Мы устанавливаем Роман хирургической техники для модели перфузии в естественных условиях один лепесток печени крыс как предпосылкой для дальнейшего обучения в естественных условиях частичной печени техники в будущем.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Роман хирургической техники как основы для в естественных условиях частичной печени инженерии в крыса
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Орган инженерия — это роман стратегия для создания в трансплантации печени орган заменителей, которые потенциально могут быть использованы. Недавно, в естественных условиях печени инжиниринг, в том числе в vivo орган decellularization следуют заселения, стала перспективный подход над ex vivo печени инженерии. Однако послеоперационные выживания не была достигнута. Цель этого исследования – разработать Роман хирургической техники в vivo перфузии выборочной доли печени крыс как предпосылки в vivo печени инженерии. Мы генерируем обходной цепи только через левой боковых лепестков. Затем левой боковых лепестков увлажненную с гепаринизированным засолены. Эксперимент проводится с 4 группы (n = 3 крысы на группу) на основе различных перфузии раз 20 мин, 2 ч, 3 h и 4 ч. выживание, а также макроскопически видимое изменение цвета и гистологически определяется отсутствие клеток крови в Портал триады и синусоиды, воспринимается как индикатор для создания успешной моделью. После выборочной перфузии левой боковых лепестков мы отмечаем, что левой боковых лепестков, действительно, оказался от Красного слабый желтый. В гистологических оценки не клетки крови видны в ветви воротной вены, Центральной Вены и синусоид. После открытия заблокированных судов становится красным левой боковых лепестков. 12/12 крыс выжил процедура для более чем одной недели. Мы являемся первым сообщить хирургической модель в vivo перфузии один лепесток печени с периодом долгое выживание более чем за одну неделю. В отличие от ранее опубликованном докладе, это самое важное преимущество техники, представленные здесь перфузии 70% печени поддерживается на протяжении всей процедуры. Создание этой техники обеспечивает основу для в естественных условиях частичной печени техники в крыс, включая decellularization и recellularization.
Введение
Постоянно расширяются показания для трансплантации. В отличие от этого орган пожертвование ставки и общее качество органов сокращается, ведущих к растущего спроса на графтов. Продолжало увеличиваться число кандидатов, добавляется в список ожидающих пересадки печени (например, в Соединенных Штатах, 11,340 пациентов были добавлены в 2016 году, по сравнению с 10,636 в 2015 году)1. Несмотря на значительные усилия число имеющихся органов не отвечают клинических потребностей. Из-за повышенной заболеваемости печени у многих пациентов с терминальной стадии заболевания печени умирают в списке ожидания пересадки до доноров орган становится доступной. Для удовлетворения огромного спроса на донорской печени графтов, альтернативные подходы, с помощью ткани печени, инженерные принципы в настоящее время активно проводит2. В настоящее время недавно разработанный биологических техника печени техники потенциально можно преодолеть этот недостаток.
Печени инженерии состоит из двух этапов: поколение бесклеточной эшафот, следуют заселение эшафот. Для получения биологических бесклеточной печени леску, explanted печень является перфузии через сердечно-сосудистой системы с ионной или неионогенных моющих средств, которые можно удалить клеточного материала из печени. В большинстве предыдущих исследований биологические бесклеточной печени леску достигалось перфузии печени с сочетанием лаурилсульфат натрия и TritonX100. В результате все клетки были удалены, в то время как структура внеклеточная матрица была сохранена. Подмости органа были заполнения с зрелые клетки, гепатоцеллюлярной, а также линии эндотелиальных клеток и первичных гепатоцитов с или без одновременного применения эндотелиальных клеток или мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Большинство исследователей сосредоточиться на ex vivo печени инженерных3,4,5,6,,78,9,10, 11,12,,1314. Однако в большинстве предыдущих исследований, только небольшие кусочки перезаполняется эшафот кубики были пересажены в различных heterotopic имплантации сайтов. В нескольких исследованиях частичное перезаполняется леса были пересажены как вспомогательные трансплантата. Однако время максимальной сообщил выживания был только 72 h8,14. Насколько мы знаем, трансплантация ортотопическая repopulated полный печени трансплантата еще не были выполнены или публикации о. Еще в младенческом долгосрочные функции и трансплантации органов инженерии. Таким образом требуется альтернативный подход к конструированию ex vivo печени.
В естественных условиях печени инженерия может представлять альтернатива для изучения печеночная заселение в физиологических условиях. Преимущества в vivo печени техники по сравнению с ex vivo печени инженерных многообразны. В естественных условиях перезаполняется частичной печени эшафот подвергается перфузии крови физиологических с надлежащей температуры, достаточно кислорода, питательных веществ и факторов роста в отличие от ex vivo перфузии с искусственной питательной среды. Кроме того остальные частично нормальной печени поддерживает функцию печени, главным образом позволяя долгосрочного выживания. Поскольку еще не в состоянии поддерживать долгосрочное выживание экспериментальных животных, его функции печени8имплантированных ex vivo инженерии печени трансплантата, мы предполагаем, что в естественных условиях частичной печени engineeringwould в конечном итоге стать перспективные модели для дальнейшего изучения эволюции инженерии печень с длительного выживания наблюдений чем ex vivo.
Недавно один исследовательская группа (Pan и коллеги) в первый раз, представил технику в vivo печени инженерных15. Они достигли изолированной перфузии правой нижней доли печени в жизни крыс несмотря на анатомических и технические проблемы. Они сообщили, интраоперационная первые результаты в vivo заселение с помощью линии клеток первичного гепатоцитов крыс. Однако в естественных условиях хирургического перфузии модель Пан et al. есть недостатки. Они достигли перфузии один лепесток печени крыс за счет полностью блокируя воротной вены и нижней полой вены, которые могут причинить серьезный ущерб для животного. Экспериментальных крыс были принесены только после 6 часов времени интраоперационной наблюдения. Таким образом метод печени доли перфузии в естественных условиях требует дальнейшего улучшения добиться послеоперационных выживания.
Мы разработали модель Роман выживания в vivo печени доли перфузии, основанные на предыдущих исследований анатомии печени крыс16, техника катетеризации портальной вены для мониторинг гемодинамики в мышей17и печени биоинженерии 18 , 19. Ключевые шаги в процедуре приведены на рисунке 1A - 1E.
Этот способ подходит для тех, кто хочет использовать этот экспериментальный в vivo перфузии модель для фундаментальных исследований по частичной Органосохраняющая тактика лечения инфузии с наркотиками, в естественных условиях decellularization как химические резекции заболеваний органа (например , рак печени), в естественных условиях клеточной культуры в decellularized матрицу, сравнивая ex vivo двумерные и трехмерные клетки культуры систем20,21,,2223 , 24 , 25 , 26и в естественных условиях печени инженерных decellularization и заселения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В соответствии с законодательством Германии животных жилья и всех процедур. Все марлей, покрытие одежду и хирургических инструментов, газобетона и приготовленные перед операцией. Все процедуры проводятся в стерильных условиях.
1. Подготовка крысы для хирургической процедуры
- Крыса в камеру всасывание и анестезировать крыс с изофлюрановая 4% испаряется и 100% кислорода в 0,5 Л/мин для около 3 минут, до тех пор, пока крысы полностью под наркозом.
- Крысы из камеры индукции и измерить ее массы тела.
- Бритье мех хирургического региона на животе.
- Поместите животных обратно в изофлюрановая камеру для дополнительных 2 мин углубить анестезии.
- Место крысы на операционном столе в лежачем положении.
- Исправьте маска анестезии в рот регион крысы и держать животных, под наркозом с непрерывной газового потока изофлюрановая 2% испаряется и 100% кислорода со скоростью потока 0,5 Л/мин.
- Исправьте конечностей с кусочки ленты.
- Примените мазь ветеринар на оба глаза, чтобы избежать сухости.
- Администрировать бупренорфин 0,05 мг/кг подкожно, чтобы облегчить боль в период эксплуатации.
- Дезинфекция хирургические области живота с 3 раунда настойки йода, следуют 2 раундов 70% спирта.
- Место стерилизовать марлей в районе, где разрез будет производиться только оставить поле операции подвергаются живота.
- Перейдите к выполнить операцию при отсутствии мыс щепотка вывода рефлекс крысы.
2. лапаротомия крысы
- Сделайте поперечной брюшной кожи и мышц разрез с помощью ножниц и электрические коагулятор.
- Исправить и потяните мечевидного отростка сторону головы, с использованием 4-0 полипропилен шовный материал.
Примечание: Обратите внимание на Поднимите мечевидный процесс вертикально лучше выставить печени, но с осторожностью, чтобы избежать тяжелой дыхательной ограничения и удушья. - Откройте брюшной полости, потянув обе стороны брюшной стены к голове с двумя онкогорошину крючки подвергать печени.
- Обложка двенадцатиперстной и тонкой кишки в брюшной полости с смоченную марлю, чтобы избежать высыхания.
- Поднимите левой и правой средней доли, используя влажную марлю и удержать их от грудной клетки, чтобы лучше выставить рубчика печени.
- Место крысу под стереомикроскопом (8 крат).
- Удалите некоторые теплой соленой в брюшную полость и на поверхности печени и кишечника каждые несколько минут, для предотвращения высыхания в течение всей процедуры.
3. Создание объездной прохода внутри левой боковых лепестков
- Вскрыть левой воротной вены и перевязать его с 6-0 Шелковый шов на базе (рис. 2A).
- Блокировать левая печеночная артерия, левый желчных протоков левый средний воротной вены, левый средний печеночной артерии и левый средний желчных протоков с микро зажимы для предотвращения потока perfusate левой средней доле (рис. 2B).
- Отдельные левой боковых лепестков, отрезав окружающих связок мочку микро ножницами.
- Блокировать левой боковой печеночная Вена, зажима на основании левой боковых лепестков с микро зажимы (рис. 2 c).
Примечание: Не забудьте зажимают левой воротной вены также по ошибке. - Использование комаров зажимы держать лигатура левой воротной вены и сохранить вен с правильное напряжение для более поздних катетеризации.
- Тщательно сделать надрез на передней стенке левого воротной вены, проколов с катетером иглы жилище 24-G ( рис. 3A).
Примечание: Для создания объездной дороги, необходимы сосудистого доступа точки на левой воротной вены и левая печеночная Вена. Для этого шага желательно создать сосудистого доступа путем прокола судов с иглой, вместо того, чтобы сделать большой разрез с помощью ножниц. Это уменьшает риск кровотечения и позднее стенозом. - Снимать катетер и взять иглу из катетера для получения катетера игла свободный 24-G.
- Подключите катетер к трубе перфузии, из которого другой конечной точке подключается к 20 мл шприца с 15 мл 40 гепаринизированным ед/мл физиологического раствора на перфузионный насос.
- Включите насос для perfusing трубки высылать из воздуха из трубки и катетера игла бесплатно.
- Выключите перфузионного насоса.
- Опять же вставьте бесплатно иглы катетера в левой воротной вены через прокалываться разрез на ключе (рис. 3B).
Примечание: Ввиду того, существует весьма ограниченное пространство для фиксации катетер, он не фиксируется на данный момент. Таким образом, хирург должен использовать уход чтобы избежать перемещения канюлированной катетера. - Тщательно сделайте еще один разрез на периферии региона подвергаются левой боковой печеночной вены, проколов с катетером иглы жилище 22 - или 24-G (рис. 3 c).
Примечание: Рекомендуется, что катетер будет немного меньше, чем судна. - Снимать катетер и взять иглу из катетера для получения катетера игла бесплатно 22-G.
- Включите перфузионный насос для perfuse гепаринизированным физиологического раствора в левой боковых лепестков через 24-G канюлированной иглы бесплатно катетер левой Вены портал со скоростью потока 0,5 мл/мин.
- Использование сухой марлей поглощать вне Измельчитель отходов жидкости вокруг области разреза левой боковой печеночной вены.
- Иглу левой боковой печеночной вены через прокалываться разрез Вены с 22-G бесплатно иглы катетер, чтобы генерировать жидкости розетки для сведения к минимуму загрязнения внутрибрюшного (рис. 3D).
Примечание: Технически трудно исправить канюлированной катетер к доле печени. Таким образом хирург следует обратить внимание, чтобы избежать перемещения катетера. Кроме того без катетеризации левой боковой печеночной вены с катетером, отходов жидкости могут также покрываться в регионе разрез Вены сухой марлей. - Держите perfusing левой боковой доли с гепаринизированным физиологического раствора около 20 мин (Группа 1) и затем только с saline за 2 ч, ч. 3 или 4 h (группы 2, Группа 3 и Группа 4, соответственно).
- Выключите насос, чтобы остановить перфузии.
4. физиологические реперфузии левой боковых лепестков
- Снимите оба катетеров из левой воротной вены и левой боковой печеночной вены.
- Закройте разрез левой воротной вены с швом полиамида 11-0.
- Закройте разрез левой боковой печеночной вены с 11-0 полиамид швом, а также.
- Разожмите левой боковой печеночной вены.
- Разожмите левый средний воротной вены, левый желчных протоков и левая печеночная артерия.
- Отрежьте лигатура на левой воротной вены возобновить Вену.
5. Закрытие брюшной стенки
- Закройте слой мышц брюшной стенки, прерванный ушивание с швом рассасывающиеся полиглактин 910 4-0.
- Закройте слой кожи брюшной стенки, прерванный ушивание с швом рассасывающиеся полидиоксанон 4-0.
- После закрытия брюшной полости, лечить кожный разрез с 70% спирта.
6. послеоперационное лечение крысы
- Поместите животное на потепление площадку для реанимации для около 10 мин и затем положить его в новой клетке.
- Администрировать бупренорфин 0,05 мг/кг подкожно 2 x в день подряд 3 d после операции освободить боли.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Двенадцать мужчин (в возрасте 12 - 13 недель) Льюис крыс были использованы для оценки эффекта выборочной доли печени перфузии. Эксперимент проводился на четыре группы (n = 3 крысы на группу). С помощью различных перфузии периодов по 20 минут, 2 часа, 3 часа и 4 часа, следующие шаги, описанные выше, мы успешно достигнуты в естественных условиях один лепесток перфузии.
В естественных условиях...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Блокирование и cannulating левой воротной вены с катетером как жидкости впуска и левой боковой печеночной вены с другой катетер как жидкости розетки, мы успешно созданы в vivo жидкости объездной в левой боковых лепестков, показывая, что Хотя метод является крайне сложной из-за небольшого размера судов для катетеризации и высоким риском причинения кровотечения, это возможно. Даже крысы, переживает период длительного перфузии 4 часа пережили по крайней мере 1 неделя, показаны, что крысы могут терпеть это хирургиче...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Jens Geiling из Института анатомии я, Йена университетской больницы, для производства схематические чертежи Анатомия печени крыс.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Перфузионный насос | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Катетер | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0,74&раз; 19 мм |
| Versatus-W Катетер | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0,9&раз; 25 мм |
| микрохирургический инструмент | |||
| микроножницы | F· S· L | No 14058-09 | |
| микросеррефин | F· S· L | No18055-05 | |
| Аппликатор микрозажимов | F· S· L | No 18057-14 | |
| Прямой микрощипцы | F· S· L | No 00632-11 | |
| Изогнутые микрощипцы | F· S· L | No 00649-11 | |
| микроиглодержатель | F· S· L | No 12061-01 | |
| общехирургические инструменты | |||
| стандартные сиссоры | F· S· L | ||
| зажим для комаров | F· S· L | ||
| зубчатый щипец | F· S· L | ||
| зубчатый щипец | F· S· L | ||
| иглодержатель | F· S· L | ||
| шовный материал | |||
| 4-0 пролен | этикон | ||
| 4-0 ЭТИКОН*II | этикон | ||
| 6-0 шелковый | этикон | ||
| 11-0 полиамид | этикон |
Ссылки
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955(2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003(2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474(2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
