Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Моделирование болезнь Шарко Мари зуб в пробирке Transfecting мышь первичной мотонейронов

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57988

⸱

7 января 2019 г.

 ,  , 
1Institut NeuroMyoGène, CNRS UMR5310, INSERM U1217, Université Lyon, 2Unité Fonctionnelle de Neurogénétique Moléculaire, Hospices Civils de Lyon, 3Centre de Biotechnologie Cellulaire, Hospices Civils de Lyon

В этой статье

Краткое содержание

Цель этой методики – подготовить высокообогащенного культуры первичной мотонейронов (MNs) из мышиных спинного мозга. Чтобы оценить последствия мутации, вызывая заболевания MN, мы опишем здесь изоляции эти изолированные MNs и их transfection magnetofection.

Аннотация

Нейродегенеративные мотонейронов спинного мозга (MNs) причастны широкого спектра неврологических расстройств, включая боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб и спинальной мышечной атрофии, которые все связаны с мышечной атрофии. Основной культуры позвоночника МНБ использовали широко продемонстрировать участие конкретных генов в таких заболеваний и характеризуют сотовой последствия их мутаций. Эта культура модели первичной MN протокол производным от семенных работы Хендерсон и коллег более двадцати лет назад. Во-первых мы подробно метод рассечения передней рогах спинного мозга от зародыша мыши и изолировать MNs из соседних клеток, с использованием градиента плотности. Затем мы представляем новый способ эффективно transfecting MNs с плазмид выражение, с помощью magnetofection. Наконец мы показываем, как исправить и имунноконтраст первичной MNs. Использование neurofilament мутации, которые вызывают болезнь Шарко-Мари-зуб типа 2, этот протокол свидетельствует качественный подход к выражением протеинов интереса и изучение их участие в MN роста, техническое обслуживание и выживания.

Введение

Нервно-мышечные заболевания охватывают разнообразные клинически и генетически различных патологий, которые характеризуются изменения мышц и нервной системы. Из-за достижения в области технологий виртуализации, сотни генов, ответственных за эти редкие заболевания были выявлены в ходе последнего десятилетия (список доступных в центре нейромышечные болезнь, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Разнообразие выявленных мутаций указывает, что различные мутации одного гена может привести к разному фенотипы и болезней1,2,3 и что мутации в различных генов может производить аналогичные фенотипов 4 , 5. в этом контексте, являются усилия по развитию сотовой модели, которые могут стать мощные инструменты для анализа последствий мутации и патологических механизмов.

Позвоночника MNs имеют большие СОСМ, расположенный в вентральной рогов спинного мозга, длинные аксоны форме скелетных мышечных волокон, и позволяют добровольных движений через освобождение ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях. Так как MNs страдают от нервно-мышечных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб (CMT), и спинальной мышечной атрофии, д-р Хендерсон и коллеги разработали первый протокол6 , что позволило для выращивания в пробирке позвоночника MNs и открытие нейротрофических факторов GDNF7 (глиальных клеток производных нейротрофических факторов). Технические усовершенствования тех пор позволило для более точной очистки позвоночника MNs и их подтипы, использование СУИМ8, но обогащения градиент плотности остается мощным и широко используется в лабораториях, в настоящее время работает с основной позвоночника МНБ 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Впоследствии, это также возможно для получения более высокого класса очистки MN через immunopanning, воспользовавшись поверхности маркер p75(НТР)15,16,17.

Спинной мозг содержит различные подтипы шейного, грудного и поясничного отдела МНБ, а также средний и боковые мотор столбцы, которые отличаются среди их расположение в передней рога на оси dorso вентральной и среди целей они иннервируют8, 18. основной MN культур можно восстановить все эти подтипы MN в физиологических пропорциях. Основным ограничением этой методики является низкое количество МНБ, полученные в конце процедуры; в самом деле можно ожидать, чтобы получить около 105 MNs из шести эмбрионов, которая подходит для микроскопии, но ограничения для биохимии экспериментов. Для выполнения экспериментов с более стандартизированной подтипы и обильные MNs (> 106 клеток), эмбриональных стволовых клеток, полученных MNs следует рассматривать18.

Трансфекция диких тип/мутант трансгенов или эндогенных генов нокдаун в первичной MNs является быстрый и полезный инструмент для расшифровки выкидышей пути, особенно когда мышь модели недоступны. Magnetofection является методика transfecting первичной нейронов, похож на липофекция без соответствующих нейротоксичности. Кроме того transfection может выполняться на зрелых нейронов после нескольких дней в пробирке, в отличие от методов, основанных на электропорации9. Однако один из недостатков этого метода является бисер привязать нуклеиновых кислот в культуре, вызывая шум в маркировке DAPI. Вирусная инфекция, вероятно, наиболее эффективным методом для transfecting МНС; Однако magnetofection не требует определенных процедур обеспечения безопасности, необходимые для вирусных производства и клеточных инфекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с участием животных были приняты этического комитета учреждения.

1. решение подготовка

  1. Подготовка 10 мл 4% BSA dialyzed в L-15 среде.
    1. Альбумина bovine сыворотки порошок на 4% (w/v) растворяют в 10 мл L-15 среды.
    2. Добавьте решение в 20 мл диализа кассету с 20 кДа отсечения. Dialyze против 500 мл L-15 среды для 3 дней при агитации на 4 ° C. Изменение среднего L-15 каждый день.
    3. Фильтр решение через 0,22 мкм мембраны и Алиготе в 15 мл пробирок. Хранить трубы при-20 ° C.
      Примечание: Этот протокол использует следующие ссылки: неизмененном сырья среднего L-15 = Средний L-15, кислой среде L-15 = pH L-15 и основные L-15 Средний = бикарбоната L-15.
  2. Подготовка 200 мл рН L-15.
    1. Отрегулируйте рН среды L-15: во-первых, заполнить мыть бутылку с некоторыми частями сухого льда. Придать L-15 среднего газа (CO2), до тех пор, пока цвет превращает оранжевый (~ давления pH 6.4 и ~ 40). PH можно также отрегулировать с стандартный pH метр.
    2. Фильтр средних 0,22 мкм мембраны и хранить при 4 ° C на один месяц.
  3. Подготовка 100 мл L-15 бикарбоната.
    1. Добавьте 2.5 мл 7% бикарбоната натрия 97,5 мл L-15 среды и хранить при 4 ° C.
  4. Подготовьте МПХБ (инсулин Putrescin Conalbumin селенит) добавки.
    1. Растворите 2,5 мг инсулина в 0,5 мл 0,1 М HCl. добавить 4,5 мл двойной дистиллированной воды.
    2. Растворите 8 мг путресцин в 5 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
    3. Растворите 100 мг conalbumin в 10 мл ФСБ.
    4. Растворить 1 мг натрия селенит в 19,3 мл воды, скорректировать рН 7,4 и разбавить раствор 10 раз.
    5. 1 мл раствора инсулина, 1 мл раствора путресцин, 1 мл conalbumin и 0,1 мл раствора натрия селенит для получения 3.1 мл раствора дополнение МПХБ объединяйте. Хранят раствор при температуре-20 ° C.
  5. Приготовляют раствор прогестерона 0,02 мм.
    1. Растворите 1 мг прогестерона в 1,6 мл 80% этанола.
    2. Разбавить раствор 100-кратного в 100% этанола и хранить его при-20 ° C.
  6. Подготовка 100 мл полного среднего L-15.
    1. Добавьте 1.8 мл раствора D-глюкозы (200 мг/мл) 92 мл рН L-15 для получения окончательного концентрация составляет 3,5 мг/мл глюкозы.
    2. Объединить 1 мл 100 x пенициллин-стрептомицином (10000 ед/мл), 2 мл сыворотки тепла инактивированная лошадь, 3.1 мл смеси МПХБ и 0,1 мл раствора прогестерона (2 x 10-5 М).
    3. Фильтр средство на 0,22 мкм мембраны и хранить при 4 ° C.
  7. Подготовьте 5 мл раствора (конечная концентрация 5,5%) плотность градиента в эксперимент.
    1. 476 мкл коммерческой среды градиента 60% плотность 4524 мкл L-15 (если это возможно, без красных фенола увеличить визуальный контраст в интерфазе; коэффициент разрежения 1:10. 5).
    2. Хранят раствор при температуре 4 ° C на 2 недели или заморозить его при-20 ° C.
  8. Подготовка 10 мл культуры средств массовой информации.
    1. Добавьте 200 мкл дополнения средних 9,6 мл среды культуры клетки нейрона.
    2. Добавьте 200 мкл тепла инактивированная лошадь сыворотки (которая стремится дифференцировать глиальных клеток прекурсоров и работает против распространения) 25 мкл глутамина и 10 мкл 2-меркаптоэтанол.
    3. Фильтр СМИ через фильтр 0,22 мкм.
    4. Добавьте следующие нейротрофических факторов: цилиарной нейротрофических факторов (CNTF) в конечной концентрации 10 нг/мл и мозг производных нейротрофических фактора (BDNF) и фактор производных нейротрофических глиальных клеток (GDNF) на окончательный концентрации 1 нг/мл.
    5. Хранить при 4 ° C.
  9. Подготовка 50 мл рассечение средств массовой информации.
    1. Добавление 47.05 мл HBSS 2,25 мл глюкозы (200 мг/мл). 700 мкл 1 м HEPES с рН 7,4. Хранить при 4 ° C.
  10. Приготовляют раствор 4% PFA.
    1. Растворяют 20 g ПФА в 500 мл ФСБ.
    2. Под капотом химического тепло раствора до 60 ° C и добавить несколько капель 1 M NaOH до тех пор, пока решение становится ясно.
    3. Фильтр решение через фильтровальную бумагу и скорректировать рН 7,2. Хранить при температуре от-20 ° C.
      Примечание: в качестве альтернативы, другие коммерческие решения PFA может использоваться и разбавляют до 4% в PBS.
  11. Очистите инструменты рассечение, включая щипцы, ножницы и силиконовые блюда с 70% этанол перед использованием и с мылом и чистой водой после использования.

2. поли орнитина/Ламинин (Po/Л) блюдо покрытие

Примечание: Объемы адаптированы к Пальто плиты 24-хорошо.

  1. При необходимости, положите стерильные 12 мм coverslip в скважине.
  2. Герб скважин с 500 мкл раствора 10 мкг/мл поли-L-орнитин, растворенных в воде.
  3. Пусть скважин довольствуйтесь 1 ч при комнатной температуре.
  4. Удаление решения поли-L-орнитин и просушите на 30 мин.
  5. Герб скважин на ночь при 37 ° C с 500 мкл 3 мкг/мл Ламинин в бикарбонат L-15.
    Примечание: Скважины может храниться при 37 ° C в течение 7 дней в инкубаторе. Для длительного использования инкубаторов добавив стерильные PBS между скважин может помочь избежать средних испарения.

3. рассечение

  1. Жертву беременной мыши, когда эмбрионы находятся на начальной стадии E12.5. Очистите живот с 70% этиловом спирте.
  2. Удаление матки путем разрезания два яйцеводов и влагалище и положить его в чашку Петри, наполненный холодной PBS (без Ca2 + Mg2 +).
  3. Собрать все эмбрионы и передавать их на свежий, холодный PBS в чашке Петри (без Ca2 + Mg2 +).
  4. Положите одного эмбриона в блюдо, покрытая силиконом и полон рассечение СМИ (HBSS, 4,5 г/Л глюкозы и 7 мм HEPES рН 7,4).
    Примечание: Рассечение эмбрионов выполняется под микроскопом, с использованием чистой тонкой щипцами и ножницы. Кроме того регулярные Петри блюдо без силикона может использоваться для рассечения.
  5. Удалите головы, хвоста и внутренностей, используя пинцет как ножницы.
  6. Поддерживать эмбриона с животом против силикона с щипцами.
  7. Вторая пара щипцами вставьте один из советов в Центральный канал спинного мозга Ростральных.
  8. Закройте щипцы рвать спинной ткани в несколько миллиметров.
  9. Повторите эту операцию хвостового сторону до тех пор, пока весь спинной открыт (рис. 1B).
  10. Отсоедините ростральной части спинного мозга (церебральный хобот) от тела.
  11. Поверните эмбриона для поддержания открытых спинного против силикона.
  12. Щепотка ростральной части спинного мозга и потяните эмбриона руководителем для извлечения спинного мозга.
    Примечание: Мозговых оболочек и спинной корень ганглиев (ДРГ) должна оставаться прикрепленной к эмбриона. В противном случае тщательно тронуться оставшиеся мозговых оболочек и ДРГ еще привязаны к спинного мозга. На этом шаге, ГДК также могут быть собраны для чувствительных нейрон культуры (см. обсуждение).
  13. Придавить спинном на силиконовой и удалять спинной части шнур, разрезания вдоль середины каждой стороны с помощью скальпеля. Нарезать средней части 10 с помощью скальпеля и передача части к новой пробке.

4. суспензию клеток спинного мозга

  1. Повторите эту процедуру диссекции для 6-8 спинного шнуры.
  2. Пусть спинного куски собирать в нижней части трубы и заменить HBSS 1 мл среды Хэм-F10.
  3. 10 мкл трипсина (2,5% w/v; конечная концентрация 0,025%). Инкубировать трубки для 10 минут при 37 ° C.
  4. Чтобы остановить ферментативного пищеварения, передачи фрагментов новых 15 мл трубки, содержащий 800 мкл полного среднего L-15, 100 мкл 4% (w/v) BSA и 100 мкл DNase (1 мг/мл в L-15 среде).
  5. Нарезанных дважды по 1 мл, с помощью пипетки P1000 аспирационных. Пусть фрагменты поселиться на 2 мин сбор супернатант в свежий 15 мл.
  6. Фрагменты добавьте 900 мкл полного среднего L-15, 100 мкл 4% (w/v) BSA и 100 мкл DNase (1 мг/мл в L-15 среде).
  7. Нарезанных 6 раз по 1 мл, с помощью пипетки P1000 аспирационных. Пусть фрагменты поселиться на 2 мин добавить супернатант в 15 мл полученного на шаге 4.5.
  8. Фрагменты добавьте 900 мкл полного среднего L-15, 100 мкл 4% (w/v) BSA и 100 мкл DNase (1 мг/мл в L-15 среде).
  9. Нарезанных 10 раз , аспирационных 1 мл с помощью пипетки P1000. Пусть фрагменты поселиться на 2 мин добавить супернатант в 15 мл полученного на шаге 4.5. Продолжите супернатант.
  10. С помощью пипетки P1000, осторожно поместите подушку 4% (w/v) 2 мл BSA в нижней части супернатанта трубки. Центрифуга на 470 x g за 5 мин.
  11. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 2 мл полного среднего L-15.

5. MN обогащение градиента плотности

  1. Суспензию клеток разделен на две трубы 15 мл (1 мл). Затем добавьте 2 мл полного среднего L-15. Если начиная с 6 эмбрионов, используйте эквивалент 3 эмбрионов в метро в 3 мл среды.
  2. Добавьте 2 мл раствора градиент плотности, медленно добавляя решение в нижней части каждой трубы для получения резкого интерфейса.
  3. Центрифуга на 830 x g 15 мин при комнатной температуре. После этого шага небольшие клетки должно быть в нижней части трубки, тогда как большие клетки, такие как MNs должно быть в интерфейсе градиентного раствора/средняя плотность.
  4. Собрать клетки на стыке аспирационных 1 или 2 мл и передавать их на свежий 15 мл. Отрегулируйте громкость до 10 мл с L-15 рН среды.
  5. Добавьте 2 мл 4% BSA подушки в дно трубки и центрифуги на 470 x g 5 мин при комнатной температуре.
  6. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 3 мл полного среднего L-15.
  7. Повторите шаг 5.5.
  8. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл полной питательной среды. Подсчет количества клеток и жизнеспособности под микроскопом фазы контраст с Горяева.
    Примечание: Для 6 спинного шнуры, номер ячейки ожидается около 1 х 105 MNs.

6. MN культура

  1. Разбавьте MNs соответствующей плотности, обычно 5000 до 10000 клетки в 500 мкл питательной среды на хорошо в пластине 24-хорошо.
    Примечание: Заполнение плотность составляет около 30000 и 1500 клеток для 6 - и 96-луночных планшетов, соответственно.
  2. Удаление решения Ламинин с P1000.
  3. Сразу передача МНБ, разводят в культурной среде в покрытие плит во избежание высыхания.
  4. Инкубировать культуры для 2 дней при температуре 37 ° C.

7. Magnetofection МНБ

Примечание: В следующих шагах, использованных количествах предназначены для transfection одной скважиной 24-ну плиты. Пожалуйста, обратитесь к производителя протокол на другой формат.

  1. Для подготовки ДНК, Ресуспензируйте 1 мкг ДНК в 50 мкл нейрональных питательной среды и вихревые для 5 s.
  2. Для подготовки труб из бисера Ресуспензируйте 1.5 мкл бисера в 50 мкл нейрональных питательной среды.
  3. Добавьте 50 мкл шарик решение решение ДНК 50 мкл и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре (суммарный объем = 100 мкл).
  4. Во время этой инкубации снять 100 мкл питательной среды из колодца, который будет transfected.
    Примечание: Положите магнитные пластины в инкубатор, чтобы нагреть его до 37 ° C.
  5. Передачи 100 мкл ДНК/шарик смесь хорошо и инкубировать пластины 20 – 30 мин на магнитные пластины при 37 ° C.
  6. Подождите, по крайней мере за 24 часа до обнаружения выражения cDNA.

8. фиксации и окраски

  1. Вымойте культуры 2 раза с PBS.
  2. Инкубировать культуру для 20 мин при комнатной температуре в 4% PFA/PBS.
  3. Вымойте культуры 2 раза с PBS.
  4. Инкубируйте культуры в 500 мкл блокировки буфера (PBS, BSA 4%, 2% нормальной сыворотки, 0,3% Тритон X-100, 0,1 М глицин) за 1 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Нормальной сыворотке должен быть производным от того же вида, как вторичное антитело (например, обычный козьего сыворотки).
  5. Проинкубируйте культуры на ночь при 4 ° C с основного антитела, разводят в 250 мкл блокировки буфера.
    Примечание: К примеру, TUJ1 используется в 1/1000, SMI32 используется в 1/1000, и Lc3b используется на 1/200.
  6. Вымойте культуры 3 раза с PBS.
  7. Проинкубируйте культуры с Флюорофор конъюгированных вторичные антитела, разводят в 250 мкл блокирующий буфер за 1 час при комнатной температуре.
  8. Вымойте культуры 3 раза с PBS.
  9. Смонтировать на стеклянных вставках, с помощью установки среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После 24 часов в культуре мотонейронов (MNs) следует уже показывают значительный рост аксональное (по крайней мере 6 раз больше, чем размер сома). В последующие дни аксоны следует продолжать расти и отображения ветвления (рис. 2). Будут существовать различные морфологии из-за специфики подтип. Например средний столбец МНБ, которые иннервируют осевой мускулатуры были короче и более разветвленной аксоны чем боковой колонке мотор МНБ, которые иннервируют мышцы к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Одним из критических точек в этот протокол является, что эмбрионов мыши разделяются на точное время окна во время разработки (E12.5), чтобы оптимизировать количество МНБ, полученные в конце. Кроме того для оптимальной урожайности, вскрытие должно выполняться утром или в начале второй половине дня. Перед E12.5 (например, в E11.5) рассечение трудно, особенно в отношении ликвидации мозговых оболочек. После E12.5 количество полученных MNs значительно падает. Для управления стадии развития эмбриона, взрослые самки и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить «Ассоциация le développement de la neurogénétique» доктор Жакье стипендий и AFM-Телетон за его поддержку через MyoNeurAlp стратегического плана. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Крис Хендерсон, д-р Уильям Camu, доктор Brigitte Pettmann, Raoul Седрик д-р и д-р Георг Haase, кто участвовал в развитии и совершенствовании техники и распространения их знаний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Материал
Силиконовая тарелка для препарирования Приборыживых системDD-90-S-BLK-3PKSylgard
круглый покровный стеклоNeuVitro, ниттельное стеклоGG-12-Pre12 мм
Слайд Кассеты LyzerThermoFisher Scientific6603020,000 MWCO; 30 мл
Фильтрующий блокMilliporeSCGVU02RE
GP стерильные шприцевые фильтрыMilliporeSLGP033RS
4-луночная пластинаThermoFisher Scientific167063Nunclon Delta обработанные пластинчатые
щипцыFST от Dumont11252-20#5 щипцы
ножницыFST от Dumont14060-10тонкие ножницы
скальпельFST от Dumont10035-20
скальпельFST by Dumont10316-14микронож скальпель
Петри чашкаGreiner663102ø x h = 100 x 15 мм
15 мл полипропиленовая трубкаFalcon352096
фильтровальная бумагаWatman1001125круг, диаметр 125 мм
стеклянная камера предметное стеклоLab-Tek1545264 камеры
Плазмида pCAGEN Addgene#11160
Name<>CompanyCatalog NumberComments<
>Растворы и среды
BovetBorum albuminSigma-AldrichA9418
L-15 среднийThermoFisher Scientific11415056
L-15 средний, без красного фенолаThermoFisher Scientific21083027
инсулинSigma-AldrichI6634
путресцинSigma-AldrichP5780
КональбуминSigma-AldrichC7786
Селенит натрияSigma-AldrichS5261
ПрогестеронSigma-AldrichP8783
Поли-DL-орнитинSigma-AldrichP8638
ЛамининSigma-AldrichL2020
трипсин 2,5%, 10xThermoFisher Scientific15090046
ДНКазаSigma-AldrichDN25
PBS без Ca MgThermoFisher Scientific14190144без Mg2+ Ca2+
bicarbonateThermoFisher Scientific25080094
Neuron клеточная культурная средаThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES буфер 1 МThermoFisher Scientific15630056
Градиентная средаSigma-AldrichD1556Optiprep
добавка средаThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
термоинактивированнаяThermoFisher Scientific26050-088
L-глутамин 200 мМThermoFisher Scientific25030024
2-меркаптоэтанолThermoFisher Scientific31350010
пенициллин/стрептомицинThermoFisher Scientific1514012210 000 ЕД/мл
НазваниеCompanyНомер в каталогеComments
Immuno флуоресценция
PBS, 10xThermoFisher ScientificX0515без Mg2+ Ca2+
Параформальдегид (PFA)Sigma-Aldrich441244
нормальная козья сывороткаSigma-AldrichG6767
глицинSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Холинацетилтрансфераза (CHAT)ChemiconAb144P
Нейрофиламент H нефосфорилированный (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF at 1/1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Монтажная среда VectashieldVector LabH-1000
Beta3 тубулин (клон Tuj1)Biolegends801201IF at 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775IF at 1/200
для с изогнутым лезвием strongstrongsodium Horse сыворотка

Ссылки

  1. Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
  2. Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
  3. Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
  4. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  5. Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  6. Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
  7. Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
  8. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
  9. Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
  10. Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
  11. Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
  12. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  13. Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
  14. Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  17. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
  19. Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
  20. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
  22. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
  23. Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Моделирование болезнь Шарко Мари зуб в пробирке Transfecting мышь первичной мотонейронов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.