Method Article

Визуализация взаимодействия между Qdot меченых белков и ДНК Site-specifically модифицированных λ на уровне одной молекулы

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий по микроскопии флуоресцирования полного внутреннего отражения (TIRFM) с помощью site-specifically модифицированных λ субстрат ДНК и точка квантовой надписью белка.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопии флуоресцирования внесла большой вклад в рассекает механизмов сложных биологических процессов на уровне одной молекулы. В одной молекулы анализов для изучения ДНК белковых взаимодействий, есть два важных факторов для рассмотрения: субстрат ДНК с достаточной длины для легко наблюдения и маркировки белок с подходящей флуоресцентного зонда. 48,5 kb ДНК λ является хорошим кандидатом для субстрат ДНК. Квантовые точки (Qdots), как класс флуоресцентных зондов, позволяют долгое время наблюдения (от минут до часов) и получение высокого качества изображения. В этой статье мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий на уровне одной молекулы, которая включает в себя подготовку site-specifically модифицированных λ ДНК и маркировки целевого белка с покрытием стрептавидина Qdots. Для доказательство концепции мы выбираем ОРК (происхождения признание комплекс) в многообещающий дрожжи как протеин интереса и визуализировать его взаимодействие с ARS (автономно тиражирование последовательность) с помощью TIRFM. По сравнению с другими флуоресцентных зондов, Qdots имеют очевидные преимущества в одной молекулы исследований благодаря своей высокой стабильности против Фотообесцвечивание, однако следует отметить, что это свойство ограничивает его применение в количественных анализов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействие между ДНК и белка имеют важное значение для многих сложных биологических процессов, таких как репликация ДНК, репарации ДНК и транскрипции. Хотя традиционные подходы пролили свет на свойства этих процессов, многие ключевые механизмы по-прежнему неясны. Недавно с быстро развивающейся одной молекулы методами, некоторые из механизмов были рассмотрены1,2,3.

Применение одной молекулы флуоресцентной микроскопии на визуализации взаимодействий протеин дна в режиме реального времени главным образом зависит от развития флуоресцентным обнаружен....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. подготовка субстрата λ-ARS317 ДНК

  1. Строительство субстрат ДНК и упаковка
    1. Дайджест родной λ ДНК с помощью Xhoя фермента; усилить 543 bp ДНК фрагмента подшипника ARS317 от геномной ДНК многообещающий дрожжей с праймерами, содержащие 20 bp гомологичных последовательностей вверх и вниз по течению от Xhoя фермента сайт на лямбда ДНК. Добавить 100 нг от Xhoя переваривается λ ДНК и 10 нг ДНК фрагмент 10 мкл гомологичная рекомбинация реакции системы и инкубировать реакции при 37 ° C за 30 мин.
    2. Чтобы упаковать рекомбинации ДНК λ, 25 мкл лямбда упаковки экстрактов в рекомбинации продукт, и инкубировать и реакции на 30 ° ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы визуализировать взаимодействие между Qdot меченых орк и ARS, мы сначала построили субстрат ДНК λ-ARS317. Фрагмент ДНК, содержащие ARS317 была интегрирована в Xhoя на сайте (33,5 kb) родной λ ДНК гомологичная рекомбинация (рис. 1A). Рекомбинация продукт был упакован с помощью экстрактов и упакованных Фаговые частицы были культивированный на LB пластины (рис. 1B). Положительные Фаговые бляшки экранируется ПЦР и подтв.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол наблюдать взаимодействие между Qdot меченых белков и ДНК site-specifically модифицированных λ, используя TIRFM в ячейку потока. Необходимые меры включают участкам модификации субстрат ДНК, ДНК biotinylation, coverslip очистки и функционализации, подготовка потока клетки, и одной молекулы изображений. Существует два ключевых момента, которые следует отметить. Во-первых, все этапы с λ ДНК следует аккуратно манипулировать для снижения возможного ущерба, например, избегая смешивания, з.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-р Хасан Йардимчи и Dr.Sevim Йардимчи Фрэнсиса Крика института рода помощь в сингл молекулярных экспериментов, д-р Даниэль Duzdevich из лаборатории д-р Эрик C. Грин Колумбийского университета, доктор Юйцзе солнце Пекинского университета и доктор Чен Чуньлай из Университет Цинхуа для полезного обсуждения. Это исследование было поддержано национальным естественных наук фонд Китая 31371264, 31401059, CAS-междисциплинарная команда инноваций и Ньютон расширенный стипендий (NA140085) из Королевского общества.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Лямбда ДНКНовая Англия БиолабсN3011Магазин 25 μ L аликвоты при -20 ºC.
XhoI ферментThermo Fisher ScientificFD0694
Набор для быстрого клонированияBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Упаковка экстрактов		EpicentreMP5110Штамм бактерий LE392MP
входит в эту упаковку.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013092Любая марка приемлема.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical WorksN/AЛюбая марка приемлема.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical WorksN/AЛюбая марка приемлема.
NZ-аминAmrescoJ853-250G
Casamino acidsSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Магнитный перемешивающий аппаратIKAKMO2 базовый
15 мл Eppendorf tubeEppendorf3012215115 мл, стерильный, объемный, 500шт
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
Биотинилированные праймерыThermo Fisher ScientificN/A
T4 ДНК-лигаза, T4 ДНК-лигаза, реакционный буфер (10x)New England BiolabsM0202
CoverslipThermo Fisher Scientific22266882
ЭтанолSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009259
гидроксид калия (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
АцетонThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80120891серной кислотой
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd1001121830% Перекись водорода
МетанолSigma-Aldrich322415-2L
Уксусная кислотаSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(метокси-полиэтиленгликоль)		LysanmPEG-SVA-5000
биотин-PEG
(биотин-полиэтиленгликоль)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Вакуумный эксикаторТяньцзиньский филиал Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Вакуумный упаковщикMAGIC SEALWP300
Стеклянный списчик с алмазным наконечникомELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
Стеклянный слайдПарус Бренд7101
Входная трубкаSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2внутренний диаметр 0,38 мм; внешний диаметр 1,09 мм.
Выходная трубкаSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4внутренний диаметр 0,76 мм; внешний диаметр 1,22 мм.
Двухсторонняя лентаSigma-AldrichGBL620001-1EA
Эпоксиднаясмола LEAFTOP9005пятиминутная эпоксидная
стрептавидинSigma-AldrichS4762
Флуоресцентный микроскопOlympusIX71
Инфузия/вывод<бр/> программируемый насосГарвардский аппарат70-4504
532 нм лазерКогерентныйсапфир-532-50
640 нм лазерКогерентныйOBIS-640-100
EMCCD камераAndor DU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
расщепляющая оптика		Hamamatsu photonics K.K.A12801-01
Система освещения TIRFOlympusIX2-RFAEVA2
60 раз; Объектив TIRFOlympusAPON60XOTIRF
Четырехгранный лазерный дихроичный<бр/> светоделительSemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Четырехполосный полосовой фильтрSemrockFF01-446/510/
581/703-25
Дихроичный светоделительSemrockFF649-Di01-25x36
Эмиссионный фильтрChroma Technology CorpET585/65m
Фильтр излученияChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck флуоресценция, предметное стекло для микроскопа #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConjugateThermo Fisher ScientificQ10163MPStore в 4 º С, не замораживать.
ATPAmresco0220-25GПриготовьте 200 мМ раствор АТФ, используя ddH2O, отрегулируйте pH до 7,0 и храните 10 мкм; L аликвоты при -20 ºC.
DTTAmrescoM109-5GПриготовьте 1 М раствор с помощью ddH2O, и сохраните 10 мкм; При -20 °C.
смола

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

Related Articles