Экспериментальный протокол для изучения поведенческих реакции профили в личинок рыб: Приложение к кофеину нейро стимулятор

Summary

Здесь мы представляем протокол для изучения личиночной данио рерио и толстоголового гольян опорно-двигательной деятельности и photomotor реакции (PMR) с помощью автоматического отслеживания программного обеспечения. Когда включены в общей токсикологии bioassays, анализ этих поведений обеспечивают диагностический инструмент для изучения химические препараты. Этот Протокол описан с помощью кофеин, модель neurostimulant.

Abstract

Поведение и рыбы модели все чаще используются в биомедицинских науках; Однако рыбы уже давно предметом экологической, физиологические и токсикологических исследований. С помощью автоматических платформ цифровой отслеживания, используя недавние усилия в neuropharmacology личинок рыб двигательного поведения для выявления потенциальных терапевтических целей для Роман малых молекул. Похож на эти усилия, исследования в области экологических наук и сравнительных Лекарствоведение и токсикология изучает различные варианты поведения рыбы моделей как средства диагностики в многоуровневой оценки загрязнителей и в реальном времени мониторинг поверхностных вод для угрозы загрязнения. В то время как zebrafish модель популярного личинок рыб в биомедицинских науках, толстоголовых гольянов — это общая модель личинок рыб в экотоксикологии. К сожалению толстоголового гольян личинки получили значительно меньше внимания в поведенческих исследований. Здесь, мы разрабатываем и продемонстрировать Поведенческий профиль протокол, с помощью кофеина как модель neurostimulant. Хотя иногда photomotor ответы толстоголового гольяна пострадали от кофеина, данио рерио были заметно более чувствительным для двигательного конечных точек, которые ответили на экологически значимых уровнях и photomotor. Будущие исследования необходимо понимать различия сравнительных поведенческих чувствительность среди рыб с возрастом и время суток и определить, является ли аналогичные поведенческие эффекты встречаются в природе и свидетельствовать о неблагоприятных исходов на индивидуальном или населения уровни биологической организации.

Introduction

Хотя рыбы модели все чаще используется для биомедицинских исследований, рыбы регулярно использовались для экологии и физиологии исследований, изучения загрязнения поверхностных вод и понять токсикологические пороговых уровней химических веществ. Такие усилия имеют важное значение, потому что химическое загрязнение может повредить водных экосистем и ухудшению качества источника водоснабжения^1,2. Большинство химических веществ, однако, отсутствие даже основные токсикологии информации³.

Животные модели традиционно используется в тестировании регулирования токсичности являются ресурсоемкими и не может обеспечить высокую пропускную способность, раннего скрининга уровня, необходимые для тестирования в XXI веке⁴токсичность. Впоследствии существует растущий импульс принять и использовать модели в пробирке , которые могут более оперативно и эффективно экран соединений для биологической деятельности^3,5. Хотя ячейки на основе модели представляют множество возможностей, они часто не хватает биологических сложности и таким образом не учитывается для многих важных весь организм процессов, включая обмен веществ⁶.

Данио рерио — это общая модель биомедицинских животных, которая набирает популярность как альтернативная модель в водной токсикологии и экотоксикологии^7,8. Учитывая их небольшого размера, быстрое развитие и высокая плодовитость, рыба модели могут использоваться для быстро и эффективно экран химикаты для биологическую и токсичности в масштабе всего организма⁹. С помощью автоматизированного отслеживания программного обеспечения личинок данио рерио поведения обеспечивают расширенные диагностические утилиты в отбора загрязнителей для токсичности^10,11. Исследования в области фармацевтических наук показали, что опорно конечные точки являются информативными химических механизмов действий, могут использоваться для поведения фенотип и затем может предварительно определить субцеллюлярные цели для новых молекул^{12, 13}. В то время как zebrafish модель популярного личинок рыб в биомедицинских науках, толстоголовых гольянов является общей, экологически важные рыбные модель, которая используется для исследования экотоксикологии и в ходе будущих (например, новые химические оценки) и ретроспективы (например, окружающего поверхностных вод или мониторинг сточных сточных вод) экологических оценок. К сожалению поведенческие реакции личиночной толстоголового гольяна получили значительно меньше внимания, чем у рыбок данио. Наши текущие исследования с двух распространенных моделей личинок рыб, данио рерио и толстоголового гольян, свидетельствует о том, что личинок рыб плавательный Шаблоны появится уникальная ожидаемого режимы или механизмов действий для различных химических веществ. Таким образом поведенческие конечные точки предоставляют возможности быстро и деликатно изучение химических веществ на токсичность и определить субцеллюлярные цели для промышленных химических веществ и других загрязнителей, особенно во время ранних оценок уровня.

Здесь мы приводим протокол для изучения поведенческих реакции профили в личинок рыб. Мы продемонстрировать эти методы, используя кофеин, модель neurostimulant и общих водных загрязнений, который вводится для водных систем путем сброса сточных вод лечения растений после употребления в пищу продуктов питания, напитков, и Фармацевтика, сформулированы с кофеин¹⁴. Мы рассмотрим поведенческие реакции на кофеин личиночной данио рерио и толстоголовых гольянов, включая внезапные изменения в условия освещения, который часто называют photomotor ответ (PMR) во время фармацевтические исследования эмбриональных и личинок Данио рерио^13,15. Мы далее определить эффекты кофеина через несколько опорно конечных точек для разработки химической реакции профили для каждой модели рыбы. Кофеин лечения уровни, используемые в данном исследовании представляют собой верхний процентилей воздействия дистрибутивы, основанные на экологических измерений кофеин¹⁶. Мы также включают лечения оценивали личинок рыб LC₅₀ значений, и значение терапевтического опасности (THV), фармацевтической концентрации в воде, как ожидается, привести к плазме крови рыб в соответствии с человеческой плазмы терапевтической дозе.

Protocol

Исследования в настоящем Протоколе как правило следовать стандартизированных экспериментальный дизайн и статистического анализа рекомендации от нас охране окружающей среды (EPA № 2000.0) для толстоголовых и Организации экономического сотрудничества и Развития (ОЭСР № 236) для рыбок данио. Эти экспериментальные проекты (например, увеличивая репликации) могут быть изменены в течение текущего протокола для будущих исследований. Рыбоводства, условия следовать ранее опубликована литература¹⁷. Все экспериментальные процедуры и рыбы протоколы культуры за институциональный уход животных и использование Комитета протоколы, утвержденных в Университете Бейлор.

1. выявление рыбы для химической обработки

1. Подготовьте кофеин воздействия решений путем растворения кофеина в восстановленный жесткой воды. Выполните соответствующие серийных разведений путем разбавления выше кофеин лечения с жесткой водой для получения более низких уровней лечения кофеин.
   Примечание: В таблице 1 приведены каждого из уровней лечения, используемых в этом эксперименте.

	Данио рерио			Толстоголового
Лечение	Концентрация номинальная кофеина (мг/Л)	Концентрация измеряемых кофеина (мг/Л)	Лечение	Концентрация номинальная кофеина (мг/Л)	Концентрация измеряемых кофеина (мг/Л)
Управления	0	< Лод	Управления	0	< Лод
75-й перцентили *	0.001	0.001	75-й перцентили *	0.001	0.001
95-й перцентили *	0.039	0.013	95-й перцентили *	0.039	0.009
99-й перцентили *	0,412	0.361	99-й перцентили *	0,412	0.310
THV	4.07	3.81	THV	4.07	4.12
10% ЛК50	48,46	46.66	10% ЛК50	14.1	14.7
40% ЛК50	193.82	186.67	40% ЛК50	56.38	53.91

Таблица 1: экспериментальный кофеин лечения для экспериментов гольян данио рерио и толстоголового. Номинальный и измеренных значений кофеина для каждого лечения даются. * Кофеин процедуры, используемые в данном исследовании представляют собой верхний процентилей воздействия дистрибутивы, основанные на экологических измерений кофеин¹⁶. THV: Терапевтический опасности значение. Лод: Предел обнаружения

2. Приготовленный раствор вливают champers индивидуального воздействия. Использование 100 мл стеклянные стаканы заполнена с 20 мл раствора экспозиции для данио рерио экспозиции камеры и 500 мл стаканы с 200 мл раствора экспозиции для толстоголовых гольян экспозиции камеры.
3. Использование пипетки передачи, место 10 данио рерио эмбрионов возрасте 4-6 ч пост оплодотворение (hpf) в каждой из четырех палат реплицировать экспозиции за лечение.
4. Личинки гольян толстоголового место 10 лет в течение 24 ч штриховки в каждой из трех камер реплицировать экспозиции за лечение. Чтобы вместить больший размер толстоголового гольян личинок, Отрежьте кончик передачи пипетку до передачи.
5. Поддерживать данио рерио экспериментов на свет: темные фотопериода 16:8 h и постоянной температуре 28 ± 1 ° C. Используйте один и тот же режим фотопериода толстоголового гольян исследований, но при температуре 25 ± 1 ° C.
6. После 96 h воздействия химических веществ хорошо пластины нагрузки отдельных рыб в отдельных скважинах 48 (для данио рерио) и 24 (для толстоголовых гольянов).
   1. Чтобы убедиться, что каждый хорошо содержит одинаковый объем раствора, передать 5000 мкл autopipette для 1000 мкл тома за хорошо 48 хорошо пластины данио рерио личинки. Используйте autopipette снимать и передавать данио рерио личинок и воздействия решения одновременно.
   2. Из-за их больших размеров передачи толстоголового гольян личинки с помощью пипетки передачи с кончиком, отрезали. До передачи толстоголового гольян личинки отдельных скважин, заполните каждый хорошо до 2000 мкл, с помощью autopipette. При передаче отдельных толстоголового личинки скважин, место кончиком пипетки передачи в решении хорошо и позволяют рыбы плавать от кончика пипетки в колодец.

2. Калибровка видео отслеживания параметров

1. До поведенческих мер, установить параметры наблюдения и калибровки программное обеспечение видео-трек (см. таблицу материалы).
   1. Место хорошо пластины в камере записи с по крайней мере 1 личинок рыб в отдельных хорошо. Используйте пластину и ассоциированных рыб как представления установить параметры калибровки.
   2. В программное обеспечение видео-трек, нажмите кнопку «файл | Генерировать протокол», который откроется диалоговое окно «Мастер создания протокола». В поле «Местоположение Count» введите количество скважин лиц хорошо пластины и нажмите кнопку «ОК».
   3. В верхней части экрана, нажмите кнопку «Просмотр | Полный экран», который предложит систему для отображения верхней камеры хорошо пластины.
   4. Щелкните значок «Рисовать районах», которая выглядит как три разноцветных фигур. Справа от хорошо пластины, области просмотра выберите значок круга в поле с надписью «Областях».
   5. Используйте курсор, чтобы разграничить круговой видео отслеживания области в верхней левой хорошо хорошо пластины. Выберите «Сверху-справа Марка» и затем наметить области просмотра верхней правой хорошо. Затем выберите «Нижней марка» изложить в нижней правой хорошо.
      Примечание: После нанесения круговой контур, его позиции будут скорее всего нужно корректироваться.  Чтобы скорректировать положение контура, нажмите кнопку «Выбрать» и затем использовать курсор для перемещения области изложил. Кроме того контуры можно реплицировать, нажав кнопку «Копировать» и затем «Вставить».
   6. После того, как вверху слева, справа, вверху и внизу справа также отслеживание областей были определены, нажмите кнопку «Построить» запрашивать программное обеспечение автоматически определить области просмотра оставшихся скважинах.
   7. В область с надписью «Калибровка» нажмите кнопку «Рисовать шкала». Используйте курсор, чтобы нарисовать горизонтальную линию через пластину. После того, как рисуется линия, появится диалоговое окно с надписью «Калибровки измерений». Введите длину хорошо пластины и нажмите кнопку «ОК».
   8. Выход из рисования менеджер, щелкнув значок «Рисовать районах».
   9. Щелкните значок «Плитка».  С помощью курсора, выделите все поля, которые появляются на экране просмотра, так что каждый ящик имеет зеленый цвет.
      Примечание: Плитки значок отображается как группа из шести отдельных малых квадратов
   10. «Выберите вид | Полный экран».  Справа от плиты, области просмотра нажмите кнопку «Bkg» в поле «Порог обнаружения». Используйте панель перестройки порог для задания порога обнаружения пикселей. Однажды, порог обнаружения соответствующий пиксель выбран, нажмите кнопку «Применить в группу».
       Примечание: Этот Протокол устанавливает порог обнаружения на 13 в черном режиме данио рерио наблюдений и 110 в прозрачном режиме для толстоголовых гольян наблюдений.
   11. В поле с надписью «Движение порог» введите желаемый движения скорость, параметры отслеживания. После того, как скорость параметры заданы, нажмите кнопку «Применить в группу».
       Примечание: Этот Протокол устанавливает мелкие/крупные движения на 20 мм/сек и неактивные и малых движений на 5 мм/сек. Выбранные программы программное обеспечение, отслеживать движение личинок рыб на трех уровнях различные скорости: неактивные (замораживание) = < 5 мм/сек, небольшая (круиз) = 5 – 20 мм/сек и большой (разрыва) = > 20 мм/сек.
   12. Нажмите кнопку «Параметры | ««Протокол параметров» из раскрывающегося меню. В диалоговом окне выберите закладку «Время» введите время наблюдения и интеграции. После ввода параметров нажмите кнопку «ОК».
   13. Чтобы установить свет/темно фотопериода раз и интенсивности света для каждого фотопериода открыть настройки света драйвера диалога окно, выбрав «Свет вождения» от «Параметры» в раскрывающемся меню.
       Примечание: Смотрите видео протокол для установки нескольких свето тени фотопериоды.
   14. После того, как были установлены параметры видео-слежения, сохраните протокол наблюдения.
       Примечание: Этот протокол отмечает поведение рыб в течение 50 мин, который включает в себя 10 мин адаптационного этапа, следуют 4, изменяя фазы свет/темно, состоящий из двух периодов света 10 мин и два темных периодов 10 мин. Время интегрирования установлен для измерения поведение за каждую минуту поведенческих суда 50 мин.

3. наблюдение за личинок рыб опорно-двигательного аппарата и Photomotor поведение

1. Место хорошо пластины, содержащие экспериментальной рыбы в зале поведенческих записи.
2. В видео, отслеживания программного обеспечения откройте отслеживания протокол, разработанный в шаге 3.
3. В средстве просмотра видео-слежения проверьте, чтобы убедиться, что все личинки видны на экране компьютера, что только одна личинка отдельных присутствует в каждом хорошо, и что отдельные колодцы выровнены в пределах зон наблюдения, которые были определены в шагах 2.1.5 и 2.1.6.
4. Нажмите на «эксперимент | Выполнение».
   Примечание: Система предложит пользователю ввести имя и расположение для сохранения данных наблюдения.
5. Как только имя и сохранить расположение наблюдения были указаны данные, нажмите на значок «Несколько образов Live», чтобы выделить все предопределенные просмотра области
   Примечание: Этот значок расположен в верхней части экрана и отображается как поле разделено на четыре меньших квадратов. Нажав на этот значок будет выделить все предопределенные просмотра областей.
6. Закройте панель камеры запись и нажмите кнопку «фон | Старт» на мониторе компьютера.

4. анализ поведенческих данных

1. Для извлечения данных деятельности личинок рыб, откройте таблицу, которая автоматически компилируется путем отслеживания программного обеспечения и находится в папке, указанной пользователем перед началом поведенческих исследований (шаг 3.4).
2. Обратитесь к цифры 1A и 1B для представителя измерений наивно двигательной активности неэкспонированные данио рерио и толстоголового гольян личинок, соответственно. Обратитесь к цифры 1 c и 1 D для ПМР расчетов, которые эффективно изучить масштабы движения разницу между свет на темные или темно, свет переходы.

Рисунок 1: Пример базовой деятельности неэкспонированные данио рерио (A и B) и толстоголовых гольянов (C и D). Среднее (± SEM) расстояние поплыл за данио рерио (A) и толстоголовых гольянов (C) дается точек каждый представляет один минутные интервалы деятельности. Измеряются два темных и два светлых периодов photomotor ответов. Последний (, c, e и g) и (b, d, f и h) минуту каждого фотопериода используются для вычисления реакции своевременное. Photomotor данио рерио (B) и толстоголовых гольянов (D) измеряются как изменения в среднее (±SEM), расстояние между последней минуты первоначальный фотопериода и первая минута следующего периода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Results

Кофеин лечения уровень существенно не менялась в течение 96 ч эксперименты с данио рерио и толстоголового гольяна. Например в таблице 1 представлены аналитически проверенных концентрации каждого уровня лечения. Этот протокол проверены изотопного разбавления жидкостной хроматографии тандемные масс-спектрометрия (LC-MS/MS) обычно после сообщалось ранее методы²⁸пробы воды для лечения уровень кофеина. Формирование paraxanthine, основной метаболит кофеина, также количественно. Описание этих аналитических процедур приводится в дополнительном аналитической информации. Из-за сходства между номинальной и аналитической проверки процедур номинальный лечения уровни представлены на протяжении оставшейся части этой рукописи. Кофеин значительно изменила поведение данио рерио и толстоголового гольян. Однако данио рерио опорно ответы были последовательно, более чувствительны к кофеину, чем толстоголового гольяна. Наиболее чувствительные поведенческих конечные данио рерио и толстоголового гольян личинки были затронуты кофеин в концентрации 0,039 мг/л в таблице 2 резюмируются Низкий наблюдаемый эффект концентрации (НУНВ) и не наблюдается эффект концентрации (NOEC) для каждого поведения конечной точки в обеих моделях рыбы.

Данио рерио			Толстоголового
Конечная точка	НКНВ (мг/Л)	КННВ (мг/Л)	Конечная точка	НКНВ (мг/Л)	КННВ (мг/Л)
Общее расстояние темный	0,412	0.039	Общее расстояние темный	−	56.38
Общее расстояние свет	48,46	4.07	Общее расстояние свет	−	56.38
Общее количество темный	0,412	0.039	Общее количество темный	−	56.38
Общее количество света	48,46	4.07	Общее количество света	−	56.38
Разрывной расстояние темный	−	193.82	Разрывной расстояние темный	−	56.38
Разрывной расстояние свет	193.82	48,46	Разрывной расстояние свет	−	56.38
Разрывая подсчитывает темный	193.82	48,46	Разрывая подсчитывает темный	−	56.38
Разрывной графов свет	193.82	48,46	Разрывной графов свет	−	56.38
Разрывной продолжительность темный	193.82	48,46	Разрывной продолжительность темный	−	56.38
Разрывной продолжительность света	−	193.82	Разрывной продолжительность света	−	56.38
Курсируя расстояние темный	0,412	0.039	Курсируя расстояние темный	−	56.38
Курсируя расстояние свет	48,46	4.07	Курсируя расстояние свет	−	56.38
Курсировать подсчитывает темный	0,412	0.039	Курсировать подсчитывает темный	−	56.38
Курсируя графов свет	48,46	4.07	Курсируя графов свет	−	56.38
Курсируя продолжительность темный	0,412	0.039	Курсируя продолжительность темный	−	56.38
Курсируя продолжительность света	48,46	4.07	Курсируя продолжительность света	−	56.38
Замораживание расстояние темный	0,412	0.039	Замораживание расстояние темный	0.039	0.001
Замораживание расстояние свет	0.039	0.001	Замораживание расстояние свет	−	56.38
Замораживание подсчитывает темный	0,412	0.039	Замораживание подсчитывает темный	−	56.38
Замораживание подсчитывает света	48,46	4.07	Замораживание подсчитывает света	−	56.38
Замораживание продолжительность темный	−	193.82	Замораживание продолжительность темный	56.38	14.10
Замораживание продолжительность света	48,46	4.07	Замораживание продолжительность света	−	56.38
Темный 1 ПМР	48,46	4.07	Темный 1 ПМР	0.039	0.001
Свет 1 ПМР	48,46	4.07	Свет 1 ПМР	−	56.38
Темный 2 ПМР	48,46	4.07	Темный 2 ПМР	−	56.38
Свет 2 ПМР	48,46	4.07	Свет 2 ПМР	−	56.38
Разрывной темный 1 ПМР	−	193.82	Разрывной темный 1 ПМР	−	56.38
Разрывая свет 1 ПМР	−	193.82	Разрывая свет 1 ПМР	−	56.38
Разрывая темные 2 ПМР	193.82	48,46	Разрывая темные 2 ПМР	−	56.38
Разрывая свет 2 ПМР	−	193.82	Разрывая свет 2 ПМР	−	56.38
Курсируя темный 1 ПМР	48,46	4.07	Курсируя темный 1 ПМР	−	56.38
Курсировать свет 1 ПМР	48,46	4.07	Курсировать свет 1 ПМР	−	56.38
Курсируя темные 2 ПМР	48,46	4.07	Курсируя темные 2 ПМР	−	56.38
Курсируя свет 2 ПМР	193.82	48,46	Курсируя свет 2 ПМР	56.38	14.10
Замораживание темный 1 ПМР	48,46	4.07	Замораживание темный 1 ПМР	−	56.38
Замораживание свет 1 ПМР	193.82	48,46	Замораживание свет 1 ПМР	−	56.38
Замораживание темные 2 ПМР	48,46	4.07	Замораживание темные 2 ПМР	−	56.38
Замораживание свет 2 ПМР	193.82	48,46	Замораживание свет 2 ПМР	−	56.38

Таблица 2: данио рерио и толстоголового гольян поведенческих NOEC и НКНВ кофеина. Не наблюдается эффект концентрации (NOEC) и низкая наблюдается эффект концентрации (НКНВ) (мг/Л) значения для каждого из свет/темно плавание деятельности конечные точки и photomotor ответ для данио рерио и толстоголовые гольяны воздействию кофеина. Тире показывают, что нет эффекты наблюдались на конкретной конечной точки на всех уровнях лечения.

На рисунке 2 представлены общей двигательной активности и своевременное данио рерио и толстоголового гольян, после 96 h воздействие кофеина. В zebrafish пострадали толстоголового гольян личинки, что своевременное были изменены кофеина на более низких уровнях (0,038 мг/Л) лечение чем данио рерио, но заметно большее количество photomotor конечных точек. Самый высокий уровень лечения кофеина (193.82 мг/Л) изменены ПМР в данио рерио, в котором эти ответы были точно противоположный от элементов управления. Однако, на этом уровне повышенных лечения, своевременное снизилась в темноте и возросла в условиях освещения.

Рисунок 2: Плавательный активность и photomotor ответы данио рерио (A и B) и толстоголовых гольянов (C и D) после 96 h воздействие кофеина. Среднее (± SEM) расстояние поплыл за данио рерио (A) и толстоголовых гольянов (C) дается точек каждый представляющая интервалы 1-мин деятельности. Photomotor ответы данио рерио (B) и толстоголовых гольянов (D) измеряются как изменения в среднее (± SE) общее расстояние между last minutes первоначальный фотопериода и первая минута следующего периода. Два темных и два легких периода photomotor ответы были измерены. В общей сложности 24 данио рерио (4 репликация каждого 6 личинок) и 12 (3 репликация каждого 4 личинок) толстоголовые гольяны были использованы для поведенческие наблюдения. p < 0,10; p < 0,05; p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Помимо измерения личиночной своевременное, светлых и темных двигательной активности был проанализирован через три скорость пороговые значения расстояния переехал, количество движений и продолжительность движения. Эти данные используются для разработки профилей поведенческие реакции для кофеина (рис. 3, дополнительный Рисунок 1). В обоих моделей рыбы кофеин препятствует деятельности вообще существенно повлияло опорно конечных точек. Обе рыбы модели продемонстрировали увеличение активности на разрывной скорость пороги, после воздействия на кофеин, хотя и не существенно. Аналогичные результаты наблюдений ПМР, кофеин осуществлено большее количество данио рерио опорно конечных точек. В самом деле кофеин значительно изменила несколько опорно ответы в темных условиях на экологически реалистичных уровней ниже THV. Однако толстоголового гольян двигательной активности не пострадал значительно в легких условиях на любом уровне лечения.

Рисунок 3: ответ профили личиночной данио рерио и толстоголового гольяна после выдержки в течение 96 ч к кофеину. Означает, данио рерио темный (A) и света (B) плавание активности по сравнению с означает толстоголовых гольянов темный (C) и света (D) деятельность после 96 h воздействие кофеина. Печать данных представляет деятельность двух темных фотопериоды 10 мин и два 10 мин легкой фотопериоды для каждой модели рыбы. Данные нормируется для управления, которое представляет на оси 0 в каждом рисунке. Поведенческие параметры включают расстояние, количество движений (СИГ) и продолжительность каждого движения переплывали 3 уровней скорости, разрывая (> 20 мм/сек), крейсерская (5 – 20 мм/s) и замораживания (< 5 мм/сек). Кроме схем движения на каждой скорости порогов общее расстояние купались, и представлено общее количество движений. ↑ представляет собой значительное увеличение активности по сравнению с контролем и ↓ показывает значительное снижение активности по сравнению с контролем. В общей сложности 24 данио рерио (4 репликация каждого 6 личинок) и 12 (3 репликация каждого 4 личинок) толстоголового где используются в поведенческих наблюдений для каждой группы. p < 0,10; p < 0,05; p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные рисунок 1: Photomotor ответы данио рерио (A и B) и толстоголовых гольянов (C и D) через три скорости порогов. Данио рерио (A, B и C) и толстоголового гольян личинки (D, E и F) photomotor ответы через три скорости порогов (замораживание: 20 мм/сек) после 96hr воздействие кофеина. Photomotor ответы данио рерио и толстоголового гольян измеряются как изменения в среднее (±SE) общее расстояние между last minutes первоначальный фотопериода и первая минута следующего периода. Два темных и два легких периода photomotor ответы были измерены. В общей сложности 24 данио рерио (4 репликация каждого 6 личинок) и 12 (3 реплицирует 4 личинок) толстоголовые гольяны были использованы для поведенческие наблюдения. * p < 0,01 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

При выборе уровня химической обработки для исследования поведенческих токсикологии, должны рассматриваться ряд факторов. Лечения уровень кофеина в настоящем исследовании были отобраны на основании перцентили верхнего значения для прогнозируемого воздействия на окружающую среду сценариев из сточных вод и стоков¹⁶. Когда это возможно, мы регулярно выбрать лечение уровни для водной токсикологии исследования с использованием вероятностного воздействия оценки экологических наблюдений^19,,2021. THV, которая вычисляется для лекарственных средств, также было включено в качестве лечения уровень в настоящем исследовании. THV значения (уравнение 1)^22,23 , определяются как предсказано водных концентраций приводит к человека терапевтических дозах (Cmax) фармацевтических препаратов в рыбы²³, вдохновили от первоначального плазмы, моделирования усилия²⁴и являются рассчитывается на основе крови: вода химического разделения коэффициенты (уравнение 2)²⁵.

THV = C_Макс / log P_BW (уравнение 1)

Журнал P_BW = log [(10^{0,73. log Kow} · 0,16) + 0.84] (уравнение 2)

Здесь мы также выбрать уровни сублетальных лечения относительно данио рерио и толстоголового гольян значениях ЛК50. Мы считаем такой подход полезным бенчмаркинг процедура поведенческих реакций, особенно при сравнении пороговые значения определенного поведения с моделью рыбы через несколько химических веществ. Далее она облегчает расчеты острого хронического соотношения, которое может пригодиться диагностически водной токсикологии механистический исследований и оценок. Значения ЛК50 были получены предварительные токсичности bioassays после стандартизированных принципам, описанным в шаг 2.1.

В этом протоколе мы используем общие экспериментальные проекты и статистические методы рекомендовал АООС США и ОЭСР стандартизированные методы для токсикологических исследований с моделями рыбы. Хотя мы приводим значения p (например., < 0.01, < 0,05, < 0,10), существенные различия (α = 0,10) в деятельности уровни определяются среди процедур с использованием дисперсионный анализ (ANOVA) Если нормальности и эквивалентности дисперсии предположений выполнены. Дуннетт или Тьюки HSD post hoc испытания проводятся для определения уровня различия лечения. Мы выбираем этот альфа (α = 0,10) значение, чтобы уменьшить ошибки типа II, особенно для раннего уровня анализов и когда понимание биологически важных эффект размер ограничен для малоисследованный поведения конечных точек и модель организмов²⁶, вместо использование процедуры более распространены в биомедицинских наук для нескольких сопоставлений (например., коррекция Бонферрони РНК-Seq данных)²⁷.  Будущие исследования необходимы для понимания изменчивости этих поведенческих реакций и потенциально изменить экспериментальные проекты (например, увеличение репликации) соответственно.

Ряд факторов может влиять на поведение личинок рыб Помимо воздействия химических веществ. Например время суток, возраст, размер хорошо, температуры, освещения состояния и объем воздействия раствора в каждом также представляют собой важные соображения^11,30. По этим причинам должны приниматься меры предосторожности для сведения к минимуму воздействия внешних факторов, которые могли бы повлиять двигательного поведения личинок рыб во время экспериментов. Поведенческие наблюдения должны выполняться в узких временных окон (3-4 h) и различных периодов времени, когда время день эффектов, как ожидается, будут иметь минимальное влияние на личиночной двигательного поведения¹¹. Кроме того личинок рыб следует сохранить при постоянной температуре (28 ± 1 ° C для данио рерио) и 24 ± 1 ° C для FHM и на определенный свет/темно цикл в контролируемой температурой инкубаторы на протяжении всего периода воздействия. Кроме того Температура лаборатории, где записываются поведения должны поддерживаться условий аппроксимации экспериментальных условиях, чтобы избежать влияния температуры на поведение. Кроме того Уэллс, используемые во время поведенческих наблюдений должна поддерживаться на тома последовательно для каждого индивидуального рыбы.

Личинок и эмбриональных данио рерио, своевременное ранее использовались в биомедицинских науках для выявления потенциальных терапевтических целей для Роман соединений^12,13. Этот протокол расширяет предыдущий поведенческих исследований с данио рерио, используя 38 конечных точек для изучения химического отпорности загрязнителей окружающей среды. Хотя кофеин является общей водных загрязнений с понимается механизм действий (MoA), многих соединений в торговле не хватает важных механистического данных. Таким образом этот протокол может использоваться для ознакомления Моа отсутствуют данные о токсичности, включая³⁹коммерческих химических соединений. Кроме того протокол предоставляет методы для двух из наиболее часто используемых рыбы моделей. Как отмечалось ранее, тогда как zebrafish модель общей биомедицинских рыбы, которая становится все более популярным в экотоксикологии, толстоголового гольян обычно используется как экологическая модель для оценки состояния окружающей среды приложений, но получил сравнительно меньше внимания в поведенческих исследований с автоматизированными системами, по сравнению с данио рерио. Хотя по-прежнему не стандартизированные методы регулирования для рыб поведенческих токсикологических исследований, этот протокол обеспечивает подход к поддержать будущие усилия.

Кофеин вызвал поведенческих реакций в каждой из моделей рыбы на уровнях, которые были обнаружены в водной среде¹⁶. Родригес-Gil et al. 2018 разработали глобальные экологические воздействия распределения в водных системах, основанных на измеренных значений кофеин¹⁶. В частности 95% сточных вод концентраций предсказал сточных вод будет ниже НКНВ для наиболее чувствительных поведения конечных точек, данио рерио и толстоголового пескарь в настоящем исследовании (Таблица 2). Хотя несколько поведенческие эффекты кофеина были наблюдается в данио рерио (особенно в темное время суток) на экологически значимых уровнях, неясно, ли эти поведенческие изменения могут произойти в естественных рыбных популяций или привести к экологически значимых неблагоприятных исходов. Хотя полезным для чувствительной, диагностического скрининга, личинок рыб поведенческих пороговые значения не могут быть представитель других этапов истории жизни или рыбы в природных популяциях. Дальнейшие исследования является оправданным для определения ли аналогичные поведенческие реакции порогов бы встречаются в природе и свидетельствует о неблагоприятных исходов на лицо или населения уровнях биологической организации.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ViewPoint Zebrabox	ViewPoint ZebraLab		и платформа ZebraLab для автоматизированных поведенческих наблюдений
Кофеин	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Исследовательский химический
инкубатор	VWR	9110589	Поддерживает цикл света/темноты и температуру для экспериментов с толстоголовым гольяном
Инкубатор	Thermo Fisher Scientific	35824-636	Поддерживает свет/темновой цикл и температуру для экспериментов с рыбками данио-рерио
100 мл стеклянные стаканы	VWR	89000-200	Камеры для экспонирования рыбок данио
Стеклянные стаканы объемом 500 мл	Pyrex	EW-34502-03	Камеры воздействия гольяна Fathead
5,000 &; L автопипетка	Eppendorf	Research 5000	Используется для заполнения отдельных лунок в луночных планшетах
Transfer Pippettes	VWR	414-004-004	Используется для переноса исследуемых организмов
48-луночные планшеты	Fisher Scientific	08-772-52	Камеры поведенческой регистрации личинок данио-рерио
24-луночные пластины	VWR	10062-896	Личинки толстоголового гольяна поведенческие регистрирующие камеры
Дигидрат сульфата кальция	Sigma-Aldrich	C3771	Для восстановленной жесткой воды
Сульфат магния	Sigma-Aldrich	M7506	Для восстановленной жесткой воды
Бикарбонат натрия	Sigma-Aldrich	S5761	Для восстановленной жесткой воды
Хлорид калия	Sigma-Aldrich	P9333	Для восстановленной жесткой воды
z-mod рециркуляционная система Морские	биотехнологические системы		Рециркуляционная система для основных культур данио-рерио
Программное обеспечение для статистического анализа Sigma	Plot	Версия 13.0	Используется для анализа данных статистики и получения рисунков
Программное обеспечение для статистического анализа	Graphpad Prism	Prism 5	Используется для создания рисунков
Автосэмплер/четвертичная насосная система	Agilent Technologies	Infinity 1260 модель	Аналитическая верификация уровней кофеина
Струйный поток Термоградиентный электроспрей Источник ионизации	Agilent Technologies		Аналитическая верификация уровней обработки кофеином
Тройной квадрупольный масс-анализатор	Agilent Technologies	Model 6420	Аналитическая верификация уровней обработки кофеином
10  КМ  ×   2.1  мм Poroshell 120 SB-AQ колонна (120Å, 2.7)	Agilent Technologies	685775-914T	Кофеновая хроматография
Программное обеспечение для оптимизации MassHunter	Agilent Technologies		Определение режима ионизации, контролируемых переходов и инструментальных параметров для кофеина/кофеина-d9 и параксантина/параксантина-d6