Здесь мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий по микроскопии флуоресцирования полного внутреннего отражения (TIRFM) с помощью site-specifically модифицированных λ субстрат ДНК и точка квантовой надписью белка.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация взаимодействия между Qdot меченых белков и ДНК Site-specifically модифицированных λ на уровне одной молекулы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микроскопии флуоресцирования внесла большой вклад в рассекает механизмов сложных биологических процессов на уровне одной молекулы. В одной молекулы анализов для изучения ДНК белковых взаимодействий, есть два важных факторов для рассмотрения: субстрат ДНК с достаточной длины для легко наблюдения и маркировки белок с подходящей флуоресцентного зонда. 48,5 kb ДНК λ является хорошим кандидатом для субстрат ДНК. Квантовые точки (Qdots), как класс флуоресцентных зондов, позволяют долгое время наблюдения (от минут до часов) и получение высокого качества изображения. В этой статье мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий на уровне одной молекулы, которая включает в себя подготовку site-specifically модифицированных λ ДНК и маркировки целевого белка с покрытием стрептавидина Qdots. Для доказательство концепции мы выбираем ОРК (происхождения признание комплекс) в многообещающий дрожжи как протеин интереса и визуализировать его взаимодействие с ARS (автономно тиражирование последовательность) с помощью TIRFM. По сравнению с другими флуоресцентных зондов, Qdots имеют очевидные преимущества в одной молекулы исследований благодаря своей высокой стабильности против Фотообесцвечивание, однако следует отметить, что это свойство ограничивает его применение в количественных анализов.
Введение
Взаимодействие между ДНК и белка имеют важное значение для многих сложных биологических процессов, таких как репликация ДНК, репарации ДНК и транскрипции. Хотя традиционные подходы пролили свет на свойства этих процессов, многие ключевые механизмы по-прежнему неясны. Недавно с быстро развивающейся одной молекулы методами, некоторые из механизмов были рассмотрены1,2,3.
Применение одной молекулы флуоресцентной микроскопии на визуализации взаимодействий протеин дна в режиме реального времени главным образом зависит от развития флуоресцентным обнаружен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. подготовка субстрата λ-ARS317 ДНК
- Строительство субстрат ДНК и упаковка
- Дайджест родной λ ДНК с помощью Xhoя фермента; усилить 543 bp ДНК фрагмента подшипника ARS317 от геномной ДНК многообещающий дрожжей с праймерами, содержащие 20 bp гомологичных последовательностей вверх и вниз по течению от Xhoя фермента сайт на лямбда ДНК. Добавить 100 нг от Xhoя переваривается λ ДНК и 10 нг ДНК фрагмент 10 мкл гомологичная рекомбинация реакции системы и инкубировать реакции при 37 ° C за 30 мин.
- Чтобы упаковать рекомбинации ДНК λ, 25 мкл лямбда упаковки экстрактов в рекомбинации продукт, и инкубировать и реакции на 30 ° ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы визуализировать взаимодействие между Qdot меченых орк и ARS, мы сначала построили субстрат ДНК λ-ARS317. Фрагмент ДНК, содержащие ARS317 была интегрирована в Xhoя на сайте (33,5 kb) родной λ ДНК гомологичная рекомбинация (рис. 1A). Рекомбинация продукт был упакован с помощью экстрактов и упакованных Фаговые частицы были культивированный на LB пластины (рис. 1B). Положительные Фаговые бляшки экранируется ПЦР и подтв.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представляем протокол наблюдать взаимодействие между Qdot меченых белков и ДНК site-specifically модифицированных λ, используя TIRFM в ячейку потока. Необходимые меры включают участкам модификации субстрат ДНК, ДНК biotinylation, coverslip очистки и функционализации, подготовка потока клетки, и одной молекулы изображений. Существует два ключевых момента, которые следует отметить. Во-первых, все этапы с λ ДНК следует аккуратно манипулировать для снижения возможного ущерба, например, избегая смешивания, з.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим д-р Хасан Йардимчи и Dr.Sevim Йардимчи Фрэнсиса Крика института рода помощь в сингл молекулярных экспериментов, д-р Даниэль Duzdevich из лаборатории д-р Эрик C. Грин Колумбийского университета, доктор Юйцзе солнце Пекинского университета и доктор Чен Чуньлай из Университет Цинхуа для полезного обсуждения. Это исследование было поддержано национальным естественных наук фонд Китая 31371264, 31401059, CAS-междисциплинарная команда инноваций и Ньютон расширенный стипендий (NA140085) из Королевского общества.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Лямбда ДНК | Новая Англия Биолабс | N3011 | Магазин 25 μ L аликвоты при -20 ºC. |
| XhoI фермент | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Набор для быстрого клонирования | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Упаковка экстрактов | Epicentre | MP5110 | Штамм бактерий LE392MP входит в эту упаковку. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013092 | Любая марка приемлема. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical Works | N/A | Любая марка приемлема. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical Works | N/A | Любая марка приемлема. |
| NZ-амин | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Магнитный перемешивающий аппарат | IKA | KMO2 базовый | |
| 15 мл Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 мл, стерильный, объемный, 500шт |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Биотинилированные праймеры | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 ДНК-лигаза, T4 ДНК-лигаза, реакционный буфер (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Этанол | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| гидроксид калия (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Ацетон | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | серной кислотой |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Перекись водорода |
| Метанол | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Уксусная кислота | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (метокси-полиэтиленгликоль) | Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| биотин-PEG (биотин-полиэтиленгликоль) | Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Вакуумный эксикатор | Тяньцзиньский филиал Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Вакуумный упаковщик | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Стеклянный списчик с алмазным наконечником | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Стеклянный слайд | Парус Бренд | 7101 | |
| Входная трубка | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | внутренний диаметр 0,38 мм; внешний диаметр 1,09 мм. |
| Выходная трубка | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | внутренний диаметр 0,76 мм; внешний диаметр 1,22 мм. |
| Двухсторонняя лента | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Эпоксидная | смола LEAFTOP | 9005 | пятиминутная эпоксидная |
| стрептавидин | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Olympus | IX71 | |
| Инфузия/вывод<бр/> программируемый насос | Гарвардский аппарат | 70-4504 | |
| 532 нм лазер | Когерентный | сапфир-532-50 | |
| 640 нм лазер | Когерентный | OBIS-640-100 | |
| EMCCD камера | Andor DU-897E-CS0-BV | ||
| W-View Gemini Imaging расщепляющая оптика | Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| Система освещения TIRF | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60 раз; Объектив TIRF | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Четырехгранный лазерный дихроичный<бр/> светоделитель | Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 | |
| Четырехполосный полосовой фильтр | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 | |
| Дихроичный светоделитель | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Эмиссионный фильтр | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Фильтр излучения | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck флуоресценция, предметное стекло для микроскопа #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store в 4 º С, не замораживать. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Приготовьте 200 мМ раствор АТФ, используя ddH2O, отрегулируйте pH до 7,0 и храните 10 мкм; L аликвоты при -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Приготовьте 1 М раствор с помощью ddH2O, и сохраните 10 мкм; При -20 °C. |
Ссылки
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
