Методическая статья

Изучение рибонуклеотид включение: Обнаружение Strand конкретных Ribonucleotides в геноме дрожжей и измерения рибонуклеотид индуцированного мутагенеза

DOI:

10.3791/58020

⸱

26 июля 2018 г.

 ,  , 
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ribonucleotides относятся к числу наиболее распространенных неканонических нуклеотидов, включения в Геном эукариот ядерных репликации ДНК. Если удалены не должным образом, ribonucleotides может вызвать повреждение ДНК и мутагенез. Здесь мы представляем две экспериментальные подходы, которые используются для оценки обилие рибонуклеотид включения в ДНК и мутагенных эффектов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наличие ribonucleotides в ядерной ДНК было показано, быть источником геномной нестабильности. Степень включения рибонуклеотид могут быть оценены щелочной гидролиз и электрофорез геля, как РНК, является очень восприимчивы к гидролизу в щелочных условиях. Это, в сочетании с юга блот анализ может использоваться для определения местоположения и прядь в который были включены ribonucleotides. Однако эта процедура является только полуколичественного и не может быть достаточно чувствительным, чтобы обнаружить небольшие изменения в содержании рибонуклеотид, хотя Южная помарка стренги конкретных зондирующего улучшает чувствительность. Как мера одного из самых ярких биологических последствий ribonucleotides в ДНК спонтанного мутагенеза могут быть проанализированы с использованием пробирного вперед мутации. Используя соответствующие репортер генов, редкой мутации, которые приводит к потере функции может быть отдельных и общих и конкретных мутаций ставки может измеряться путем объединения данных из колебаний эксперименты с секвенирования ДНК гена репортера. Assay колебания применимо рассмотреть широкий спектр мутагенных процессов в конкретных генетический фон или условий роста.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время эукариотических ядерных репликации ДНК ribonucleotides включены в геноме всех трех основных replicases ДНК, ДНК полимеразы (Pols) α, ε и δ1,2. РНКазы H2-зависимых рибонуклеотид иссечение ремонт (3RER) удаляет большинство этих встроенных ribonucleotides.

Рибонуклеотид в ДНК подвержен гидролизу, как 2' гидроксильной группы части молекулы сахара может атаковать прилегающих Фосфодиэфирная связь, выпустив один конец с 2' - 3' циклических фосфата и другой с 5'-OH-4. Щелочная среда может значительно ускорить эту реакцию. Таким образом гидролиз встраиваемых ribonucleotides во время инкубации в основной раствор вызывает фрагментацию геномной ДНК, которые могут быть визуализированы щелочной агарозы электрофорез5. ДНК может быть передана мембраны и исследован, Южная помарка анализа с помощью зондов нити конкретные, которые позволяют выявлять щелочно чувствительных участков, вызванные ribonucleotides, включены в зарождающейся ведущих - или теплоизоляции strand ДНК, соответственно.

В клетках дрожжей не хватает активности РНКазы H2 удаление ribonucleotides может быть инициировано когда Топоизомераза I (Top1) Никс ДНК на встраиваемых рибонуклеотид6,7. Однако когда Top1 расщепляет на стороне 3' рибонуклеотид, это генерирует 5'-OH и 2' - 3' циклических фосфат ДНК концы которые огнеупоров для religation. Неспособность ремонт, или аномальным обработка этих «грязные концы» может привести к геномной нестабильности. Кроме того если разрез происходит внутри повторяющихся последовательностей ДНК, процесс восстановления может привести к удаления мутации. Это особенно проблематично для тандемные повторы, где короткие удаления (из между 2 и 5 пар оснований) обычно наблюдается в клетках РНКазы H2-недостаточным. Top1-зависимых пагубные последствия в отсутствие дрожжей РНКазы H2 активности усиливаются в прослушивающем для включения рибонуклеотид во время зарождающейся ведущих стренги синтеза мутант ε ДНК-полимеразы (pol2-M644G).

Обработка ribonucleotides в ДНК приводит к спонтанной мутации и этот мутагенеза можно обнаружить с помощью соответствующих репортер генов, выбрав для сопровождающих фенотипические изменения. Колебания тест или Лурия и Дельбрюк эксперимент является одним из наиболее часто используемых методов для измерения скорости спонтанной мутации, с помощью выбираемых репортер генов8,9. В дрожжей URA3 и CAN1 генов может использоваться как журналистам в assay вперед мутации, которая позволяет для обнаружения всех типов мутаций, приводящих к потере функции гена. Уровень спонтанной мутации оценивается как средний показатель наблюдается для нескольких параллельных культур, начал с одной колонии без мутации в гене репортер целевой. Дрожжи, RNase H2-недостаточным напрягаться, такие, как rnh201Δ имеет умеренно повышенной скоростью целом спонтанной мутации, во многом вызванные повышенной заболеваемости 2-5 bp удалений в тандеме повторить последовательности. Таким образом чтобы полностью характеризуют мутагенных эффектов ribonucleotides в геноме, скорости конкретной мутации должны определяться. В этом случае URA3 или CAN1 репортер генов может быть усиливается и последовательности для определения типа и местоположения мутаций, и скорости конкретной мутации могут быть рассчитаны. Компиляция мутации, определены в нескольких независимых URA3 или CAN1 мутантов, затем может использоваться для создания спектра мутаций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. щелочной гидролиз и специфичные для Strand Южная помарка (рис. 1)

  1. Геномная ДНК изоляции и рост клеток
    1. Изолируйте дрожжи геномной ДНК с помощью дрожжей ДНК очистки комплект следуя инструкциям производителя. Использование культуры, которые находятся в экспоненциальной фазе роста между (оптической плотностью 0,5) и 1. Ресуспензируйте окончательный Пелле ДНК в 35 мл 1 x TE буфера (10 мм трис-HCl, pH 7.5, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)).
    2. Добавьте 1 mL 5 мг/мл РНКазы A ДНК и Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
    3. Осадок ДНК, с использованием 0.1 объемов ацетат натрия 3 M (рН 5.2) и 2,5 томов 100% этанола для 20 мин на льду.
    4. Центрифуга на 16000 x g 20 мин при 4 ° C. Удалите с помощью пипетки супернатант.
    5. Помойте лепешка дважды с 500 мл 70% этанола. Удалите с помощью пипетки супернатант.
    6. Сухие гранулы на скамейке и Ресуспензируйте 35 мл 1 x TE буфера.
    7. Quantitate ДНК, используя dsDNA BR Assay комплект fluorimeter (Таблица материалов).
    8. Осадок 5 мг от каждого образца, используя 0.1 томов 3 M ацетат натрия, рН 5.2 и 2.5 тома 100% ДНК EtOH для суммарный объем 200 мл (добавить H2O, если необходимо, дополнительные 5 мг ДНК необходима, если необходим контроль нейтральных гель). Инкубируйте на льду за 20 мин.
    9. Центрифуга на 16000 x g 20 мин при 4 ° C. Удалите с помощью пипетки супернатант.
    10. Сухие гранулы на скамейке. Ресуспензируйте ДНК в 14 мл H2O.
  2. Щелочной гидролиз и гель электрофорез
    1. Добавить 6 мл 1 м Кох и Инкубируйте на 55 ° C за 2 ч.
    2. Проинкубируйте образцы на льду на 5 мин.
    3. Добавить 4 мл 6 x щелочная ДНК загрузки буфера: 300 мм Кох, 6 мм ЭДТА, рН 8,0, 18% polysucrose (Таблица материалов), 0,15% бромкрезоловый зеленый и 0,25% ксилола cyanol FF.
    4. Литой щелочного гель, который состоит из агарозы 1%, 50 мм NaOH, ЭДТА 1 мм, pH 8.0. Используйте расческу, что позволяет быть загружены на переулок 24 мл образца ДНК.
    5. Побегите гель при комнатной температуре в 1 x буфер электрофореза щелочной: 50 мм NaOH, 1 ЭДТА, рН 8.0. Включать соответствующий маркер размера ДНК.
    6. Спин вниз трубы кратко и загрузить весь 24 мл образца в щелочной агарозном геле. Electrophorese 30 мин в 30 V, а затем 18-20 h 10 V.
    7. Нейтрализовать гель для 2 инкубаций 45 мин при комнатной температуре с нежным агитации в нейтрализации буфера I: 1 М трис-HCl, 1,5 М NaCl.
    8. Пятно ДНК путем замачивания нейтрализованы гель в 200 мл воды, содержащие 1/10000 разрежения золото SYBR пятно втечение 2 ч при комнатной температуре с нежным встряхивания.
    9. Визуализация с помощью УФ transilluminator ДНК. Увеличение щелочно чувствительность приводит к появлению небольших фрагментов ДНК, указывающее плотность неустраненный ribonucleotides в ДНК5.
  3. Южный передачи
    1. Передать ДНК из щелочного гель мембрана положительно заряженный нейлон капиллярность10. Пример того, как можно настроить этот перевод предоставляется в Sambrook и Рассела ручной10.
    2. Замочите щелочного гель для 15 мин при комнатной температуре в щелочной передачи буфера: 0.4 М NaOH, 1 M NaCl.
    3. Влажный нейлон мембраны (нарезанные по размеру геля) кратко с водой, а затем замочить на 5 минут в щелочной передачи буфера.
    4. Настройка трансферной платформе, инвертирование 3 стеклянные стаканы (100 мл) в стакан для выпечки. Это блюдо должно быть немного больше, чем размер геля агарозы. Установите стеклянную пластину поверх них.
    5. Драпировка 2 больших бумажки 3 мм ЦПЧ хроматографии (нарезанные по размеру ширины гель плюс больше сторон, которые могут драпировка над краями в буфер водохранилище) над стеклянной пластиной.
    6. Залить щелочного буфера передачи бумажной хроматографии и наполовину заполнить стеклянную посуду. Зачищают пузыри с помощью пипетки стеклянные 5 мл.
    7. Гель агарозы место на вершине, снова разглаживания пузырьков. Окружают всем краям геля с парафина. Налейте небольшое количество щелочного буфера передачи на геле.
    8. Место предварительно замоченные нейлон мембраны поверх геля. Зачищают пузыри.
    9. Мокрые 2 бумажки нарезанные по размеру геля агарозы. Разместите их на вершине мембраны и сгладить любые пузыри.
    10. Место большой стек бумажных полотенец (вырезать по размеру чуть больше, чем геля агарозы) поверх передачи сэндвич. Осторожно поместите стеклянную пластину поверх бумажные полотенца. Добавьте объект взвешенный на вершину (книга с массой 400 g работает хорошо).
    11. Пусть передачи перейти на ночь при комнатной температуре.
    12. Тщательно разобрать стек передачи и замочить мембрана для 15 мин при комнатной температуре в нейтрализации буфера II: 0.5 М трис-HCl, рН 7,2, 1 M NaCl.
    13. Crosslink ДНК заряженных нейлон мембраны с помощью УФ сшивателя. Мембрана в крест-компоновщик и использовать параметр autocrosslink.
  4. Подготовка Южной зонд
    Примечание: Подход, описанный здесь, чтобы обнаружить щелочно чувствительных участков в зарождающейся ведущих-против отстает нити ДНК на основе протокола ранее опубликованы11. Для нашего эксперимента зондирование выполняется на URA3 Репортер ген, который был вставлен в одном из двух направлений (или1 или OR2) рядом с ARS306 репликации происхождения на хромосоме III (рис. 3A). Присутствие щелочно чувствительных участков в геномной ДНК дрожжей является показателем рибонуклеотид включения, что позволяет использовать ribonucleotides как биомаркеров ДНК-полимеразной активности12,13,14. Этот подход, с помощью целевого объекта последовательности ДНК, прилегающих к эффективной ARS306 происхождение репликации, должны поддаваться других геномной мест и генов-мишеней.
    1. ПЦР усиливают 520-база сегмент пара гена URA3 репортер, используя следующие пары праймера: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) и URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
    2. Выполнить с помощью 10-20 нг дрожжей геномной ДНК как шаблон, 4 мкл каждого праймера (10 мкм бульон), 10 мкл 10 x Ex Taq буфера (мг2 + плюс), 8 мкл dNTP смеси (по 2,5 мм), 0.5 мкл из Ex полимераза дна Taq реакции PCR (5 U/мкл) и окончательного громкость до 100 мкл с H2O.
    3. Запустите следующую программу ПЦР: 95 ° C за 5 мин; 30 циклов 95 ° C за 1 мин, 55 ° C за 1 мин., 72 ° C на 2 мин; 72 ° C для 10 мин и удерживайте при 4 ° C.
    4. Очистить продукт PCR, используя комплект для очистки ПЦР и элюировать ДНК, используя 50 мл H2O. Это теперь может использоваться как шаблон в radiolabeling реакции.
    5. Используйте следующие Праймеры для нити конкретных radiolabeling: использование URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) для визуализации ДНК, которая anneals к зонду A. Это соответствует зарождающегося ведущих нити ДНК при URA3 в OR2 и tnascent, отставание нити ДНК, когда URA3 в или1. Использовать URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) для визуализации зарождающейся ДНК, которые anneals к зонду б. Это соответствует зарождающегося ведущих нити ДНК, когда URA3 в или1 и зарождающейся отстающих нити ДНК при URA3 в OR2 (рис. 3).
      1. Выполнить radiolabeling реакции, с помощью 10-20 нг усиленный URA3 фрагмент как шаблон ДНК, 2 мкл грунтовка (10 мкм бульон), 5 мкл 10 x Ex Taq буфера (мг2 + плюс), 4 мкл дНТФ 2,5 мм (минус дЦТФ), 5 мкл (50 МККИ) -32P-дЦТФ , 0.5 мкл ExTaq ДНК-полимеразы (5 U/мкл) и окончательного громкость до 50 мкл с H2O. Run следующие программы для radiolabeling: 94 ° C за 5 мин; 25 циклов 94 ° C за 1 мин, 55 ° C за 30 s, 72 ° C в течение 1 мин; 72 ° C за 5 мин и удерживайте при 4 ° C.
    6. Для удаления неинкорпорированных радиоактивных лейбл используйте столбец G-25 спина. Прежде чем добавлять radiolabeled образца, центрифуга столбце 1 мин на 720 x g и removethe буфера, закупорить. Загрузите продукт radiolabeled реакции и центрифуги для 2 мин на 720 x g элюировать помечены зонд.
    7. Инкубируйте на 95 ° C за 5 мин до денатурировать зонда непосредственно перед гибридизации. Прохладный кратко на льду.
  5. Южный гибридизации
    1. Roll увлажненный мембраны в гибридизации трубку и добавить 25 мл свежеприготовленные гибридизации буфера: 0.5 M натрия фосфат буфера, pH 7.2, 7% додецилового сульфата натрия (SDS), 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Инкубируйте на 65 ° C для 1-2 ч с вращением в печь гибридизации.
    2. Тщательно слейте раствор и добавить 25 мл буфера гибридизации плюс радиоизотопами зонд. Инкубируйте на 65 ° C для 16-18 ч с вращением.
    3. Слейте раствор в контейнер радиоактивных отходов. Выполните 5 моет 5 мин при комнатной температуре с фосфат-SDS стирки решение I: 40 мм натрия фосфат буфера, рН 7,2, 5% SDS, 0,5% BSA, 1 мм ЭДТА, рН 8.0.
    4. Выполнить 2 моет 15 мин при 65 ° C с фосфат-SDS стирки решение II: фосфат натрия буфера 40 мм, pH 7.2, 1% SDS, 1 мм ЭДТА, рН 8.0.
    5. Удаление мембраны из трубки гибридизации с помощью пинцета и место в ограничитель открыл пластиковый рукав. Обложка и подвергать изображений пластины. Попробуйте несколько различных воздействия раз до 4 d 4 h.
    6. При необходимости, полосы и повторно зонд пятно с помощью различных зонда примерно 3 - 4 раза. Раздеться, Проинкубируйте мембрану на 2 ч при температуре 65 ° C 25 мл 50% формамида, 2 x SSPE решения.
      Примечание: 20 x SSPE Стоковый раствор: 3 M NaCl, 0,2 М NaH2PO4, 0,02 М ЭДТА, рН 7,4.
    7. Слейте раствор в контейнер радиоактивных отходов. Выполните 2 моет 15 мин при температуре 65 ° C в фосфат-SDS мытья решения II.
    8. Проверьте мембраны с Гейгера и повторите зачистки протокол, если сигнал остается.
    9. Выполнение предварительно гибридизации и гибридизации, как описано выше.

2. Измерение мутации темпы и специфику штаммов S. cerevisiae

  1. Подготовить культура клетки
    1. Прививать единую колонию (здоровый дрожжи клетки занимает 2-3 дня при 30 ° C в форме надлежащего размера колоний) вырос на агаре YPD дополнена аденин 100 мг/мл 5 мл YPDA бульон с аденином 250 мг/мл (добавок аденин необходимо, только если штамм используется является аденин auxotroph). Растут в шейкер инкубатор или на вращателе при 30 ° C до тех пор, пока культура достигает насыщения (36-48 h для деформации без дефекта серьезный рост).
    2. Спин вниз клетки на ~ 2000 x g за 5 мин.
    3. Отменить супернатант и вымыть клетки с 5 мл стерильной воды.
    4. Ресуспензируйте клетки в 500 мл стерильной воды.
  2. Разбавление культуры клеток и обшивка
    1. -Выбор элементов управления разбавляют клетки в 96-луночных тарелку с коэффициентом 1,600,000 и пластины 100 мл каждой культуры на полную тарелку (COM).
    2. Чтобы выбрать для ura3 мутантов, тарелка 100 мл неразбавленного клеток на 5-фр пластину для штамма (WT) одичал тип. Разбавьте клетки соответственно, если уровень мутации штамма интерес, как ожидается, будет выше, чем в WT штамм.
    3. Чтобы выбрать для can1 мутантов, разбавленные клетки 5 раз и пластины 100 мл на canavanine содержащие пластину (CAN) для штамма WT. Коэффициент разрежения — 0,5.
    4. Инкубируйте пластины при 30 ° C до формы колонии дрождей. Для штаммов без роста дефект 2-3 дня обычно достаточно для COM и может пластины и 3-5 дней для тарелок 5-фр. Чтобы сравнить скорости мутации между разными штаммами, лучше выбрать тот же день роста для подсчета колоний. Храните пластины, готовы быть подсчитанным в холодной комнате (~ 4 ° C).
  3. Расчет ставки спонтанной мутации
    1. Количество видимых колоний на каждой пластине и принять к сведению колонии чисел
    2. Рассчитать уровень мутации, Дрейка формуле: μ = f ÷ ln (μNt). f — частота мутаций, определяется количество мутантов, деленное на количество клеток в окончательном культуре. NT-это количество клеток в культуре окончательный и μ является уровень мутации. Это уравнение может быть решена путем итеративный метод как метод Ньютона-Рафсона. Существуют другие методы оценки, включая Леа и Coulson тест, чтобы вычислить стоимость мутации15.
    3. Вычислите при условии нормального распределения журнала доверительный интервал utation ставок отдельных изолятов. 95% доверительный интервал наиболее часто используется.
  4. Анализ спектра мутаций
    1. Выбрать один колонии от каждого 5-фр или может пластины и обновить на YPDA плите.
    2. Выполнять колонии PCR усиливает URA3 или CAN1 гена и последовательности с целью выявления мутаций, с использованием следующих грунтовок: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') и URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') для обоих амплификации PCR и секвенирование гена 800 URA3 ВР; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') и CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') для усиления и CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') и (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') для секвенирования 1800 bp CAN1 Репортер ген.
    3. Чтобы выполнить колонии PCR, Ресуспензируйте единую колонию в 5 мкл H2O и использовать 1 мкл в качестве шаблона. Добавить 1 мкл каждого из грунтовки (5 мкм бульон), 2 мкл (мг2 + плюс) 5 x KAPA2G буфера, 0.5 мкл dNTP (2,5 мм), 0.5 мкл из KAPA2G быстро ДНК-полимеразы, 12 мкл H2O.
    4. Для амплификации гена URA3 , запустите следующую программу ПЦР: 95 ° C за 5 мин; 5 циклов 95 ° c 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C за 30 сек; 35 циклов 95 ° C 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C за 30 сек; 72 ° C для 2 мин и удерживайте при 4 ° C. Для амплификации гена CAN1 , запустите следующую программу ПЦР: 95 ° C за 5 мин; 5 циклов 95 ° c 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C для 45 s; 35 циклов 95 ° C 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C для 45 s; 72 ° C для 2 мин и удерживайте при 4 ° C.
    5. Совместите результаты секвенирования последовательности ссылку, используя такие программы, как DNASTAR Seqman Pro или Sequencher для выявления мутаций.
    6. Сбор данных мутации мутации типа (рис. 4) или мутация местоположение (рис. 5). Вычислить конкретные мутации ставки по частоте мутаций (количество событий, наблюдается делится на количество мутантов виртуализированных) умножается на общий уровень мутации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лечение геномной ДНК щелочью, следуют щелочного гель-электрофорез позволяет для полуколичественного определения фрагментацию ДНК из-за обилия стабильно включены ribonucleotides. Рисунок 2 показывает изображения гель дрожжей геномной ДНК относились с или без Кох5. M644L вариант Pol2, каталитическая субъединица Polε, снизил способность включать ribonucleotides, в то время как мутант M644G включает в себя более ribonucleotides чем WT поли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протоколы для двух наборов экспериментов, которые часто используются для полу количественно анализа включены во время репликации ДНК и мутагенных эффектов неустраненный ribonucleotides ribonucleotides. Хотя эти подходы включают модель эукариоты S. cerevisiae, эти методы можно легко адаптировать для других микробов и даже высших эукариот.

Зондирования для неустраненный ribonucleotides в ДНК с помощью щелочной агарозы в сочетании с Южный blotting предоставляет важную ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим всех нынешних и бывших членов Канкел лаборатории за их работу и обсуждения связанных с протоколом и повторно использованы данные, представленные здесь. Эта работа была поддержана проект Z01 ES065070 для T.A.K. из отдела интрамуральных исследования национальных институтов здравоохранения (НИЗ), Национальный институт окружающей среды медицинских наук (NIEHS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
YPD20 г декстрозы, 20 г пептона, 10 г дрожжевого экстракта, в деионизированном H2O до 1 л, добавить 20 г бакто-агара для твердых сред, автоклав.
COM планшеты1,3 г смеси капель SC, 1,7 г дрожжевого азота без аминокислот или (NH4)2SO4, 5 г (NH4)2SO4, 20 г декстрозы, 20 г Bacto агар деионизированный H2O до 1 л. Отрегулируйте pH до 5,8. Автоклав и 30 – 35 мл на тарелку.
CAN планшеты1,3 г порошка SC-Ura dropout, 1,7 г дрожжевого азота без аминокислот или (NH4)2SO4, 5 г (NH4)2SO4, 20 г декстрозы, 20 г бактоагара, 25 мг урацила и H2O до 1 л. Автоклав в течение 15 минут при температуре 121&�; С и остудить до 56°С. Добавьте 6 мл стерилизованного фильтром 1% раствора сульфата канаванина.
5-FOA планшеты1,3 г порошка SC-Ura dropout, 1,7 г дрожжевого азота без аминокислот или (NH4)2SO4, 5 г (NH4)2SO4, 20 г декстрозы, 20 г бактоагара, 25 мг урацила и H2O до 800 мл. Автоклав в течение 15 минут при температуре 121 °°; С и охладить до 60°С. Добавьте 200 мл стерилизованного фильтром 0,5% раствора 5-FOA.
L-Канаванина сульфатUS BiologicalC1050
5-FOAUS BiologicalF5050
20 мл стеклянная культуральная пробиркаЛюбая марка
Ротатор культуры в 30 °°; C инкубаторШейкер Инкубатор можно использовать вместо
96 хорошо круглых донных пластинСтерильные, любой марки
3 мм стеклянные шарикиFisher Scientific11-312AАвтоклав перед использованием
12-канальные пипеткиЛюбая марка
Ex Taq DNA Полимераза TaKaRaRR001
Epicentre MasterPure Дрожжевые ДНК Набор для очисткиEpicenterMPY80200
3 М ацетат натрияSigma-AldrichS7899
100% этанол
Qubit 2.0 ФлуориметрInvitrogenQ32866Доступна более новая модель
dsDNA BR Набор для анализаInvitrogenQ32850
KOHSigma-Aldrich221473
ЭДТАСигма-ОлдричE7889
Ficoll 400Dot Scientific Inc.
Бромокрезол зеленыйEastman6356
Ксилол цианол FFInternational Technologies Inc.72120
NaOHSigma-AldrichS8045
1 м трис-HCl (pH 8,0)TeknovaT5080
SYBR Гель для окрашивания золота нуклеиновой кислотойInvitrogenS11494
УФ-трансиллюминатор
Amersham Нейлоновая мембрана Hybond-N+GE HealthcareRPN303B
3 MM CHR Хромографическая бумагаWhatman3030-392
NaClCaledon7560-1
Stratalinker 1800Stratagene
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
G-25 спин-колонкаGE Healthcare27-5325-01
1 M Буфер фосфата натрия (pH 7,2)Sigma-Aldrich2PO4 (S9638);
Na2HPO4 (S9390)
SDSSigma-AldrichL4522
BSASigma-AldrichA3059
ФормамидSigma-Aldrich47671
Гейгера
Среда DSF10400Счетчик

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
  2. Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
  3. Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
  4. Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
  5. Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
  6. Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
  7. Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
  8. Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
  9. Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
  10. Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  11. Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407(2011).
  12. Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
  13. Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
  14. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
  15. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
  16. Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
  17. Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
  18. Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
  19. Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
  20. Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016(2012).
  21. Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
  22. Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи