиковый покровный колпак
Анти-дигоксигенин-AP, Fab фрагментыSigma Aldrich11093274910DIG антитело
Гидрофобный барьер VectorLaboratoriesH-4000Пап-ручка
Антисердечный тропонин Т антителоAbcamab92546cTnT антитело
Козье антитело против кролика IgG (H+L) Перекрестно абсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011Анти-кролик-568 Антитело
Dako Флуоресцентная монтажная средаDAKOS3023Пастбища
для овецСыворотка Sigma AldrichS3772
Сыворотка от козыSigma AldrichG9023
Деионизированный формамидАмериканский БиоаналитическаяAB00600
гибридизационная печьThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationMicroRNA DetectionMouse Heart SectionsProtein ImmunostainingCardiac Troponin TDigoxigenin Labeled ProbeLocked Nucleic AcidAlkaline Phosphatase AssayFluorescent StainingTissue Section Preparation

Related Articles