Pазрешено внедрение для парафиновых срезах поджелудочной островок

Краткое содержание

Ex vivo поджелудочной островок исследования имеют большое значение для исследования мочеизнурения. Существующие методы для изучения культивировали островков в их родной 3-мерной архитектуры времени, неэффективны и редко используемых. Эта работа описывает новый, простой и эффективный метод для создания высококачественных парафиновых срезах вся культивировали островков.

Аннотация

Эксперименты с использованием изолированных островков поджелудочной железы имеют важное значение для исследования мочеизнурения, но островки являются дорогостоящими и ограниченный изобилия. Островки содержат смешанные клетки населения в структурированную архитектуру, которая влияет на функции, и человеческих островках широко переменная в ячейке тип композиции. Текущий часто используемые методы для изучения культивировали островков относятся молекулярные исследования на весь островков, комков разрозненных островковых клеток типов вместе, или микроскопия или молекулярные исследования на рассредоточенных островковых клеток, нарушая островок архитектуры. В vivo исследований островок секционирование парафин врезанных поджелудочной железы – это мощный метод для оценки результатов конкретных клеток в родной среде поджелудочной железы. Изучая после культуры островков, парафин секционирование будет предлагать ряд преимуществ: обнаружение нескольких результатов на же островков (потенциально даже точное же островки, используя последовательный секции), клетки определенного типа измерений и сохранения родной островок-клеток и клеток субстрат взаимодействий во время экспериментального воздействия, а также для анализа. Однако существующие методы для встраивания изолированных островков после культуры являются неэффективным, трудоемким, склонны к потере материала и обычно производят секции с неадекватным островок чисел будут полезны для количественной оценки результатов. Клинической патологии клетки блока подготовки лаборатории являются недоступными и непрактичным для основных исследовательских лабораторий. Мы разработали улучшения, упрощенный стендовые метод, который генерирует секции с надежной урожайность и распределение островков. Фиксированной островков высокомобильна в теплых гистологические агарозном геле и накапаны в плоский диск на слайде стандартного стекла, таким образом, что островки распределены в плоскости. После стандартной обезвоживания и встраивание несколько (10 +) 4-5 мкм разделов можно вырезать из одного блока островок. С помощью этого метода, гистологические и immunofluorescent анализ может выполняться на мыши, крысы и человеческих островках. Это является эффективной, недорогой, экономящий время подход к оценке конкретного типа клеток, нетронутыми архитектура результатов от искусственного островков.

Введение

Островки Лангерганса поджелудочной железы, единственным источником циркулирующего инсулина, являются критическим ткани для следователей, изучая сахарный диабет. Из любого данного организма островки имеют переменный размер, частота типа клеток и архитектуры^1,2,3. Обычные стратегии для изучения в vivo структура и состав эндокринные клетки панкреатических островков, секционирование поджелудочной железы ткани^4,5. Так как островки составляют лишь небольшую часть общего поджелудочной железы клеточного содержания, молекулярные исследования выполняются на изолированных островков. Ex vivo островок культуры эксперименты тестирование ответ на питательных веществ, Джин модуляции (трансфекции, трансдукция), или экспериментальное лечение обеспечивают важное понимание механизмы модуляции выживание эндокринные клетки, распространением и функции ^{5 , 6}.

Ex vivo островок эксперименты часто анализируются с помощью молекулярных исследований всего островков или гистологических или молекулярных исследований дисперсных островковых клеток, выращиваемых в монослое^5,6. Молекулярный анализ всего островков представляет серьезное предостережение перемешивающий типов клеток, которые может дать ложно отрицательные или ложно положительных результатов при экстраполяции на любой тип отдельных клеток. Дисперсия клеток на coverslips для микроскопии после культуры позволяет ячейки тип конкретных результатов измерения, но разрушает островок архитектуру, которая может изменить ответ на вмешательство и исключает возможность идентификации результатов, связанных с архитектурой. Кроме того обычно только один результат может быть измерена; например для измерения бета пролиферации и гибель бета клеток на тех же условиях, должны быть выполнены два отдельных экспериментов. Эти подходы также слепы к Интер островок изменчивости, площадь растущий интерес в области. Сортировки островковых клеток подачей cytometry для клеток тип-молекулярных исследований, или одно клеточной РНК исследований элегантной, но дорого, много времени, ограничивается ткани изобилия, архитектура искоренения и не хорошо подходит для обычной клетки культуры анализы ^{5 , 7}. конфокальный изображений всего гора immunostained островков обеспечивает высокое качество нетронутыми архитектура данных, но является трудоемким, и данные, полученные от каждого образца ограничивается результаты в одном иммуноокрашивания⁸.

Возможность создания высококачественных парафиновых срезах после культуры всего островков рассмотрит многие из этих проблем. Ткани высокой стоимости, низкого изобилие островок от уникальной генетической модели или от доноров человеческих органов, или островков статус пост в естественных условиях или в пробирке экспериментально манипуляции, являются ценными. Получение нескольких парафиновых срезах же островков позволит несколько определенного типа клеток, нетронутыми архитектура анализа от же эксперимент.

Существующие методы для создания островок гранулы для разрезания несовершенны. Гистология оптимизированный агарозы является водный низкой температурой плавления гель, который широко используется в обработке гистологический и цитологический образцов, включая образцы малых или фрагментирован тканей, которые трудны для того чтобы процесс⁹. Один островок, внедрение подхода – приостановить островки в агарозы в пробки microcentrifuge, центрифуга гранул материал, извлечь штекер агар, а затем обрабатывать и внедрить для разрезания^10,11. Извлечение затвердевших образца от нижней части трубки является трудоемким и сложным, приводит к фрагментации случайные выборки и риска травмирования. Островки сосредоточены в кончик вилку, приводит к неадекватным островок распределения в разделах, полученные из этого метода. Раунда нижней вилки осложняет внедрение таким образом, что островок плохой региона могут быть представлены для разрезания. В целом этот метод приводит к низкой урожайностью и распределения скомканным островок в результате секции.

Этот новый метод представляет собой упрощенный и Улучшенный подход для подготовки разделов островок. Островки сосредоточены в небольшом объеме и затем помещается на гладкой поверхности микроскопа сформировать небольшой диск, с островками в одной плоскости. Диск Histogel островок впоследствии обработаны для парафина, встраивание в укороченной обезвоживания и ксилол инфильтрации протокол. Предыдущий подход, который концентрируется островков в нижней части трубки отцентрифугировать, осуществляется также как сравнение. Эта новая методика повышает доходность островков в каждой секции, распределение островков в каждом разделе и занимает меньше времени для передачи блоков островок для кассет. Этот метод полезен для биологов островок или другие ученые, изучающие небольшие кусочки ткани, желающих максимально продуктивной использовать низкий обилие ткани путем измерения несколько результатов на один образец в своей родной ткани архитектуры.

Протокол

Все процедуры с участием животных были утверждены UMass медицинской школы помощи для институционального животных и использования Комитетом. Человека островок исследования были определены Советом UMass институционального обзора не претендовать на обзор IRB или освобождение, потому что они не связаны с использованием человеческих субъектов.

1. островок изоляции и культура

1. Изолировать островков и отдельно от загрязнения экзокринной и протоковой ткани, используя метод по вашему выбору.
   Примечание: Этот метод был оптимизирован с помощью островков, изолированные протоковой инсуффляции коллагеназы и Ficoll разделения¹² (грызунов) или послеотгрузочное островков из комплексной программы распределения островок (IIDP¹³; человека). Островки были подобраны с микропипеткой P200.
2. Чтобы оптимизировать островок морфологии, позволяют островков восстановить всю ночь в 10 мл полный островок среднего (RPMI с 10% FBS, пенициллин/стрептомицина и глюкозы 5,5 ммоль/Л) в увлажненные камере, содержащей 5% CO₂ при 37 ° C. Хотя этот шаг не требуется для получения секций, островки более нетронутыми после периода восстановления (см. Рисунок 2).

2. островок фиксации

1. С помощью кончика Р200 низкий привязки, handpick приблизительно 250 островок эквиваленты (IEQ)¹³ с помощью калиброванного сетки под стереомикроскопом в 1,5 мл трубку низкой привязки отцентрифугировать. Низкий привязки советы и трубки уменьшить потери островок.
2. Разрешить островков поселиться в нижней части трубки отцентрифугировать. Удаление большинство супернатант с кончиком пипетки Р200, стараясь не удалять любые островков.
3. Добавьте 1 mL PBS. Центрифуга трубки в центрифугу размахивая ведро, до тех пор, пока скорость достигает 200 x g и затем остановить отжим. Удалите супернатант. Повторите PBS мыть, для в общей сложности двух стирок.
4. 500 мкл раствора формалина 10% или 4% свежеприготовленные параформальдегида. Исправить при комнатной температуре за 30 минут. Для исходов испытания в этом методе эти методы фиксации неразличимы. Короче, фиксации также может быть возможным; рекомендуется оптимизировать длительность фиксации для желаемого результата.
5. Снимите фиксатор с наконечником P200.
6. Добавьте 1 mL PBS. Центрифуга трубку до тех пор, пока скорость достигает 200 x g и затем остановить отжим. Удалите супернатант. Повторите PBS мыть, для в общей сложности двух стирок.
7. Немедленно приступить к следующему шагу.

3. Подготовка островок диска (рис. 1)

1. При первом использовании расплавить гель (например, Histogel) при 70 ° C и аликвоты в 1,5 мл отцентрифугировать трубы для длительного хранения. Аликвота объем не является критическим, поскольку аликвоты может быть повторно использован.
2. Теплый гель (примерно 100 мкл на сэмпл) при 70 ° C, поместив отцентрифугировать трубка, содержащая Алиготе гель в блоке тепла, равным 70 ° C.
3. Перевод агарозы синий бисер (10 мкл для каждого образца) на 1,5 мл чистого отцентрифугировать. Тщательно Ресуспензируйте бисер перед закупорить.
   Примечание: Синий бисер смешиваются с островков для оказания помощи в визуальной идентификации встроенных материала в кнопке агарозы и блоком парафина. Количество синий бисер используется не имеет решающее значение для результатов, но избежать чрезмерного бусины (> 5 x количество островков) для обеспечения оптимального распределения островков в разделах.
4. Вымойте синий бисер с 1 мл PBS, дважды. Для каждой стирки отжима бусы 1 мин на 800 x g. После второго мыть Ресуспензируйте бусины в (n+ 2) x 10 мкл PBS, где n — количество образцов труб; например для 2 образец трубки, объем PBS для добавления бисера будет 40 мкл.
5. Центрифуга отцентрифугировать трубка, содержащая островков (краткое спин-200 x g) и удалить большую часть супернатант. Отрезать кончик кончик микропипеткой 10 мкл с ножницами или ножом и 10 мкл бусы для каждого островка трубки, с использованием чистой подсказка для каждого образца. Не следует смешивать (чтобы избежать потери островков).
6. Центрифуга островков и бусы (краткое спин-200 x g). Удалите столько PBS как можно с наконечником микропипеткой режиссерский 10 мкл.
7. Ярлык Микроскоп слайды для идентификации образца. Два-три образцы могут быть подготовлены на каждом слайде. Место слайда на скамейке возле блока тепла с утепленным гель. Вырежьте советы трех-пяти 20 мкл низкой привязки микропипеткой советы на сэмпл с бритвой или ножницами. Загрузите два micropipettes P20 с сократить советы, чтобы позволить быстрый переход от одного к другому.
8. Используя первый микропипеткой, добавьте 15-20 мкл теплый гель островков/бусы отцентрифугировать трубки; сразу смешать, избегая пузыри; и применять смесь жидких агар/островков/бусы на слайд в форме < диск диаметром 1 см. Поместите диск на краю слайда, оставляя пространство для кольца внешних гель (следующий шаг). Коснитесь слайда, нежно несколько раз урегулировать островков и бусины.
9. С помощью второй микропипеткой, добавьте 20 мкл теплый гель образец трубки. С помощью первого микропипеткой, новый гель микс любые оставшиеся островки/бисером, повторно потепления в блоке тепла, если он начинает затвердеть, затем применить эту смесь к слайду, окружающих оригинальный диск. Повторите по мере необходимости, с использованием дополнительных нарезанные советы, пока диск не будет нужного размера и толщины.
   Примечание: Обработка загущенное диск упрощается, если внешнего кольца немного толще. Как правило 3 x 20 мкл геля является достаточным. Этот шаг минимизирует потери островков, трубка моет и добавляет островок плохой агарозы для внешнего диска для облегчения обработки диска.
10. Подготовка каждого диска индивидуально и тщательно отслеживать заказа образца если размещение нескольких дисков на каждом слайде.
11. Место слайды на плоской поверхности мокрого льда, с крышкой, 10 минут или до тех пор, пока гель затвердевает. Это более трудно сдвиньте диск у стекла, если она высыхает.
12. Биопсия метка обработки/встраивание ткани кассеты с карандашом, один на сэмпл. Сухой задней части слайда, чтобы избежать смачивания голубой бумаге.
13. Использование тупой край лезвия бритвы, аккуратно вставьте диск в каждом направлении, чтобы освободить его от стекла. Когда он скользит легко, медленно толкать диск от микроскопа на голубой бумаге ткани. Поместите диск плоской стороной вниз, прямо на бумаге.
14. Сохранение на диск плоский, согните бумагу вокруг диска, чтобы предотвратить движение, поместите диск в бумаги в кассету и закрыть кассеты. Если диск не чисто соскальзывать стекла, добавить больше гель и/или возвращения на слайд, чтобы лед за несколько минут.
15. Опускайте кассету в PBS в стакан. Процесс для парафина, встраивание в тот же день для оптимального морфологии.

4. парафин встраивание

Примечание: Процесс островок гель диски парафиновых блоков с помощью сокращенного обезвоживания серии, как описано ниже. Эта техника была оптимизирована с помощью автоматизированных процессора, но ручной обработки следует производить аналогичные результаты.

1. Погружайте кассеты в 85% этанола на 15 минут.
2. Погружайте кассеты в 95% этаноле на 15 минут.
3. Погружайте кассеты в 100% этанола на 15 минут. Повторите дважды для в общей сложности три автомойки.
4. Погружайте кассеты в ксилоле на 15 минут. Повторите дважды для в общей сложности три автомойки.
5. Погружайте кассеты в расплавленный парафин для 10 минут.
6. Трансфер кассеты свежий расплавленный парафин для 10-30 минут.
7. Тщательно открыть кассету и развернуть голубой бумаге. Удалите диск гель, следить за плоскую поверхность, которая выступает на бумаге. Внедрить диск в малые формы, с плоской поверхности (островок содержащие) вниз, параллельно режущей поверхности. Для вилки тщательно удалить его из кассеты и вставлять его в небольшой плесень с наконечником, указывая на режущей поверхности.

5. Парафинотерапия секционирование и окрашивания

1. Ярлык слайды последовательно, если требуются последовательные секции.
2. Иметь 5 мкм парафиновых срезах сократить на опытных histotechnologist. Чтобы увеличить урожайность, сохраните все разделы, содержащие материал. Как правило сбор 20 секций позволяет захвата большинства материала.
3. Хранить разделы при комнатной температуре. Секции поддаются обычной гистологические пятна (например, H & E) и иммунофлюоресценции (например, инсулина, глюкагона и DAPI). Оптимизируйте фиксации для других антигенов, в случае необходимости.

Результаты

Иллюстрированная схема шаги, чтобы подготовить диск гель показан на рисунке 1. Этот диск гель результаты метода в парафин разделы, которые содержат достаточное количество островков, распределенных в одной плоскости, чтобы позволить значимые количественная оценка результатов. Рисунок 2 показывает низкий увеличение изображения результате секций для иллюстрации количество островков, захвачен в каждой секции. В общем > 35 островко...

Обсуждение

Этот измененный гель диск на основе внедрения метод обеспечивает простой, недорогой и эффективным способом для создания высокодоходных островков в каждой секции. Строительство гель диск на поверхности плоского стекла облегчает распространение островков в равномерное распределение более четко определенной области. Распространяя островков в плоский диск предлагает преимущество размещения много островков в плоскости сечения, оптимизации доходности и позволяет меньше островков, которые будут использоваться. Толщина диска мож...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,5 мл пробирка Eppendorf	Norgen Bioteck Corp	артикул 10113
Ранин Классический Стартовый Набор	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Наконечник с низким связыванием (1000 μ L)	Genesee Scientific	24-430
Наконечник с низким связыванием (200 μ L)	Genesee Scientific	24-412
Наконечник с низким связыванием (20 μ L)	Genesee Scientific	24-404
Наконечник с низким связыванием (10 μ L)	Genesee Scientific	24-401
10% раствор формалина	Sigma	HT501128
Параформальдегидная	электронная микроскопия Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Агарозные синие шарики - Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Кассета для обработки тканей	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 Тканевый процессор	Thermo-Shandon LLC
Этанол 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Ксилол	Fisher Chemical	X5SK-4
Парафин	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Антитело к инсулину	DAKO	A0564
Антитело к глюкагону	Sigma	G2654
Fluoroshield с DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 вторичных антитела	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 вторичных антител	Life technologies	A11001