Методическая статья

Химическая Reversion обычных человеческих плюрипотентных стволовых клеток в наивно как состояние с более мультилинейного дифференциация потенции

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57921

⸱

10 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол для эффективной, насыпных и быстрого химического reversion обычных линии загрунтовать человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) в epigenomically-stable наивно Предимплантационная Эпибласт как pluripotent состояние. Этот метод приводит к экспрессии генов снижение линии загрунтовать и заметное улучшение направленного дифференцирования мультилинейного через широкий репертуар обычных hPSC линий.

Аннотация

Наивный человеческих плюрипотентных стволовых клеток (N-hPSC) с улучшенной функциональностью может иметь широкие последствия в регенеративной медицине. Цель настоящего Протокола заключается в эффективно восстановить родословную-контроль включён, обычных человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) поддерживается на фидер бесплатно или фидер зависимые условия для плюрипотентности наивно как с улучшенной функциональностью. Этот метод химического наивно реверсии использует классические лейкемии тормозящий фактор (LIF), GSK3β и Мек/ERK ингибирование коктейль (LIF-2i), дополнены только ингибитор tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i будет восстановлено обычных hPSC состоянии стабильной плюрипотентных принятия биохимические, транскрипционный анализ и эпигенетических функций человека предимплантационной Эпибласт. Этот метод LIF-3i требует минимальной клетки культуры манипуляции и высокую воспроизводимость в широкий репертуар эмбриональных стволовых клеток человека (Госкомсанэпиднадзором) и линий трансген свободного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC). LIF-3i метод не требует повторного грунтовки шаг до дифференциации; N-hPSC могут быть продифференцированы непосредственно с чрезвычайно высокой эффективности и поддерживать karyotypic и epigenomic графену (в том числе на тисненой локусов). Чтобы увеличить универсального метода, обычные hPSC впервые культивировали в коктейль LIF-3i, дополняют два дополнительных малых молекул, которые полифункциональное киназа протеина (форсколин) и Еж Соник (ТСС) (purmorphamine) сигнализации (LIF-5i). Этот краткий LIF-5i адаптации шаг значительно повышает первоначальный клоновых расширения обычных hPSC и позволяет им быть впоследствии наивно вернулась с LIF-3i только в больших количествах, таким образом устраняя необходимость комплектации/subcloning редких N-hPSC колонии позже. LIF-5i-стабилизированный hPSCs поддерживаются впоследствии в LIF-3i только без необходимости анти apoptotic молекул. Самое главное LIF-3i реверсии заметно улучшает функциональные плюрипотентности широкий репертуар обычных hPSC, уменьшив их экспрессии генов линии загрунтовать и стирание интерлайн изменчивость направленного дифференцирования обычно наблюдается среди независимых hPSC линии. Представитель характеристики LIF-3i-отменены N-hPSC условии и экспериментальных стратегий для функциональных сравнения isogenic hPSC в линии загрунтовать против. изложены наивно как государства.

Введение

2i (Мек/ERK и GSK3β ингибитор) культуры система первоначально была разработана для уточнения гетерогенных мыши на основе сыворотки эмбриональных стволовых клеток (mESC) культуры в единой земли состояние плюрипотентности сродни мыши Предимплантационная Эпибласт1. Однако 2i не поддерживает стабильное поддержания человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) линии2. Различные сложные малые молекулы, фактор роста дополнение, трансгенных подходы недавно сообщалось и захватить предположительно аналогичные человеческих плюрипотентных наивно как молекулярные государств2. Однако многие из «наивно как» государства, созданные с помощью этих методов, также выставлены karyotypic нестабильности, epigenomic дефекты (например, глобальные потери родителей геномный импринтинг), или нарушение дифференцировки потенциал.

В контраст, коктейль тройной химическое ингибирование GSK3β, Эрк и tankyrase сигнализации и лейкемия ингибирующего фактора (LIF-3i) было достаточно для стабильной наивно как reversion широкий репертуар обычных hPSC линии3. LIF-3i-отменены наивно hPSC (N-hPSC) поддерживается нормальное получен и увеличение их выражения человека Предимплантационная Эпибласт наивно конкретных генов (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Стелла (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i реверсии также наделяет hPSC с массивом, молекулярной и биохимической характеристики, уникальные для плюрипотентности mESC как наивный, которая включала увеличилась фосфорилированных STAT3 сигнализации, уменьшилось Эрк фосфорилирование, глобальные 5-обнаружен CpG hypomethylation, геном общесистемной CpG деметилирования в эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)-конкретных генным стимуляторам и доминирующей дистальной OCT4 усилитель использования. Кроме того, по сравнению с других наивной реверсии методов, которые привели к необычно hypomethylated запечатлел геномной локусов, LIF-3i-отменены N-hPSC были лишены систематического потеря тисненой CpG шаблонов или ДНК метилтрансфераза выражения (например, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)3.

Прямого LIF-3i культуры широкий спектр обычных человеческих эмбриональных стволовых клеток (Госкомсанэпиднадзором) и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) выросла на кормушки или E8 фидер свободных условиях добиться быстрого и сыпучих реверсии наивно Эпибласт как государства. Однако прямого LIF-3i наивно возврат может быть неэффективным в некоторых нестабильных обычных hPSC линии из-за присущего геномных и заливают линии изменчивости, вытекающих из стола генетически различных доноров.

Таким образом, чтобы расширить утилита метода LIF-3i, ступенчатой оптимизации был разработан и представлен здесь, что позволяет универсальный наивно реверсии с почти любой обычных Госкомсанэпиднадзором или hiPSC трансген бесплатная линия культивированный на кормушки. Этот метод возврата универсального наивно использует временные первоначальной культуры шаг в обычных hPSC, которая дополняет LIF-3i коктейль с два дополнительных малых молекул (LIF-5i) которые полифункциональное киназа протеина (форсколин) и Еж Соник (ТСС) ( purmorphamine) сигнализации. Один из первоначальных прохождение обычных hPSC в LIF-5i подстраивается под их последующих стабильных реверсии LIF-3i в больших количествах. Первоначальный LIF-5i адаптации значительно увеличивает первоначальный одноклеточного клоновых распространения обычных hPSC, выращенных на E8 или питатели (до их последующего стабильного, непрерывного прохода в одиночку LIF-3i). Обычные hPSC линии адаптированы сначала один проход в LIF-5i терпеть последующих массовых клоновых пассированый наивно отменены клеток в условиях LIF-3i, который устраняет необходимость комплектации и subcloning редких стабильной колоний или рутинное применение анти apoptotic молекул или Ро связанные белка ингибитора киназы (рок).

LIF-3i метод успешно работали устойчиво расширять и поддерживать широкий репертуар > 30 независимых, генетически разнообразны обычных hPSC линии для > 10 – 30 проходов с использованием методов либо неферментативного или ферментативный диссоциации, и без доказательств индукцию хромосомных или epigenomic аномалии, включая аномалии на тисненой гена локусов. Кроме того, последовательное LIF-5i/LIF-3i культура является только наивный реверсии метод, который до настоящего времени было сообщено что улучшает функциональные плюрипотентности широкий репертуар обычных hPSC линий, уменьшив их экспрессии генов линии-контроль включён и значительное улучшение качества их Multipotent с дифференциация потенции. LIF-3i наивно реверсии метод стирает присущего интерлайн изменчивость дифференциации линии-контроль включён, обычных hPSC линий и будет иметь большой полезности применения в регенеративной медицине и клеточной терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные процедуры выполнялись в соответствии с ухода за животными руководящие принципы и протоколы, утвержденным Джонса Хопкинса Школа медицины институт ухода за животными и использования Комитет (IACUC).

1. Подготовка мыши эмбриональных фибробластов (MEF) для обычных фидер зависимые (Госкомсанэпиднадзором среднего/MEF) или наивно hPSC культура (LIF-3i среднего/MEF)

  1. Приобрести или подготовить внутренние поставки низкий проход MEF питатели CF1 или CF1 x DR4 гибрид E13.5 мыши эмбрионов после опубликованные протоколы4.
    1. Криоконсервировать низкий проход (Р1 Р2) MEF культур до (для долгосрочного хранения) или после (на срок до 6 месяцев) облучения и хранить в жидком азоте как описано4.
    2. Облучение (5000 rad) массовое расширение MEF под p5 с помощью γ - или X-рентген-облучателя и подготовить аликвоты на 1,5 х 106 клеток на флакон для кратковременного хранения (менее 6 месяцев) при температуре-80 ° C в ультра-низкой температуры морозильной камеры.
    3. Пластины между 1,2 х 106 (свеже облученных не замораживают) и 1,5 х 106 (облученных криоконсервированных) MEF в одну 6-ну gelatinized пластина для подготовки подачи культур, как описано ниже.
  2. Подготовьте желатин покрытием 6-ну стерильных пластин культуры ткани лечение путем добавления 1,5 мл стерильного раствора желатина 0,1% для каждой скважины в биологической безопасности кабинета.
  3. Инкубировать желатин покрытием пластин при 37 ° C для по крайней мере 1 час или ночь в инкубаторе Лаборатория CO2 .
  4. На следующий день, оттепель низкий проход (например, P2 для P4), замораживают ДМСО и облученного (5000 rad) MEF согласно шаги указанные ниже.
    Примечание: Необлученных MEF должны также быть оттаяла, расширен и облучены непосредственно перед использованием.
  5. Место криоконсервированных Алиготе MEF в ванну воды 37 ° C. После оттаивания, стерилизовать трубки с этанолом и сразу же разбавляют ДМСО криопротектора по крайней мере 10 раз с MEF среднего (Таблица 1) в пределах биобезопасности кабинета (например передачи 1 мл ДМСО-MEF Алиготе в среду MEF 9 мл стерильного 15 мл конические).
  6. Центрифуга разреженных MEF клетки на 200 x g 5 мин в стерильных 15 мл конические трубы.
  7. В области биобезопасности кабинета аспирационная удалить супернатант свободных клеток и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 – 2 мл свежего MEF среднего.
  8. Аккуратно отменить решение желатина и добавить 2 мл MEF, вновь приостановлено в MEF среднего для каждой скважины gelatinized пластины 6-Ну, как указано выше. MEF количество клеток и пластины 1.2 x 10-6 (свеже облученных не замораживают) или 1,5 х 106 (облученных криоконсервированных) MEF в одну 6-ну gelatinized плиту.
    Примечание: Все клетки культуры пластин, которые передаются от CO2 инкубатора биобезопасности кабинета можно аккуратно протереть бумагой, этанол распыляется но не должен быть распыляется непосредственно на 70% этанол раствором, чтобы избежать распространения этанола в скважинах.
  9. Инкубируйте MEF пластины при 37 ° C ночь в лаборатории CO2 инкубатора (5% CO2, влажная атмосфера) чтобы разрешить вложение, перед использованием.

2. Массовая стабилизации обычных hPSC культур для последующих наивно реверсии с шагом адаптации краткий LIF-5i

  1. Проверка всех обычных hPSC линии для обладающих нормальный кариотип, G-диапазонов, до начала LIF-5i/LIF-3i реверсии.
    Примечание: LIF-3i реверсии линий высокого прохождение обычных hPSC (например., P > 40 – 50) следует избегать, так как эти культуры уже может гавани геномной аберрации, которые могут негативно сказаться стабильных, эффективных и насыпных LIF-3i reversion загрунтовать, convetional hPSC линии.
  2. Поддерживать и расширять обычных hPSC культур с проверенного нормальной получен в систему на основе MEF культуры (как говорится в разделе 1) или систему фидер свободной культуры (по словам следователя предпочтения).
    Примечание: Оба фидера зависимой hPSC/MEF cocultures (например, Госкомсанэпиднадзором средний (Таблица 1) дополняется bFGF 4 – 10 нг/мл) или фидер бесплатно (например., Е8 5 или mTSER 6 СМИ (в соответствии с инструкциями изготовителя по vitronectin покрытием пластин) методы совместимы с массовых наивно реверсии с использованием системы LIF-5i/LIF-3и/MEF (рис. 1). Non ферментативные методы являются предпочтительными для пассированый обычных hPSC до подготовки их для возврата. LIF-5i и LIF-3i СМИ формулировки не содержат антибиотики или противогрибковые агенты. Ожидается, что правила стандартные операции для кабинета стерильности по биобезопасности и поддержания строго соблюдаться чтобы избежать любых бактериальных или грибковых загрязнения.
  3. Для MEF-на основе системы культуры Подготовьте MEF кормушки в пластину gelatinized 6-Ну, как описано в разделе 1 по крайней мере за один день до пассированый LIF-5i-адаптированных обычных hPSC культур.
  4. После того, как обычные hPSC культуры достигли ~ 50% confluency (т.е., 3-5 дней после первоначального покрытия), замените Стандартный Госкомсанэпиднадзором питательной среды LIF-5i среднего (2 мл на хорошо; Таблица 1).
    Примечание: Выполните следующие действия в области биобезопасности кабинета.
  5. Культура и поддерживать обычными hPSC/MEF на срок до 2 дней в LIF-5i в инкубаторе CO2 (5% CO2, влажная атмосфера). Изменение среднего LIF-5i ежедневно адаптировать их для их последующего прохода и стабильное возвращение в LIF-3i.
  6. Кроме того для свободной подачи обычных культур (например, в E8), hPSC культуры в LIF-5i только ночь перед пассированый на следующее утро.
    Примечание: LIF-5i и LIF-3i культур можно оба поддерживаться с атмосферного (21% O2) или физиологические (5% O2) кислорода уровнях CO2 инкубатора (5% CO2, влажная атмосфера).
  7. До пассированый, поместите пластины для культуры в кабинете биобезопасности, мыть LIF-5i-адаптированных обычных hPSC раз с PBS и добавьте 1 mL реагента диссоциации клеток в каждой скважине. Инкубировать на 5 минут при 37 ° C в CO2 инкубатора и осторожно нарезанных с пипеткой в одну ячейку подвеска обратно в кабинете биобезопасности.
    Примечание: Неферментативного диссоциации буферов в качестве альтернативы может использоваться для подготовки единого клетки пассированый.
  8. Собирать суспензию клеток в среде (по крайней мере 2 раза разрежения) Госкомсанэпиднадзором в стерильных 15 мл конические трубы и осторожно нарезанных клетки, закупорить получить одну ячейку подвеска.
  9. Центрифуга на 300 x g 5 мин, аспирационная/удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 – 2 мл LIF-5i среды в кабинете биобезопасности. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева или счетчик автоматический клеток.
  10. Вымойте предварительно покрытием плиты MEF дважды с PBS (2 мл на скважину в 6-ну пластины) и распространять 1 – 2 х 106 клеток (в среде 2 мл LIF-5i) на 1 хорошо промывают PBS MEF пластины.
  11. Настроить и оптимизировать первоначальное покрытие плотности для каждой линии отдельных hPSC быть, наивно вернется, как replating эффективности может быть крайне непостоянны. Место пластину в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера).
    Примечание: Рутинное применение анти apoptotic реагенты не рекомендуется для большинства hPSC линии с помощью этого метода. LIF-5i системы уже значительно повышает первоначальный массовых клоновых повторное хромирование эффективность обычных hPSC линий. Однако одноразового использования ингибитора рок (5 – 10 мкм Y-27632) может улучшить первоначальный LIF-5i клоновых повторно plating эффективность обычных hPSC культур в первый проход для некоторых нестабильных линии загрунтовать hPSC линии с склонность к спонтанной дифференциация.
  12. Если начиная с свободной подачи культур (например, E8), непосредственно передачи одной скважиной диссоциированных обычных hPSC, адаптированы в LIF-5i в один облученных MEF-покрытием хорошо (то есть, проход 1:1).
  13. Следующий день, слегка взболтать пластину поднять все клетки не прилагается, аспирационная среднего (мыть PBS является обязательным) и заменить 2 мл LIF-5i среды. Выполните этот шаг в области биобезопасности, кабинет, ежедневно в течение 3-5 дней, или до тех пор, пока клетки являются 60 – 70% притока (рис. 1). Место пластину в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера).

3. долгосрочное техническое обслуживание и расширение N-hPSC в среде LIF-3i

  1. После первоначального LIF-5i адаптации прохождение последующих стабильных LIF-3i культур каждые 3 – 4 дня в биобезопасности кабинета, или когда культур стали 60 – 70% притока (рис. 1).
    Примечание: LIF-3i культур требуют строгого обслуживания и позволяя N-hPSC культур достичь плотность высокого confluency/клеток от продолжительной культуре (например., > 4 дня) уменьшает последующих клоновых эффективность повторного покрытия и способствует спонтанным дифференциация.
  2. В области биобезопасности кабинета, отказаться от питательной среды и мыть каждый хорошо культуры LIF-5i/LIF-3i, осторожно добавив 2 мл ФСБ. Отменить PBS и добавить 1 мл раствора отряд клеток. Инкубируйте 5 минут при 37 ° C в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера).
  3. Собирать суспензию клеток, добавить Госкомсанэпиднадзором среднего (без ингибиторы или факторы роста (Таблица 1); по крайней мере 2 раза разрежения) восстановить все hPSC и мягко нарезанных клетки, закупорить получить одну ячейку подвеска. Передать подвеска стерильные 15 мл Конические трубки.
  4. Центрифуга на 300 г за 5 мин и аспирата/удалить супернатант. Вновь приостановите Пелле клеток в среде LIF-3i. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева или счетчик автоматический клеток.
  5. Пластину ~ 2 x 105 клеток на хорошо на облученного MEF в пластину gelatinized 6-хорошо для рутинной пассированый LIF-3i культур. Для первоначального LIF-5i-адаптированных культур тарелка изначально более высокой плотности (4 x 105 клеток/хорошо) до первого прохода в LIF-3и/MEF.
  6. Повторно пластины и распространять LIF-5i-адаптированных hPSC на свежие PBS-промывают облученного MEF фидер пластин (подготовленные в предыдущий день, как указано выше) в среде LIF-3i. Замените средство LIF-3i ежедневно.
  7. N-hPSC проход для наименее 4 – 7 непрерывного массового проходы в LIF-3i средних предварительного использования N-hPSC в функциональных исследований или криоконсервирования. Записать количество проходов N-hPSC в любом обычных или LIF-3i СМИ.
    Примечание: LIF-3i реверсии высокой-прохода (например > p40) линии-контроль включён, обычных hPSC линий не рекомендуется. Следует приложить вернуться обычных hPSC линии на минимально возможных проход, что они доступны. Кроме того LIF-3i-вернулся hPSC, прошли более чем 10 LIF-3i проходы не рекомендуется использовать для функциональных исследований, поскольку такие культуры, N-hPSC может гавани karyotypically аномальные клонов из-за длительного клоновых клеточной культуры селекции. Свежий LIF-5i/LIF-3i возврата низкий проход обычных hPSC линий должны проводиться для функциональных исследований, если запасы N-hPSC с < 10 ходов в LIF-3i не доступны.

4. Замораживание и оттаивания LIF-3i-отменены N-hPSC

  1. Разверните узел вернулся N-hPSC для по крайней мере 5-7 проходы в LIF-3i, как указывалось выше, перед использованием в функциональных исследований или долгосрочный криоконсервирования. Запишите количество проходов в обычных условиях и в условиях LIF-3i на каждом криоконсервированных флакона.
    Примечание: Избыток LIF-3i-отменены N-hPSC не используется в функциональных анализов может быть криоконсервированных на каждый проход, но замораживание ниже пост возврат ходов (например., < p3) может привести к плохой, или очень переменной после оттепели восстановления эффективности.
  2. В области биобезопасности кабинета аспирационная питательной среды, вымыть клетки в PBS (2 мл на хорошо), аспирационная PBS и отделить hPSC колоний в отдельные ячейки, используя мобильный отряд решение (1 мл на хорошо). Поместите пластины для 5 минут при 37 ° C в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера). Разбавить раствор отряд ячейки с LIF-3i среднего (2 раза), собирать hPSC в стерильных 15 мл конические, центрифуга клетки на 200 x g 5 мин и Ресуспензируйте Пелле клеток в среде LIF-3i (1 – 2 мл на хорошо эквивалент). Подсчитать количество ячеек с помощью Горяева или счетчик автоматический клеток.
  3. Центрифуга N-hPSC в среде LIF-3i (200 x g 5 мин) и Ресуспензируйте клетки в кабинете биобезопасности в замораживания раствора (Таблица 2), на плотности по крайней мере 1 x 106 клеток/мл.
  4. Клетки перехода в долгосрочного хранения криогенных трубы и поместите в контейнер медленно замораживания. Разрешить образцы заморозить на ночь в холодильнике-80 ° С.
  5. Следующий день, передача криопробирки в морозильной камере жидкого азота для длительного хранения.
  6. Для размораживания, поместите замороженные флакона в ванну воды 37 ° C ~ 2 мин Стерилизируй-отпусти флакона (то есть, этанол спрей), передачи hPSC в стерильных 15 мл конические и медленно разбавлять средство десятикратного в Госкомсанэпиднадзором клетки (Таблица 1), дополнены 5 мкм из Ро связанные белка ингибитора киназы (рок) Y-27632 в стерильных биологической безопасности капот кабинета.
  7. Центрифуга на 200 x g за 5 мин. В биобезопасности кабинета отказаться от свободной ячейки супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в LIF-3i среднего (1 – 2 мл) дополнены 5 мкм рок ингибитор Y-27632.
    Примечание: Исключение Y-27632 приведет к бедным после оттаивания эффективность восстановления (рис. 2).
  8. Передача талой клетки высокомобильна в LIF-3и/рок ингибитор на PBS-промывают лунки MEF-покрытием. Криоконсервировать LIF-3i культур на плотности 1 х 106 клеток на флаконе. Каждый из этих флаконов на кормушки в одной скважине gelatinized пластины 6-ну оттепели.
  9. Следующий день, начало регулярного LIF-3i средних расширения без ингибитора киназы Ро.

5. фидер удаления для сбора образцов N-hPSC

  1. Для подготовки образцов из ЛИФА 3и/MEF (или Госкомсанэпиднадзором/MEF обычных) культур (т.е., для экспрессии генов (например, количественного RT-PCR, microarrays) или анализ белков (например, Западная помарка), разрушающим LIF-3i культур от MEF питателей с помощью Магнитные активирован ячейку Сортировка (ПДК) с антитела анти TRA-1-81 покрытием микрошарики согласно протоколу производителя.
  2. Можно также используйте следующий простой метод предварительного покрытия истощать культур кормушки, как описано ниже.
  3. В стерильные биологической безопасности капот кабинета удалить супернатант свободных клеток, помыть лепешка с PBS 2 мл стерильного за хорошо. Отсоедините адэрентных LIF-3и/MEF культур с использованием клеток отряд решение (1 мл/хорошо). Инкубируйте 5 мин в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера). Соберите hPSC в стерильных 15 мл конические. Мыть два раза в Госкомсанэпиднадзором средний, передачи клетки в стерильных 15 мл конические и центрифуги на 200 x g за 5 мин.
  4. В биобезопасности кабинета, вновь приостановить каждую лунку LIF-3и/MEF отделить клеток в 2 мл среды, LIF-3i и непосредственно перенести на новую скважину пластины 6-Ну что с 0,1% желатина свежезаваренным покрытием.
  5. Инкубируйте LIF-3и/MEF hPSC клетки за 1 ч при 37 ° C в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера). Сбор не сторонник клетки с пипеткой в новой Конические трубки. Аккуратно добавить 2 мл Госкомсанэпиднадзором среды в каждой скважине и вихрем собрать оставшиеся ячейки non сторонник.
    Примечание: Большинство из облученного MEF будет приложить к gelatinized пластины в 1 h, оставляя большинство hPSC в суспензии.
  6. Объединить и центрифуги клетки на 300 x g 5 мин мыть в PBS. Snap замораживание клеток Пелле в жидком азоте после центрифугирования, или же вновь приостановить окатышей в лизировать буфер, который совместим с течению анализ белков и нуклеиновых кислот (рис. 2B).
  7. Выполняйте характерные признаки LIF-3i hPSC линии с соответствующих обычных загрунтовать isogenic hPSC управления.
    Примечание: Из-за внутренней изменчивости между и внутри загрунтовать культур, в соответствующий timepoint в культуре или до наивно реверсии готовят соответствующие элементы управления. Подробные протоколы и материалы для вниз по течению immunofluorescent bioimaging, поток цитометрии, Западный blotting, экспрессии генов (ПЦР-анализов и microarrays), метилирование исследования (точка помаркой, microarray метилирования CpG), OCT4 проксимальном и дистальном enhancer 3других предоставляются преобладание репортер анализов и сигнализации ингибитор анализов.

6. должность наивно реверсии: Проверка целостности геномных и удержания родительских отпечатки LIF-3i-отменены N-hPSC до использования в функциональных анализов

  1. Экран начальной загрунтовать, обычных hPSC культур за владение нормальный кариотип (например, с Гимза полосный окрашивание анализ с использованием опубликованных методы 7) до начала реверсии LIF-5i/LIF-3i.
    Примечание: Это для ликвидации обычных hPSC населения, которые могут гавани аномальные геномных изменений, которые могут управлять преимущество артефакта селективного выживания в условиях клоновых LIF-3i.
  2. Для получения оптимальных результатов, свежезаваренным вернуться обычных hPSC культур в наивно как состояние с LIF-3i несколько недель до их использования в функциональных исследований или направленного дифференцирования.
    Примечание: Процедура затягивается «техническое обслуживание» культуры в условиях LIF-3i для более чем 10 отрывков, которые не рекомендуется использовать следующие наивно реверсии. Рутинной расширение и обслуживание линий Госкомсанэпиднадзором и hiPSC должны выполняться с использованием обычных культуры систем (например, в E8, или MEF/Госкомсанэпиднадзором средних с bFGF).
  3. Оценить после возвращенной строки N-hPSC для сохранения нормальной karyotypes 5 – 7 места после LIF-3i реверсии (например. с Гимза полосами, окрашивание анализ7, или любой другой метод выбора).
  4. Оценить все восстановлено N-hPSC линии для сохранения нормальных родительских геномной отпечатки путем анализа метилирования ДНК по выбору (например, протоколы, CpG ДНК анализ microarray родительских отпечатки в LIF-3i-отменены N-hPSC предоставляются в других местах3 ) после 5 – 10 ходов реверсии LIF-3i.

7. пост наивно реверсии: Экспериментальный дизайн руководящие принципы для анализов количественных направленного дифференцирования, используя LIF-3i-отменены N-hPSC

  1. Непосредственно используйте LIF-3i N-hPSC в установленных направленного дифференцирования протоколы без дополнительных клетки культуры манипуляции.
    Примечание: Повторная грунтовки (т.е. преобразование N-hPSC обратно в обычных загрунтовать условий до их использования в направленного дифференцирования анализов) не является необходимым с методом LIF-3i и не рекомендуется.
  2. Для контроля для воздействия пробирного и интерлайн изменчивости в функциональное тестирование отдельных hPSC линий, перекрестной проверки линии конкретных дифференциация потенции, используя протоколы независимых дифференциации с по крайней мере три hPSC линий, полученных от независимых генетических стола (то есть, несколько доноров производные hiPSC и Госкомсанэпиднадзором).
  3. Для сравнения функциональных установите родственных культур, в число эквивалентных проход и от той же линии (isogenic) hPSC параллельно с обычными загрунтовать линии и LIF-3i-вернулся hPSC культур. Поддерживать загрунтовать/наивные брат isogenic hPSC культур в их соответствующих средствах массовой информации (например., Е8 против. LIF-3i) и одновременно дифференцировать с использованием идентичных дифференциация протоколы и материалы, чтобы устранить любой экспериментальной смещения (рис. 4).
  4. Для isogenic заливают против наивно hPSC сравнения, настроить и оптимизировать первоначальное покрытие плотности для каждого индивидуального дифференциация assay.
    Примечание: Подробные протоколы для нейронных прародителя, окончательное энтодермы и онко эндотелиальная направленного дифференцирования LIF-3i-отменены N-hPSC предоставляются в другом месте 3. LIF-3i-отменены N-hPSC имеют более мощного потенциала пролиферативных и дифференциация в направленного дифференцирования анализов, чем обычные hPSC. N-hPSC обычно требует более низкой концентрации первоначального покрытия, чем обычные hPSC, и в отличие от их обычных загрунтовать hPSC коллегами, не требуется использование анти apoptotic реагенты для повышения их клоновых выживание после ферментативные пищеварение в дифференциации анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол оптимизирует эффективный возврат наивно как с LIF-3i в обеих культурах фидер зависимых и фидер независимые линии загрунтовать обычных hPSC (рис. 1). Подробный протокол, описанные здесь, контуры последовательная адаптация к LIF-3i, начиная от либо hPSC фидер зависимые или свободной подачи обычных условий (например E8 средний).

Представитель результаты для LIF-3i возврат несколь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

LIF-3i система применяет модифицированную версию классической мышиных 2i наивно реверсии коктейль1 до человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Самообновлению hPSC (который не может расширить в одиночку 2i) стабилизируется в LIF-2i, дополняя этот коктейль с tankyrase ингибитор XAV939. LIF-3i культура позволяет навалом и эффективного reversion обычных hPSC плюрипотентных состояние, напоминающее человека Предимплантационная Эпибласт3. Хот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

В лицензионном соглашении между технологиями жизни и Джонс университета Хопкинса (УДХ) д-р ЗАМВИДИС имеет право на долю роялти, полученные в университете для лицензирования стволовых клеток. Условия этого соглашения находятся в ведении УДХ в соответствии со своей политикой конфликта интересов. Это не меняет приверженность авторов журнала политики по обмену данными и материалами.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантов от NIH/НЭЙ (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), ОБН Штайн Innovation Award, Фонд исследований стволовых клеток Мэриленд (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Ново Нордиск науки Форум награду и Мосли фонд.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
анти- SSEA-1/CD15 антитело, конъюгированное с APCBD Biosciences561716использовать 5µL на анализ (FACS)
анти- TFCP2L1 антителоSigma AldrichHPA029708использовать в разбавлении 1:100 (иммуноокраска)
анти-бета-Актин антителоAbcamab6276использовать в разбавлении 1:5000 (Western blot)
анти-CD146 антитело,  конъюгированное с PE BD Biosciences550315использовать 5µL на анализ (FACS)
анти-CD31 антитело, конъюгированное с APCeBioscience17-0319-42использовать 2µL на анализ (FACS)
анти-CD31 набор микроперлиMiltenyi Biotec130-091-935
анти-NANOG антителоAbcamab109250использовать в разбавлении 1:100 (иммуноокраска)
анти-NR5A2 антителоSigma AldrichHPA005455использовать в разбавлении 1:100 (иммуноокраска)
анти-p44/42 MAPK (Erk1/2) антителоCell Signaling4695использовать в разбавлении 1:1000 (Western blot), для выявления общего белка
анти-фосфо-p44/42 MAPK (Erk1/2) (антитело Thr202/Tyr204)Cell Signaling4370использовать в разбавлении 1:1000 (Western blot)
анти-фосфо-STAT3 (Tyr705) антителоCell Signaling9145использовать в разбавлении 1:1000 (Western blot)
анти-кроликовое иммуноглобулиновое антитело, биотинизированноеAgilentE0432использовать в разбавлении 1:500-1:1000 (иммуноокраска)
анти-SSEA-4 антитело, конъюгированное с APC R&D SystemFAB1435Aиспользовать 5µL на анализ (FACS)
анти-SSEA-4 GloLIVE антитело, конъюгированное с NL493R&D SystemNLLC1435Gиспользовать в разбавлении 1:50 (живая и фиксированная иммуноокраска)
анти-STAT3 антителоCell Signaling9139использовать в разбавлении 1:1000 (Western blot), для выявления общего белка
анти-STELLA/DPPA3 антителоMilliporeMAB4388использовать в разбавлении 1:50 (иммуноокраска)
анти-TRA-1-60 GloLIVE антитело, конъюгированное с NL557 R&D SystemNLLC4770Rиспользовать в разбавлении 1:50 (живая и фиксированная иммуноокраска)
анти-TRA-1-60 StainAlive антитело, конъюгированное с DyLight 488Stemgent09-0068использовать в разбавлении 1:100 (живая и фиксированная иммуноокраска)
анти-TRA-1-81 StainAlive антитело, конъюгированное с DyLight 488Stemgent09-0069использовать в разбавлении 1:100 (живая и фиксированная иммуноокраска)
анти-TRA1-60 антитело, конъюгированное с PEBD Biosciences560193использовать 10µL на анализ (FACS)
анти-TRA1-81 антитело, конъюгированное с PEBD Biosciences560161использовать 10µL на анализ (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Белок сыворотки быкаSigma AldrichA3311
буфер для разбавления CellAdhereStemCell Technologies7183разбавитель для матрицы Vitronectin XF™
мышь CF1Charles river023
CHIR99021R&D SystemL5283растворять в концентрации 100мМ в DMSO
система конфокальной микроскопииZeissLSM 510
линия iPSC, полученная из клеток CD34+ из пуповиныThermo Fisher ScientificA18945также известна как линия 6.2
тканекультуральные пробирки Corning Costar с обработкой покрытия 6-лунокCorning3506
слайд с камерой счета клеток Countess Thermo Fisher ScientificC10228
автоматический счетчик клеток CountessThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Дульбекко's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (диметилсульфоксид)Sigma AldrichD2650
мышь DR4The Jackson Laboratory3208
Среда Essential 8 (E8)StemCell Technologies5940
Фета́льная сыворотка бычьего быка (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ФорсколинStemgent04-0025растворять в концентрации 100мМ в DMSO
Желатин (свиной)Sigma AldrichG1890-100Gрастворять в воде и стерилизовать в автоклаве
Заменитель сыво

Ссылки

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203(2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838(2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LIF 3i

Похожие статьи