Прямое действие зонд для измерения механических интеграции между ядром и Цитоскелет

Патологий, таких как рак включают изменения в ядерной форма и структура^1,2, которые обычно сопровождаются «размягчения» ядра^3,4. Ядерные устойчивость к механической деформации обычно характеризуются применения силы для изолированных ядер⁵.

Ядро в клетках молекулярно подключен к цитоскелета компоновщик Nucleoskeleton и цитоскелета (линк) комплекс^6,,78,9. В результате ядро механически интегрирована с цитоскелета и через ячейки субстрат спайки, внеклеточного матрикса. Механически зондирования ядра внутри адэрентных клеток может обеспечить понимание этой механической интеграции. Методы для манипулирования ядер в живых клетках включают микропипеткой аспирации^10,11и атомно-силовой микроскопии^12,,1314. Мы недавно описал прямой силы зонд (DFP), который применяется непосредственно на ядро в живых адэрентных клеток¹⁵механических сил.

Здесь мы приводим порядок использования микроинъекции системы, которая обычно доступна в микроскопии средств для применения известных, нано-механической силы непосредственно к ядру в адэрентных клеток. Femtotip (0,5 мкм диаметром микропипеткой наконечник) установлен и подключен к системе микроинъекции трубку. Кончик, расположены под углом в 45° по отношению к поверхности культуры блюдо, опускается до прилегающих к ядерной поверхности. Трубка затем отключен и открыт для атмосферы, которая создает отрицательное давление всасывания на поверхности ядерной и уплотнения кончик микропипеткой против ядерной поверхности. Через перевод кончика микропипеткой ядро деформируется и в конечном итоге (в зависимости от масштабов применения силы), отделен от микропипеткой. Этот отряд возникает, когда восстановление (сопротивления) сил, оказываемое ядро и ячеек, равное всасывающее усилие микропипеткой. Анализ может выполняться путем измерения смещения ядра, длина штамм (уравнение 1), или площадь штамм (рис. 1A).

1. Подготовка клетки для изображений

Примечание: Прямой силы зонд (DFP) может использоваться для любого типа адэрентных клеток. Здесь фибробласты мыши низ 3T3 используются в качестве модели клеточная линия для этого протокола.

1. Культура низ 3T3 фибробластов клетки в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнена бычьим сывороточным доноров 10% и 1% пенициллин-стрептомицином на 35-мм стекла дно блюдо до желаемой confluency. Сохранить клетки при 37 ° C и 5% CO₂.
   1. Убедитесь в том покрыть все 35-мм стекла дно блюда с 5 мкг/мл фибронектина (или аналогичных ECM белков), перед посевом низ 3T3 клетки для воображения.
      Примечание: Клетки должны полностью распространяться и сторонником на блюдо для эксперимента. Не существует каких-либо ограничений с точки зрения confluency для работы метода DFP.
2. Непосредственно перед экспериментом Вымойте клетки дважды с PBS, следуют один мыть с полный рост среднего.
3. Добавьте 3 мл полный рост средних блюдо дно стекла.

2. микроскопии и захвата изображений

Примечание: Перевернутый флуоресцентным микроскопом (или эквивалент) с микроманипулятор, установленной в сторону руку, согласно рекомендациям изготовителя. Микроскоп должен быть оснащен климатическая камера для поддержания температуры при 37 ° C и уровень CO₂ на 5%. Требуется также микроманипулятор и microinjector, прилагается к Микроскоп. 40 x погружения нефти / 1,3 NA или 60 x / 1,49 NA (или эквивалентные цели) рекомендуются для экспериментов. Микроскоп должен быть установлен на таблицы изоляции вибрации.

Рисунок 1 . Ядерные деформации и фокусировки микроскопа
A. Максимальная ядерной деформации и ослабление ядерной деформации. Перед вычислением максимальная ядерной деформации, краям задней ядерных форм были впервые совпало исправить перевод деформированных ядра. Форму ядра на данный момент микропипеткой Совет отряда был накладывается на первоначальный ядерной форме перед вытягивать. Разница в районе между двумя фигурами была измерена как Δ₁. Максимальная ядерной деформации был определен как ΔА₁ разделенных оригинальный ядерной области. Аналогичным образом, второй параметр, ΔA₂, могут быть определены путем наложения окончательного устойчивого состояния ядерной форму после микропипеткой отряд на ядерной форме оригинала. B. фокус ячейки на плоскости A, а затем переместите фокальной плоскости до плоскости B найти микропипеткой наконечник. Во время визуализации, микропипеткой было переведено вправо (направление оранжевая стрелка). Эта цифра была изменена от Нилам и др. ¹⁵. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

1. Включите microinjector за производителя протокол.
2. С помощью капельницы масло погружения, примените одну каплю масла погружения поверх объектива.
3. Плотно закрепите блюдо в держатель мыльница и загрузить держатель мыльница на сцену.
   Примечание: Клетки должна поддерживаться на 37 ° C и 5% CO₂ на протяжении всего эксперимента.
4. Отрегулируйте высоту цель довести клетки в фокус (плоскости A, рис. 1B).
5. Перемещения микроскопа найти ячейку интерес.
6. Вращайте джойстика на микроманипулятор для перемещения держателя накапайте в верхнее положение. Загрузите микропипеткой наконечник диаметром 0,5 мкм на держатель пипетки.
   1. Избежание клеточной адгезии к микропипеткой, предварительно лечить микропипеткой наконечник с 0.3 мг/мл PLL-g-PEG решение за 1 час при комнатной температуре. Тест для адгезии, прикасаясь микропипеткой ядро без каких-либо давление всасывания и затем переводить микропипеткой от ядра. От полного отсутствия ядерного деформации и перевода можно выделить отсутствие прилипания.
      Примечание: Пожалуйста, следуйте производство предложения следует открыть пакет.
7. Поднять объективных фокальной плоскости выше плоскости A и в верхней части ячейки B самолет, регулируя точного управления (рис. 1B, шаг 2.4).
8. Установите микроманипулятор для грубой управления. Медленно довести микропипеткой вплоть до плоскости B, наблюдая за силуэт микропипеткой, до тех пор, пока микропипеткой поставляется полностью в фокус.
9. После того, как кончик микропипеткой находится в фокусе, установите микроманипулятор для точного управления.
10. Нижняя цель в экваториальной плоскости клетки (плоскости A, рис. 1B) и Нижняя микропипеткой около 15 мкм выше плоскости A (рис. 1B, пунктирная микропипеткой).
11. Установка компенсации давления (P_c) на microinjector до требуемого давления; Подождите несколько секунд для давления для стабилизации.
    Примечание: Уставка оптимального давления зависит от типа ячейки и конкретными целями эксперимента. В большинстве случаев 300 гПа бы хорошей отправной точкой.
12. Убедитесь, что микропипеткой не забиты с помощью параметра Clean на панели микроманипулятор и проверку, чтобы убедиться, что воздушные пузыри возникают от кончика микропипеткой.
13. Вставьте наконечник в клетку, постепенно понижая микропипеткой, до тех пор, пока кончик слегка касаясь поверхности ядерного.
    Примечание: При опускании микропипеткой, силуэт кончик микропипеткой станет ясно, как это происходит в центре внимания. Прежде чем микропипеткой коснется ядро, поднять объективного фокус и совместите кончик микропипеткой с ядром (же x-y координата, выше плоскости z). Вернуть фокус обратно в экваториальной плоскости ядра (плоскости A, рис. 1B) и постепенно опустите кончик микропипеткой.
14. Создайте уплотнение между кончиком микропипеткой и ядерной мембраны, отсоединив давления предложения трубы из микроинъекции системы, открыв тем самым конец микропипеткой трубу в атмосферу. Этот шаг создает отрицательное давление равно P_c на поверхности ядерного.
15. Получение изображений с помощью программного обеспечения коллекция изображений микроскопы. Настройка avi приобретение (видео) или nd приобретение (изображения) в коллекции изображений.
    Примечание: Для любых изображений, приобретение программного обеспечения, Настройка реального времени видео изображений или приобретения промежуток времени изображение с короткий промежуток времени.
16. Переключатель для соответствующего флуоресцентных изображений канал (т.е., GFP, ППП, и т.д.) и начать изображений.
17. Перевести микропипеткой подсказка от тела клетки (справа, на рисунке 1B) до тех пор, пока ядро отсоединяется от микропипеткой.
    Примечание: Вытяните кончик вдоль оси x положительные (справа в поле зрения). Вытягивая ставки могут быть запрограммированы и контролируется компьютером или джойстик может быть перемещена вручную. Мы не нашли каких-либо корреляции между потянув скорость и ядерной деформации¹⁵ предлагая главным образом упругих ответ на силу.

3. анализ данных

1. Выполните анализ изображений с любой основной обработки изображений программное обеспечение, доступное. Степени ядерной деформации может быть определена количественно, длина штамм (Ɛ) или области штамм (рис. 1A). Количественно длина штамм, используя уравнение 1, где L и L₀ представляют длины ядра на максимальной деформации и начальная позиция, соответственно.
   (Уравнение 1)

Рисунок 2A показывает, заставляя ядра фиброцита мыши 3T3 низ. Как микропипеткой кончика перевели справа, ядро деформируется и в конечном итоге отсоединяется от кончика микропипеткой. Считается, что длина напряжение ядра с увеличением силы всасывания (рис. 2B). Передний край ядра (микропипеткой потянув край) формирует ядерной выступа и задней кромки смещается от своей первоначальной позиции. Длина выступа гораздо больше, чем перемещение задней кромкой (рис. 2 c), предлагая тесная интеграция между ядром и окружающих цитоплазму. Шкалы времени, короткий для релаксации ядерных передней кромки (< 1 s) и ядерной заднего края (< 2 s) (Рисунок 2D).

Рисунок 2 . Характеристика ядерной деформации
Деформации и смещения ядра в жизни, адэрентных клеток в DFP. НИЗ 3T3 фибробластов ядра была вытягивана с 6 nN силой. Изображения показывают ядерной форму в указанное время. Линейки: 5 мкм деформации B. ядерного была количественно оценена по длине деформации. Ядерная деформации увеличилась с прикладной силами. Планки погрешностей указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM); n > 6. C. Перемещение на переднем крае больше, чем перемещение на задней кромке. D. Длина штамм релаксации гораздо быстрее, чем задней кромке релаксации. P < 0,05; планки погрешностей указывают SEM; n = 10. Эта цифра была изменена от Нилам и др. 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Мы использовали метод DFP для определения как цитоскелета силы способствовать ядерной устойчивость к деформации в ячейке. Хотя никаких существенных различий в ядерной деформации или перевода были найдены после F-актина (от cytochalasin-D) или нарушение микротрубочек (по Нокодазол), уменьшение виментин выражение через на основе малых интерферирующих РНК нокдаун привело к значительно большей ядерные перевод и деформации (рис. 3). Это свидетельствует о том, что промежуточные филаменты виментин в фибробласты являются основным элементом цитоскелета, которые помогают ядро сопротивление местных сил.

Рисунок 3 . Флуоресцентного изображения ядерной деформации
DFP была использована для определения вклада цитоскелета силы ядерного деформации. Ядро было окрашенных краской SYTO 59. Флуоресцентного изображения показывают оверлея ядра до (красный, псевдо-цвет) и после (зеленый, псевдо-цвет) в указанные состояния. CTRL, клетки управления; Цито-D, клетках, обработанных с cytochalasin-D; НОК, клетках, обработанных с Нокодазол; КАТИСЬ, transfected клеток с платные siRNA; Vim siRNA, transfected клеток с siRNA, ориентация виментин. Эта цифра была изменена от Нилам и др. 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.