Method Article

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

DOI:

10.3791/58030

⸱

October 5th, 2018

 ,  , 
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выявление физических взаимодействий между генов и нормативных элементов сложной но способствовала хромосома конформации захвата методами. Эта модификация 4C-seq протокол смягчает ПЦР предвзятости, сведения к минимуму чрезмерного амплификации PCR шаблонов и максимально mappability чтений путем включения добавлением энзима ограничения дайджест шаг.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выявление нормативных элементов для заданного целевого гена представляет значительную техническую проблему ввиду изменчивости размеров позиционирования и эффект нормативных элементов целевого гена. Некоторый прогресс был достигнут с bioinformatic прогноз существования и функции проксимальной эпигеномные изменения, связанные с активированной гена выражением, с использованием сайтов связывания фактор транскрипции сохраняется. Хроматин конформации захвата исследования революционизировали нашу способность обнаружить физические хроматина контактов между последовательностями и даже в пределах всего генома. Круговой хроматина конформации захвата в сочетании с следующего поколения последовательности (4C-seq), в частности, предназначен для обнаружить все возможные физические хроматина взаимодействия для заданной последовательности интерес (точки зрения), например целевого гена или регулирования усилитель. Нынешние стратегии 4C-seq непосредственно последовательности от в пределах точки зрения, но требуют многочисленные и разнообразные точки зрения одновременно упорядочивать избежать технических проблем единой базы вызова (томография) с виртуализации платформ следующего поколения. Этот объем экспериментов не может быть практичным для многих лабораторий. Здесь мы приводим модифицированный подход к Протоколу 4C-seq, который включает в себя дополнительные энзима ограничения дайджест и шаги на основе ПЦР амплификации, которые предназначены для содействия большей захват последовательности различных чтений и уменьшить потенциал для ПЦР смещения, соответственно. Наш модифицированный метод 4C поддаются стандартным молекулярной биологии лаборатории для оценки архитектуры хроматина.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В проекте Энциклопедия элементов ДНК (кодирования), всесторонне аннотированной функциональной активности для 80% генома человека1,2способствует выявление нормативных элементов для экспрессии генов. Определение участков в естественных условиях привязки фактор транскрипции, DNaseI Гиперчувствительность и эпигеномные гистона и изменения метилирования ДНК в типах отдельных клеток проложили путь для функционального анализа регулирования кандидата элементы для целевого выражения гена. Вооружившись этими выводами, мы сталкиваемся с проблемой определения функциональной взаимосвязи между регуляторных элементов и генов. В частности какова взаимосвязь между данной цели ген и его enhancer(s)? Метод capture (3C) конформации хроматина непосредственно решает этот вопрос выявления физических и вероятно, функциональных, взаимодействия между региона интерес и кандидат, взаимодействующих последовательности через события в фиксированных хроматина3 . Как наше понимание хроматина взаимодействий увеличилось, однако, становится ясно, что расследование предварительно кандидат локусов является недостаточным для обеспечения полного понимания взаимодействия генов усилитель. Например кодирования для изучения небольшую часть генома человека (1%, экспериментальный набор 44 локусов) использовался метод carbon copy (5C) захвата высок объём хромосомных конформации и сообщил сложные взаимосвязи локусов. Гены и усилители с выявленными взаимодействий в среднем 2 – 4 различные взаимодействия партнеров, многие из которых были сотни kilobases в линейное пространство4. Кроме того, Li и др. используется анализ взаимодействия Chromatin, сопряженные-конец тега виртуализации (ChIA-PET) для анализа состава геном промоутер взаимодействия и обнаружил, что 65% РНК-полимераза II привязки сайтов были вовлечены в хроматина взаимодействий. Некоторые из этих взаимодействий привели к большой, мульти гена комплексы, охватывающей сотни kilobases геномной расстояния и содержащий, в среднем, 8-9 генов каждый5. Вместе эти выводы подчеркивают необходимость объективной всего генома методы допроса хроматина взаимодействий. Рассматриваются некоторые из этих методов в Шмитт и др. 6.

Более последние методы хроматина конформации захват исследований в сочетании с следующего поколения виртуализации (Hi-C и 4C-seq) включить обнаружение неизвестных последовательностей, взаимодействующих с регионом интерес6. В частности, круговой хромосома конформации захвата с секвенирование нового поколения (4C-seq) была разработана для выявления локусов, взаимодействующих с последовательностью интерес к непредвзято7 по секвенированию ДНК из захваченных хроматина проксимальнее области интереса в трехмерном пространстве. Вкратце хроматина фиксируется для сохранения своей родной протеин дна взаимодействий, расщепляется с энзима ограничения и впоследствии лигируют разбавляют условиях захватить биологически соответствующих «связок» взаимодействующих локусов (рис. 1). Для удаления белка, таким образом оставляя для дополнительных расщепления ДНК с второй энзима ограничения отменяются перекрестные ссылки. Окончательный лигирование генерирует меньше круги взаимодействующих локусов. Праймеры для последовательности интерес затем используются для создания усиливается библиотека неизвестных последовательностей из circularized фрагментов, следуют ниже по течению следующего поколения последовательности.

Протокол, представленные здесь, который фокусируется на пробоподготовку, делает два основных изменения существующих 4C-seq методы8,9,10,,1112. Во-первых он использует метод на основе ПЦР эмпирически определить оптимальное количество усиления циклов для 4C-seq библиотека подготовительных шагов и таким образом снижает потенциал для ПЦР предвзятости, обусловленной чрезмерного усиления библиотек. Во-вторых он использует дополнительное ограничение дайджест шаг в попытке уменьшить единообразия известных «наживка» последовательности, что препятствует точной базы вызова последовательности документа и, следовательно, максимально уникальный, информативный последовательности в каждой операции чтения. Другие протоколы обойти эту проблему путем объединения многих библиотек 4 C-seq8 (12-15) с различными приманки последовательностей и/или ограничения сайтов, объем экспериментов, которые не могут быть достижимыми в других лабораториях. Изменения, представленные здесь допускается небольшое количество экспериментов, образцы, и/или реплицирует быть проиндексированы и объединили в одну полосу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. энзима ограничения выбора

  1. Определить область интереса (например., промоутера генов, полиморфизм (SNP), усилитель) и получить последовательность ДНК из хранилищ, таких как Национальный центр по биотехнологии информации (NCBI).
  2. Идентифицировать кандидата энзимов ограничения (REs) для первого пищеварения энзима ограничения (RE1), не режут внутри последовательности интерес, которые производят липкие концы (ДНК Термини с свесы) после RE пищеварение, и чья деятельность не тормозится Метилирования CpG.
    Примечание: Разрешение данных определяется RE1. Фермент с последовательностью признание 6 пар (bp) производит, в среднем, фрагменты примерно 4 kilobases (КБ) в длину, в то время как фермент с 4 последовательности признание bp производит фрагменты приблизительно 250 bp в длину, позволяя точнее Идентификация взаимодействующих последовательностей.
  3. Выберите RE1 кандидат ферментов, выявленных в шаг 1.2, которая производит «точка зрения» ограничение фрагмент по меньшей мере 500 bp долго, которая включает области интереса или, альтернативно, соседнего региона.
    Примечание: Фермент выбран должны поддаваться грунтовка дизайн (см. шаг 2).
  4. Для второй пищеварение определите энзима ограничения (RE2) с 4 bp признание последовательностью, которая производит липкие концы (ДНК Термини с свесы) после RE пищеварение, чья деятельность не препятствует метилирования CpG, и что сокращение в пределах ограничения фрагмент, порожденных RE1 производить 250 – 500 bp приманки фрагмент (рис. 1).
    Примечание: Фермент выбран должны поддаваться грунтовка дизайн (см. шаг 2).

2. Разработка и испытания грунты для обратное PCR и эффективность переваривания ПЦР

  1. Используйте средство проектирования грунт как Primer3 (http://primer3.ut.ee) для разработки обратная грунты, которые направлены наружу на концах фрагмента приманки (т.е., грунтовка 5' является «реверс» праймер, дополняет стренги плюс, в то время как грунт 3'» нападающий «грунт, дополняющие стренги минус) и как близко к места ограничения как можно свести к минимуму амплификацию non информативный приманки последовательность и максимальной эффективности ПЦР (рис. 2A).
    Примечание: Грунты следует предсказано в silico ПЦР предсказания иметь минимальный усиление неспецифической от genomic дна и следует не выровнять других в геноме за исключением их намеченной цели с более чем 16/18 личности9. Как последовательность адаптеры не включаются в обратное PCR праймеры, сайт грунтовка привязки является более гибким, чем в других методов подготовки 4C; Грунты следует оптимально отжига в пределах 50 bp в конце соответствующего места ограничения.
    1. Подтвердите специфика обратное PCR праймеры, усилители, используя очищенного геномной ДНК (геномная ДНК) в качестве шаблона.
    2. Оптимальное грунтовки должны принести несколько продуктов при использовании геномная ДНК как шаблон (см. шаг 11.2 для описания ожидаемых продуктов 4C). В случае существенного усиления от геномная ДНК дизайн новой грунтовки. Если определены наборы не приемлемым грунт, вернитесь к шагу 1 и выберите новую приманку, выбрав новый энзимов ограничения.
  2. Дизайн ПЦР Праймеры для того чтобы усилить фрагменты 70 – 200 нуклеотидов (nt) в длину для контроля эффективности пищеварение ограничения (рис. 2B).
    1. Дизайн одной пары праймеров усиливать через каждый сайт ограничения (выбран на шаге 1), которые определяют последовательность приманки. Конструировать Праймеры для обоих RE1 (см. шаг 6.5.6) и RE2 сайты (см. шаг 9.2).
    2. Дизайн набор грунты, усиливает региона, не содержащие сайты для либо энзима ограничения как элемент нормализации (режиссерский ДНК) для RE1 и RE2 (см. также шаг 6.5.6).

3. сбор клеток

  1. С помощью метода, который подходит для ткани или клетки культуры, получите одну ячейку подвеска. Пелле клетки для 5 минут при 200 x g, удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл 1 x фосфатный буфер (PBS) за 107 клеток.

4. формальдегид Cross-linking клеток для сохранения Chromatin взаимодействия

  1. За 107 клеток, добавить 9,5 мл 1% электронной микроскопии (EM)-класс формальдегида (метанол бесплатно) в PBS и инкубировать, в то время как упасть на рокер (или аналогичный), за 10 мин при комнатной температуре (RT, 18-22 ° C).
    Примечание: Должны фиксации условия могут быть оптимизированы для каждого типа клеток. Ранее опубликованные работы в клетки мыши сообщили, что оптимальная фиксация результатов в по крайней мере 40% сопоставленных гласит, приведение в хромосоме, содержащие точки зрения9 предполагая не telomeric область для среднего размера хромосомы.
  2. Передача реакции трубы льда и добавить ледяной 1 М глицин в конечной концентрации 0,125 м (1.425 мл) для утоления реакции сшивания. Смешайте нежно инверсии.
  3. Центрифуга для 5 минут при 200 x g, 4 ° C и тщательно удалить супернатант. Хранить клетки Пелле-80 ° c или немедленно перейти к ячейке lysis.

5. Lysis клетки

  1. Ресуспензируйте Пелле клетки от шаг 4.3 в 500 мкл 5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) мыть. Центрифуга на 200 x g 5 мин на RT. удалить супернатант.
  2. Ресуспензируйте Пелле клеток в 125 мкл 5 мм ЭДТА с 0,5% натрия Додециловый сульфат (СДП) и 1 x ингибиторов протеазы, например 100 x коктейль, содержащий Антиболь 5 мг/мл, 10 мг/мл chymostatin, leupeptin 10 мг/мл и 10 мг/мл pepstatin а.
    Примечание: Концентрации моющего средства может должны быть оптимизированы для каждого типа клеток. Недостаточная концентраций детергентов приведет к неполной клеток лизиса, оставляя хроматина недоступными для энзимов ограничения. Если пищеварение ограничения сохраняющиеся низкие в шаге 6.5.6 и подтверждена активность фермента, могут потребоваться дополнительные моющего средства. Увеличение концентрации SDS с шагом 0,1%.
  3. Инкубируйте суспензию клеток на льду за 10 мин.
    Примечание: Для первичной человеческие кератиноциты, оптимальное лизис была достигнута с помощью 10 минут инкубации при 65 ° C, после чего 37 ° C ночь инкубации в блоке пожимая Отопление с перемешиванием (900 об/мин).
  4. Убедитесь, что лизис клеток.
    1. Мкл Mix 6 клеток с 6 мкл Трипановый синий на слайд и крышка с coverslip. Вид под микроскопом.
      Примечание: После успешного лизиса, внутрь клеток должны появиться синий и снимите лизированных клетках появится белый.
    2. Если lysis клетки представляется недостаточным, Пелле клетки на 200 x g 5 минут и сохранить супернатант. Ресуспензируйте гранул и повторите шаги 5.2 – 5.4 и/или альтернативно с различными инкубации температуры (см. Примечание в шаг 5.3).
    3. Совместить заново лизированных Пелле с сохраненной супернатант и продолжить.
      Примечание: Визуальный осмотр не является гарантией достаточно lysis. Пищеварение эффективность должна определяться объективно как шаг 6.5.6.

6. Первый пищеварение ограничения

  1. Добавить 30 мкл 10 x буфер энзима ограничения (изготовителем) и 27 мкл 20% Тритон X-100 (окончательный 1,8%) к приостановлению от 5.4 шаг. Довести объем до 300 мкл с H2O.
    Примечание: Состав энзима ограничения буфера будет зависеть RE, выбранный на шаге 1.
  2. Удаление 15 мкл аликвота как «Непереваренных контроля» и хранить при 4 ° C.
  3. Добавить 200 U RE1 оставшиеся реакционной смеси и инкубировать на ночь при температуре, соответствующей с ферментом в блоке пожимая Отопление с перемешиванием (900 об/мин). На следующий день, добавьте дополнительные 200 U RE1 и продолжить инкубации на ночь.
  4. Удаление 15 мкл аликвота как элемент «Digested» и хранить при 4 ° C.
  5. Определите эффективность переваривания:
    1. Мкл 82,5 10 мм трис-HCl рН 7,5 до 15 мкл образцов от 6.2 шаги и 6.4. Мкл 2,5 протеиназы K (20 мг/мл) и инкубировать 1 час при температуре 65 ° C.
    2. 100 мкл фенол хлороформ и энергично перемешать путем инверсии для удаления остаточных белков загрязнения. Центрифуги для 5 мин, 16,100 x g при комнатной температуре.
    3. Передача водной фазе к новой пробке. 6.66 мкл 3 M натрия ацетата рН 5.2, 1 мкл гликогена 20 мг/мл и 300 мкл, 100% этанола (EtOH). Смесь осторожно путем инверсии и место-80 ° C в течение 1 ч.
    4. Центрифуги для 20 минут, 16,100 x g при 4 ° C. Удалить супернатант, 500 мкл и 70% EtOH, центрифуги для 5 минут на 16,100 x g на RT.
    5. Удалить супернатант и сухие гранулы при комнатной температуре на 2 мин Ресуспензируйте гранулы в 50 мкл нуклеиназы свободный H2O.
    6. Определите эффективность дайджест ПЦР13,14 с помощью метода ∆∆Ct. Использовать грунт, набор не фланговые ограничения сайта (см. шаг 2.2.2) как элемент нормализации. Если эффективность переваривания > 85%. В противном случае Пелле клетки и повторите шаги 5,2-6,5, опуская инкубации при 65 ° C в шаг 5.3.

7. Первый лигирование

  1. Тепло инактивирует энзима ограничения по инкубации 20 мин на 65 ° C. В качестве альтернативы если фермент может быть тепло инактивированная, фенол хлороформ извлекать и этанола осадка образец.
    Примечание: Выше температуры инактивации, рекомендуется для некоторых энзимов ограничения Денатурировать белки в хроматина, и это может негативно повлиять на качество образца. Кроме того извлечение фенола: метилхлороформа не является идеальным, поскольку он приводит к потере образца.
  2. Передача 50 мл Конические трубки и добавить 6 мл нуклеиназы свободный H2O, 700 мкл 10 x буфер лигаза (660 мм трис-HCl рН 7,5, хлорид магния 50 мм (2MgCl), 10 мм Дитиотреитол (DTT), 10 мм аденозинтрифосфатом (АТФ)) и 50 U T4 ДНК лигаза. Смешайте нежно закрученного и Инкубируйте на ночь на 16 ° C.
  3. Удаление 100 мкл Алиготе образца как '' лигирование управления ''.
  4. Определите эффективность маточных труб:
    1. 2.5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубировать 1 час при температуре 65 ° C.
    2. Добавьте 100 мкл фенол хлороформ и смесь энергично инверсии. Центрифуги для 5 мин, 16,100 x g на RT.
    3. Передача водной фазе к новой пробке. 6.66 мкл 3 M натрия ацетата рН 5.2, 1 мкл гликогена и 300 мкл, 100% EtOH. Смесь осторожно путем инверсии и место-80 ° c около 1 ч.
    4. Центрифуги для 20 минут, 16,100 x g при 4 ° C. Удалить супернатант, 500 мкл и 70% EtOH, центрифуги для 5 минут на 16,100 x g при 4 ° C.
    5. Удалить супернатант и сухие гранулы при комнатной температуре. Ресуспензируйте гранулы в 20 мкл воды и нагрузки на 0,6% агарозном геле рядом с «пищеварение управления» от 6.5 шаг.
      Примечание: Образец хорошо перевязаны должен появиться как сравнительно жесткой, высокий молекулярный вес полосы (рис. 3).
    6. Если лигирование достаточно, продолжите с шага 8. В противном случае добавьте свежий АТФ (1 mM концентрации выпускных экзаменов) и новой лигаза; Инкубируйте на ночь на 16 ° C и повторите шаги 7.3 – 7,4.

8. обратный Cross-linking и изолировать Chromatin

  1. 15 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубировать на ночь при 65 ° C для обращения вспять перекрестные ссылки.
  2. Мкл 30 РНКазы A (10 мг/мл) и инкубировать 45 мин при 37 ° C.
  3. Добавление 7 мл фенол хлороформ и смесь энергично путем инверсии. Центрифуга 15 мин, 3300 x g на RT.
  4. Передать новый Тюбик 50 мл водной фазе и добавить 7,5 мл нуклеиназы свободный H2O (для разбавления DTT в буфере лигаза, которые в противном случае осаждает с ДНК), 1 мл 3 M натрия ацетата рН 5,6, 7 мкл гликогена (20 мг/мл) и 35 мл 100% EtOH. Смешать и Инкубируйте на-80 ° C в течение 1 ч.
  5. Центрифуга 20 мин, 3900 x g при 4 ° C. Удалить супернатант (пеллетные может быть трудно увидеть), помыть лепешка с 10 мл ледяной 70% EtOH и центрифуги 15 мин, 3300 x g при 4 ° C.
  6. Удалить супернатант и кратко сухие гранулы на RT. растворяют гранулы в 150 мкл 10 мм трис-HCl pH 7.5 при 37 ° C. Хранить при температуре от-20 ° C или продолжить с шага 9.

9. Второе ограничение пищеварения: Обрезка в кругах

Примечание: Этот шаг создает меньше круги для сведения к минимуму перепредставленности мелких захваченных фрагментов из-за PCR предвзятости в шагах вниз по течению амплификации.

  1. Для образца от шаг 8.6, добавьте 50 мкл 10 x буфер энзима ограничения (заводом-изготовителем), 300 мкл нуклеиназы свободный H2O и 50 U энзима ограничения RE2. Инкубируйте на ночь при температуре для выбранной фермента.
  2. Удаление 15 мкл Алиготе образца как элемент «пищеварение». Определите эффективность переваривания, как описано в шаге 6.5.

10. второй маточных труб и очистка ДНК

  1. Инактивирует энзима ограничения, как это рекомендовано изготовителем. Если фермент может быть тепло инактивированная, удалите фермента, используя комплект для очистки на основе столбцов.
    Примечание: Как это приводит к потере образца, столбец очистки не является идеальным.
  2. Передать образец 50 мл трубки и добавить 12.1 мл нуклеиназы свободный H2O, 1.4 мл 10 x лигирование буфера (660 мм трис-HCl, рН 7,5; 50 мм MgCl2; 10 мм DTT 10 мм АТФ) и 100 U T4 ДНК лигаза. Инкубируйте на ночь на 16 ° C.
  3. 467 мкл 3 M натрия ацетата рН 5,6, 233 мкл свободной от нуклеиназы H2O, 7 мкл гликогена (20 мг/мл) и 35 мл 100% EtOH. Хорошо перемешайте и Инкубируйте на-80 ° C 1 ч.
  4. Центрифуга 45 мин, 3900 x g при 4 ° C. Удалить супернатант, добавляют 10 мл холодного 70% EtOH и центрифуги 15 мин, 3300 x g при 4 ° C.
  5. Удалить супернатант и кратко сухие гранулы при комнатной температуре. 150 мкл 10 мм трис-HCl рН 7,5 и инкубировать при 37 ° C для растворения гранул.
  6. Очищайте образцы с кремния на основе столбцов ПЦР очистки комплект, следуя инструкциям производителя. Используйте 1 колонка на 3 х 106 клеток, основанный на начальное количество клеток. Элюировать столбцы с 50 мкл 10 мм трис-HCl, рН 7,5 и бассейн образцов.
  7. Измерять концентрацию флуориметрия или спектрофотометрии с помощью поглощения в 260 Нм. 4C шаблон теперь готов к обратное PCR. Хранить при температуре от-20 ° C, или перейти непосредственно к шагу 11.

11. ПЦР усилить неизвестные взаимодействующих последовательности, обратное PCR

  1. Определите линейный Диапазон усиления, выполняя PCR, используя шаблон разведений 12,5, 25, 50 и 100 нг 4C шаблон. При желании, усиливаются от геномная ДНК параллельно непосредственно сравнить продукцию с целью выявления неспецифической амплификации. Запустите ПЦР-реакции с использованием первоначального денатурации 94 ° c на 2 мин; 30 циклов, состоящий из шага denaturation в 94 ° C 10 s, отжиге шагом при 55 ° C за 1 мин и расширение шаг на 68 ° C 3 мин; и окончательное расширение на 68 ° C за 5 мин.
  2. Отдельные 15 мкл каждого продукта ПЦР на геле агарозы 1,5% для подтверждения линейные усилители и оценить качество шаблон (рис. 4). Усилители с 4C шаблона должен принести дискретных диапазонов в низкой концентрации ДНК и мазок в более высоких концентрациях. Наличие мазке указывает на возросшую сложность усиливается перешнуровок 4C.
  3. Когда удовлетворены качеством и количество обратных ПЦР продукта создается, установите ПЦР для определения оптимального числа циклов для усиления:
    1. Настройка реакции, содержащих красители SYBR и ROX, используя реакционной смеси в таблице 2. Если усиление не является линейной при высоких концентрациях в шаг 11.2, использования 100 ng шаблона в реакции.
      Примечание: Добавление ROX способствует нормализации флуоресцентного сигнала от скважины и цикла к циклу.
    2. Запустите ПЦР-реакции, с помощью первоначального денатурации 94 ° c на 2 мин; 40 циклов, состоящий из шага denaturation в 94 ° C 10 s, отжиге шагом при 55 ° C за 1 мин и расширение шаг на 68 ° C 3 мин; и окончательное расширение на 68 ° C за 5 мин.
    3. Определите флуоресценции пик (конечной точки) реакций, используя амплификации сюжета. Определение цикла, на которой реакции достичь 25% от пика флуоресценции (рис. 5).
      Примечание: Это количество циклов, которые будут использоваться для усиления библиотеки 4C (см. шаг 11.4).
  4. Настройка обратное PCR, как показано в таблице 3 для того чтобы усилить неизвестных последовательностей лигируют приманки из шаблона 4 C. Разделите на 16 реакций 50 мкл перед запуском. Запуск ПЦР-реакции с использованием первоначального денатурации 94 ° c 2 мин и циклы, состоящие из шага denaturation в 94 ° C 10 s, отжиг шаг при 55 ° C за 1 мин, и расширение шаг на 68 ° C на 3 мин использовать количество циклов, определенный на шаге 11.3.3.
  5. Собирать и объединять реакции. Очищают с помощью кремния на основе столбцов ПЦР очистка kit. Используйте по крайней мере 2 столбцов на 16 реакций. Бильярд очищенных продуктов PCR.
  6. Определение количества образца и чистоты методом спектрофотометрии. Типичные урожаи, между 10 и 20 мкг с A260/A280 ~ 1,85. Если коэффициенты поглощения являются оптимальными, повторно очищайте для того, чтобы предотвратить проблемы при виртуализации.
  7. Оценить сложность библиотеки, разделив 300 нг очищенного продукта ПЦР на 1,5% агарозном геле.
    Примечание: Усиленные продукта должно напоминать что от шаг 11.2.

12. Третье ограничение пищеварения: Обрежьте приманки последовательностей

Примечание: Этот шаг удаляет последовательности-информативная приманки из обратной продуктов ПЦР максимально информативным захваченных последовательностей ниже по течению последовательности шагов. Для мониторинга эффективности дайджест, «дайджест монитор»15 переваривается параллельно с использованием эквивалентные концентрации ДНК и фермента. Если RE1 и RE2 несовместимы для одновременного пищеварения, например, из-за различных оптимальной инкубации температуры или реакции буферов, это должно делаться в последовательном дайджест (это не идеально).

  1. Получить монитор дайджест RE и проверить пищеварение в 50 мкл реакции.
    Примечание: Это молекула dsDNA (например, плазмиды, Ампликон ПЦР или синтетических ДНК), содержащий сайтом RE. Единственным требованием является, что это должно быть легко отличить вырезать из режиссерский монитора на геле агарозы. Оптимизировать RE монитор масса фермента концентрации и при необходимости.
  2. Дайджест 1 мкг очищенного обратное PCR продукта от 11,6 шаг и, параллельно, RE монитор от шаг 12.1.
    Примечание: ДНК и концентрации фермента, а также время инкубации, должна быть такой же, как тест дайджест в шаге 12.1 для как обратная продукта ПЦР и дайджесты монитор. Отрегулируйте громкость реакции.
  3. Запустите переваривается RE монитор на геле агарозы концентрации соответствующих ожидаемых фрагментов. Пищеварение считается достаточным, если < 10% ДНК остается неподрезанные (рис. 6).
  4. Очищайте переваривается обратная продукт PCR на комплект очистки кремния на основе столбцов ДНК. Если требуются последовательные дайджесты, повторите шаги 12.1-12.4 с второй фермент.

13. Подготовка секвенирования Библиотека

  1. Перевязать адаптеры, совместимые с соответствующей платформы виртуализации нового поколения.
    1. Дизайн адаптеры для каждого RE1 и RE2, так что после отжига oligos, каждый адаптер RE имеет соответствующие 1-сторонняя навеса.
      Примечание: например, если используется HindIII, отожженная адаптер должен содержать «СЛКП» свес 5' фосфорилированных. Кроме того, если используются стандартные адаптеры T-навес, конец ремонт и A-хвост библиотека до адаптер перевязки.
    2. Отжиг oligos RE соответствующего адаптера. Ресуспензируйте oligos отжига буфера (10 мм трис, pH 7.5, 50 мм хлорид натрия (NaCl), 1 мм ЭДТА), смешайте в эквимолярных количествах до 50 мкм, тепла до 95 ° C и дайте ему остыть медленно до 25 ° C.
    3. Выполните реакции перешнуровки. Смешайте повторно переваривается 4 C библиотека с всего 5 - 10 раз Молярная избыток отожженная адаптеров (шаг 13.1.2; соотношении для каждого RE адаптер используется) в 1 x лигаза буфера и добавить ДНК лигаза 6U. Инкубируйте согласно инструкциям производителя.
    4. Удалите избыток адаптеры, очистки, используя набор столбцов на основе силики низкий элюции тома.
  2. Размер выбор.
    Примечание: Выбор размера также могут быть выполнены с использованием комплекта на основе бисера очистки и рекомендуется даже после очистки столбца.
    1. Литой 2% агарозном геле с использованием высокого разрешения агарозы, добавив-UV пятно перед заливкой. Убедитесь, что любой воды, потерянных из-за испарения во время нагревания заменяется весом бутылка или колбе до и после нагрева и добавления воды, чтобы восстановить потерянные массы.
    2. Запустите адаптер лигируют библиотек на геле, оставляя пустой полос между выборками.
    3. Акцизный ломтиков геля, соответствующий размер диапазона 150 bp до 1 КБ с использованием чистого скальпелем или лезвием бритвы.
    4. Очищайте библиотеки от геля с помощью комплекта извлечения геля. Чтобы свести к минимуму предвзятость GC в восстановлении ДНК, растворяют гель ломтики при комнатной температуре с вращением.
  3. Определите количество циклов для амплификации PCR ПЦР с помощью реакционной смеси в таблице 4. Запустите ПЦР-реакции с использованием первоначального денатурации 98 ° c на 2 мин и 40 циклов, состоящий из денатурации шаг на 98 ° C 10 s, отжиге шагом при 60 ° C за 1 мин и расширение шаг в 72 ° C на 3 мин.
    Примечание: Цикл, в котором флуоресценции достигает 25% от максимального является количество циклов, которые будут использоваться для усиления в библиотеке, как шаг 11.3.
  4. Усилить библиотеки, используя реакционной смеси в таблице 5. Запуск ПЦР-реакции с использованием первоначального денатурации 98 ° c 2 мин и циклы, состоящие из шага denaturation в 98 ° C 10 s, отжиге шагом при 60 ° C за 1 мин и расширение шаг в 72 ° C на 3 мин. Число циклов усилители для каждой библиотеки определялся в шаге 13.3.
  5. Очищайте усиливается библиотеки, используя набор столбцов на основе силики низкий элюции тома.

14. последовательности и анализ последовательности данных

  1. Определение концентрации усиливается библиотек с использованием Флуориметрическое assay. Разбавьте библиотек для соответствующей концентрации для виртуализации (проверьте с последовательности номеров или ядро для их рекомендации).
  2. Определите качество библиотек, используя microfluidic платформа анализа нуклеиновых кислот.
    Примечание: Размер профиля библиотеки должно зеркало что видел на геле выбор размера в шаг 13.2, и концентрация образца определяется на этом шаге будет использоваться для виртуализации.
  3. Бассейн индексируются библиотек для получения по крайней мере 3 миллиона читает (по крайней мере 50 bp читать; сингл [1 X 50] или парные конце [2 X 50]) на сэмпл. Высокое качество библиотека требует по крайней мере 1 миллион сопоставлены читает9, но будут некоторые убыли при сопоставлении. Например последовательность платформу, которая дает около 150 миллионов читает одну полосу движения могут разместиться до 50 образцов в одну полосу.

15. Анализ последовательности данных

  1. Демультиплексирования данные, используя индекс последовательности для назначения читает их соответствующие образцы.
    Примечание: В зависимости от их знакомство, пользователи могут выполнять течению Вычислительный анализ последовательности файлов raw FASTA/FASTQ с помощью базового интерфейса командной строки или, альтернативно, удобной, веб-Галактика графический пользовательский интерфейс (GUI)16 .
  2. Трим адаптер последовательности и любой приманки последовательности связанных с неполной RE пищеварение в шаге 12, например, используя быстрый-X Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. Карта demultiplexed читает в геноме соответствующий интерес (например., UCSC мм10, hg19) с использованием Burrows-Wheeler Aligner (ВСБ)17 или другого программного обеспечения выравнивания, что приводит к Сэм выходных файлов. При необходимости, конвертировать файлы SAM в БАМЕ через samtools18 (см. шаг 15.4).
  4. Используйте 4C-seq анализа трубопровода Basic4Cseq19, 4 C-Кер20, FourCSeq21или22 fourSig для анализа данных и выявления взаимодействия.
    Примечание: Анализ данных и оценки качества их следует проводить согласно выбранного программного пакета справочное руководство. Пакеты, создают кровати выходных файлов, если не указано иное. Кратко Basic4CSeq19 использует входной файл SAM (шаг 15,3) для визуализации взаимодействия (txt, tiff, кровати и парик выходных файлов) и оценивает качество данных, основанные на критериях, изложенных в van de Werken и др. 9 4 C-Кер20 (ввод отделаны FASTQ, шаг 15.2) и FourCSeq21 (ввода BAM, шаг 15.3) определения дифференциального взаимодействий между условиями. fourSig22 (ввода SAM) также идентифицирует значимых взаимодействий и приоритеты тех, которые могут быть воспроизводимой. Инструменты, такие как геномной регулирования обогащения из аннотации инструмент (большой)23, или интеграции с наборами данных кодирования может также использоваться для прогнозирования биологической функции взаимодействия, открыл 4 C seq.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичный человеческие кератиноциты были изолированы от 2-3 выброшенных новорожденных иммунохимические, пула и культивировали в KSFM дополнены с 30 мкг/мл говядину гипофиза экстракт, 0,26 нг/мл рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста и 0,09 мм кальция хлорид (CaCl2 ) при 37 ° C, 5% углекислого газа. Клетки были разделены на две колбы, и один флакон был продифференцировано путем добавления CaCl2 до конечной концентрации 1,2 мм для 72 ч 107

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4C результаты имеют потенциал, чтобы выявить хроматина взаимодействий, которые могут идентифицировать неизвестные ранее регуляторных элементов и/или целевых генов, которые имеют важное значение в контексте конкретных биологических24,25,26. Однако технические препятствия могут ограничить данные, полученные от этих экспериментов. ПЦР предвзятости, обусловленной чрезмерного усиления шаблона в 4 C протоколы, вероятно. Этот протокол ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIAMS (R01AR065523).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HindIIINEBR0104S
CviQINEBR0639S
ДНК-олигонуклеотидные праймерыIDTДля разработки считывателем
50 мл конические центрифужные пробиркиFisher Scientific06-443-19
1,7 мл микроцентрифужные пробиркиMidSciAVSS1700
Фосфатный буферный растворThermo Fisher14190-136
Формальдегид, без метанолаЭлектронная микроскопия Науки15710
NutatorVWR15172-203
ГлицинJT Baker4059-00
Настольная центрифуга
Охлаждаемая микроцентрифуга
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma-AldrichED2SS
20% раствор SDSSigma-Aldrich05030
Трипан СинийThermo Fisher15250061
Стеклянные стеклаFisher Scientific12-550-143
Защитные стеклаVWR16004-094
Световой микроскоп
Triton X-100Альфа АэсарА16046
Встряхивающий тепловой блок
2 М Трис-HClКачество Биологический351-048-101
Протеиназа КNEBP8107S
Фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1)Сигма-ОлдричP2069
Ацетат натрияСигма-ОлдричM5661
20 мг/ мл гликогенаThermo FisherR0561
ЭтанолFisher Scientific04-355-223
Вода без нуклеазы
Fisher4453536
планшеты для количественной ПЦРThermo Fisher4309849
ПЦР-стрип пробиркиMidSciAVSST-FL
1 M Магнияхлорид Quality Biological351-033-721
ДитиотреотолSigma-Aldrich43815
АденозинтрифосфатSigma-AldrichA2383
T4 DNA LigaseNEBM0202S
AgaroseSigma-AldrichA6013
РНКаза АThermo FisherEN0531
Qiaquick Набор для очистки ПЦРQiagen28104
MinElute Набор для очистки ПЦРQiagen28004
Спектрофотометр
Expand Long Template PCR SystemSigma-Aldrich11681834001
dNTP mix Thermo FisherR0191
SYBR Green ISigma-AldrichS9430
ROXBioRad172-5858
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886
End-It DNA End-Repair KitLucigenER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation SystemPromegaM8221
SYBR SafeThermo FisherS33102
Taq PolymeraseNEBM0267S
UltraSieve AgaroseIBI ScientificIB70054
Qiaquick Набор для экстракции геляQiagen28704
Амплификатор для количественной ПЦР Амплификатор Thermo Термоамплификатор Thermo Fisher 4375786

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
  3. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
  6. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  8. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  9. Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
  10. Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
  11. Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
  12. Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
  13. Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
  14. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  15. Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
  16. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
  20. Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
  21. Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
  22. Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
  23. McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
  24. Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
  25. Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
  26. Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circular Chromosome Conformation Capture4C seq ProtocolChromatin Interaction AnalysisNext generation SequencingRestriction Enzyme DigestionInverse PCR AmplificationQPCR based AmplificationChromatin Architecture AssessmentGene Regulatory SequencesTranscriptional Regulation Field

Related Articles