Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Неразрушающего контроля развития разложению на основе эшафот инженерии тканей кровеносных сосудов с использованием оптическая когерентная томография

5.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58040

⸱

3 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital, 2Medical Research Center, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital, 3Institute of Geriatric medicine, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Шаг за шагом протокол для неразрушающего контроля и длительного периода наблюдения за процессом сосудистого ремоделирования и эшафот деградации в реальном времени культуры биоразлагаемые полимерные основанных на эшафот инженерии тканей кровеносных сосудов с пульсирующего стимуляции Здесь описывается использование оптическая когерентная томография.

Аннотация

Инженерии сосудистых имплантатов с структурно-механические свойства, аналогичные природные кровеносных сосудов, как ожидается, удовлетворять растущий спрос на артериальной объездной. Характеристика динамики роста и модернизации процесса разложению полимер на основе эшафот инженерии тканей кровеносных сосудов (TEBVs) с пульсирующего стимуляции имеет решающее значение для сосудистой тканевой инженерии. Оптические методы визуализации выделяются как мощные инструменты для мониторинга васкуляризации инженерии тканей позволяет с высоким разрешением изображений в реальном времени культуры. Этот документ демонстрирует неразрушающего и быстро в реальном времени визуализации стратегии для мониторинга роста и реконструкции TEBVs в долгосрочные культуры с помощью оптическая когерентная томография (Окт). Оценивается геометрические морфологии, включая сосудистого ремоделирования процесс, толщина стенок и Сравнение толщины TEBV в моменты времени различные культуры и наличие пульсирующего стимуляции. Наконец OCT предоставляет практические возможности для реального времени наблюдения деградации полимера в реконструкции тканях под пульсирующего стимуляции или не и в каждом сегменте судна, по сравнению с оценкой использования деградации полимера Сканирование, microscopic(SEM) электронов и поляризационный микроскоп.

Введение

Ткани инженерии кровеносных сосудов (TEBVs) является наиболее перспективных материалов как идеальный сосудистого трансплантата1. Для того, чтобы развивать графтов клинически полезным с аналогичными структурных и функциональных свойств как родной судов, были разработаны несколько методов для поддержания функции сосудистого2,3. Хотя там были инженерии судов с приемлемым проходимость ставок во время имплантации и клиническое исследование III фазы4, долгосрочные культуры и высокой стоимости также показывают необходимость наблюдения за развитием TEBVs. Понимание процессов роста, модернизация и адаптация внеклеточные matrix(ECM) в TEBVs в среде химико механические biomimetic может предоставить важную информацию для развития сосудистой тканевой инженерии.

Идеальной стратегии для отслеживания развития инженерии судов малого диаметра5 должно быть неразрушающего контроля, стерильные, продольная, трехмерные и количественные. TEBVs условиях различные культуры могут оцениваться этой модальности изображений, включая даже изменения до и после трансплантации сосудов. Необходимо разработать стратегии для описания особенностей жизни инженерии судов. Оптические методы визуализации позволяют визуализации и количественной оценки осаждения ткани и биоматериалов. Другими преимуществами являются возможность включить глубокие ткани и этикетка бесплатные изображения с высоким разрешением6,7. Однако изображение конкретных молекул и менее легко доступны оптического оборудования для мониторинга в реальном времени является значительное практическое препятствие, которое имеет ограниченную широкое применение нелинейной оптической микроскопии. Оптическая когерентная томография (Окт) — это оптический подход с внутрисосудистого изображений модальности как широко используется клинический инструмент направлять сердечной интервенционной терапии8. В литературе метод октября было сообщено о том, как способ оценки толщины стенок TEBVs9,10, в сочетании с позитивных изображений условия для сосудистых тканей инженерных исследований. В то время как динамика инженерии сосудистой роста и реконструкции не наблюдалось.

В этой рукописи мы подробно подготовку биоразлагаемые полимерные основанных на эшафот TEBVs для четырех недель культуры. Человека пупочных артерий сосудистой гладкомышечные клетки (HUASMCs) расширил и посеяны в пористых разложению Полигликолидная кислота (PGA) леса в биореактор. Биоразлагаемые полимеры играть роль в временной субстрат для тканевой инженерии и имеют определенные11деградации ставка. С тем чтобы обеспечить соответствующий матч между деградацией лесов и нео-ткани, ECM и PGA подмостей являются важнейшими факторами для эффективного сосудистого ремоделирования. Система перфузии имитирует биомеханических микроокружения родной судов и поддерживает последовательную деформации под давлением стимуляции.

Цель представленных протокола-изложить стратегию относительно простой и неразрушающего контроля для TEBVs изображений и долгосрочный мониторинг культуры. Этот протокол может использоваться для визуализации морфологических изменений и измерения толщины инженерии судов в условиях иной культуры. Кроме того можно выполнить анализ деградации материалов на основе полимеров в ткани, инженерные строительные леса для идентификации. Комбинируя методы сканирования электрон microscopic(SEM) и поляризационный микроскоп, используемые в этот протокол, корреляции и количественной оценки распределения внеклеточного матрикса и PGA деградации может быть сделано, которая может содействовать оценке эшафот деградация в сочетании с октября изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. разложению PGA леску на основе культуры ткани инженерии судов

  1. Изготовление PGA эшафот
    1. Шить PGA сетки (диаметром 19 мм и толщиной 1 мм) вокруг Силиконовая трубка, стерилизована окисью этилена (длина 17 см, диаметр 5.0 мм и толщиной 0,3 мм) с помощью швов 5-0.
    2. Шить политетрафторэтилена (ePTFE, 1 см длиной) с 4-0 швом на каждом конце PGA сетки и перекрывается 2 мм.
    3. Окуните PGA подмости с рукой в 1 моль/Л NaOH за 1 мин, чтобы скорректировать структуру пространственной сетки и смочите водой культуры ткани класса три раза за 2 мин. Нежно погладить сухой леску с папиросной бумаги каждый раз. Затем высушите до леса в капюшон с вентилятором на 1 ч.
  2. Ассамблея биореактора и Y-соединения для октября изображений
    1. Замочить самостоятельно разработанные стекла цилиндрических биореактора (диаметр 10 см и 11,7 см в высоту с четырьмя губы внутри и четыре стороны оружия вне реактора, как показано на рис. 1), PGA подмостей, силиконовые трубки (внешний диаметр 5 мм, толщина 0,3 мм), биосовместимых трубы, разъемы, перемешать бар и оборудование для сборки в баке этанола 95% за 2 ч.
    2. Вытяните PGA леску через сторону герб биореактора, подключенных к одной стороне с разъемом, а также другая сторона с Y-Джанкшн, используются для доставки OCT проволочного проводника. Соберите другую леску PGA в биореакторе таким же образом. Пожалуйста, обратитесь к рис.
    3. Установите ePTFE биореактор губы, затянув с 4-0 швами.
    4. Поместить реактор в этанол бак снова за 1 ч и высохнуть на ночь в капот с вентилятором на.
  3. Заполнение HUASMCs и статические биореактор кондиционирования
    1. Изолируйте HUASMCs от человеческой пуповинной артерии методами стандартных экспланта.
    2. Расширять и поддерживать клетки в гладкомышечные клетки рост среднего, состоящий из среде DMEM, 20% плода бычьим сывороточным, 2,36 мг/мл HEPES, 100 ед/мл пенициллин G, 50 мкг/мл пролина, 20 мкг/мл аланина, 50 мкг/мл глицин, 1,5 мкг/мл CuSO4, аскорбиновая кислота 50 мкг/мл , 10 нг/мл основные фибробластический фактор роста и 10 нг/мл тромбоцитарный фактор роста.
    3. Семена HUASMCs в концентрации 5 × 106 клеток/мл в выше питательной среды на PGA подмостей.
    4. Положите сенсацию бар (1,5 см длины) в биореактор. Вставка одного кормления труб (диаметром 5 мм, длина 15 см) и трех сегментов коротких труб (диаметром 5 мм, длиной 7 см) для газового обмена через крышку пробкой силикона.
    5. Прикрепите фильтры 0,22 мкм PTFE для каждого изменения трубку и один гепарина колпачок для питания трубки. Настройка панели перемешать с перемешивания скорость 13 выстрелов в минуту. Соберите стекла биореактора, силиконовая пробка крышки и PGA леску в системе культуры.
    6. Разрешить HUASMCs следовать за 45 мин, опираясь биореактор каждые 15 мин с подставкой, влево и вправо. Реактор портов и стыки загерметизированы с парафин фильм.
    7. Подключите Луо-Ye насос, PBS мешок, водитель с биосовместимыми трубы как система перфузии. Откроете диск для заполнения трубы с PBS.
    8. Поместите общий биореактор в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C. Заполните палаты культуры с 450 мл HUASMCs питательной среды.
    9. Нажмите кнопку «Стоп» и выключите устройство. Посеян подмостки под статической культуры растут на одну неделю.
    10. Измените культуру среднего каждые 3-4 дня, аспирационных половина из старой среды путем кормления трубки и заправки реактора с эквивалентное количество свежей питательной среды.
  4. Подготовка системы перфузии для октября изображений
    1. Перекачивать жидкости в мешке PBS распространить через биосовместимых трубы и обратно в мешок.
    2. Откройте силу водителя и регулировать параметр насос с частотой 60 ударов в минуту и вывода систолическое давление 120 мм рт.ст.. Механические параметры согласно потребностям инженерных сосудистой культуры ткани.
    3. Нажмите кнопку "запустить", чтобы сделать работу системы перфузии. Предоставить выше фиксированных пульсирующего стимуляции для судов на 3 недели, многократно герметизирующего биосовместимых трубы10,12 после 1 недели статической культуры.

2. выполнение оптических изображений с октября

  1. Используйте источник света для обеспечения осевой резолюции 10-20µm и глубина изображения 1-2 мм для определения структуры на основе частотной области октября внутрисосудистого изображений системы9TEBV.
  2. Включите выключатель питания и откройте программное обеспечение захвата изображения.
  3. Подключите волоконно оптических изображений катетер к мотор и оптических контроллер (DOC) с функцией автоматического отступление катетера.
  4. Установка параметров изображения приобретение ставки до 10 кадров в секунду с автоматической обратной протяжке скорость 10 мм/сек.
  5. Придаем изображений катетер Y-Джанкшн через гепарина колпачок с иглой 18G.
  6. Уложите силиконовые трубки катетера и определить герметичность шва PGA сетки перед загрузкой PGA леску на реактор.
  7. Поместите кончик катетера области интереса. Настройте устройство обратной протяжке и проверить качество изображения8.
  8. Получение изображений в 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 дней в культуре для каждого индивидуального TEBV и сохранить последовательно с наблюдения в реальном времени TEBV микроструктуры, включая поверхности морфологии, внутренней структуры и состава.
  9. Повторите измерение для 3 раз, чтобы получить надежное измерение инженерии судов каждый раз. Захват серии изображений на протяжении тестирования с использованием программного обеспечения захвата изображения.

3. томография анализ

  1. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для измерения толщины стенок TEBV. Выберите изображение для анализа. Щелкните инструмент отслеживания для определения внутренней стороне TEBV программное обеспечение автоматически и вручную эскиз внешней стороне. На экране появится диаграмма толщины.
  2. Повторите измерение в 5 раз получить надежное измерение конструкции. Был проведен анализ октября два независимых следователей, ослепленный к полученной информации.

4. урожай TEBV и обработки тканей

  1. Открыть крышку пробкой силикона помещен над биореактора по завершении культуры и отбросить питательной среды. Ослабьте ePTFE от биореактор губы и вырезать трубы силиконовые с внешней стороны ПТФЭ с ножницами. Урожай TEBVs от биореактор и нарезать разделы для сканирования электронной микроскопии экспертизы.
  2. Взять из остальной части TEBVs и нарезать 4 µm толщиной секции. Вытяните поддержки силиконовые трубки и исправить разделы с параформальдегида 4%. Выполняйте обычные гистологические окрашивание Массон в trichrome и Сириус красный для изучения морфологии коллагена и PGA10,,1314.
  3. Чтобы оценить PGA контента и компонент коллагена, наблюдать гистологических образцы с Sirius красное окрашивание, поляризационный микроскоп. PGA Остатки четко разграниченные через двойное лучепреломление и остаток области могут быть количественно основанные на площадь поперечного сечения10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Система трехмерного культуры состояла из палаты культуры в биореактор и перфузии системы с замкнутым циклом жидкости10,13 (рис. 1). Окт изображений катетер был вставлен в дистальный конец Y-Джанкшн и вытащил обратно в силиконовой трубки для изображений. Окт изображений впервые был использован для описания структурных характеристика биоразлагаемые полимерные основанные на эшафот TEBVs возделывание биор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для создания инженерии судов с структурных и механические свойства аналогичны родной кровеносных сосудов может привести к сократить время для клинического использования и является конечной целью сосудистой техники. Оптические методы визуализации позволяют визуализации сосудистой конкретных компонентов инженерии тканей, которые не могут контролировать отдельные конструкции всей культуры и воздействия графтов в среде культуры без ущерба для бесплодия7. В этой статье культуры Камера отделена от перфу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы отметить науки и технологии планирования проекта в провинции Гуандун Китая (2016B070701007) для поддержки этой работы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сетка PGASynthecon
силиконовая трубкаCole Parmer
соединительCole Parmer
внутрисосудистая система ОКТSt. Jude Medical, IncILUMIEN™ OPTIS™ СИСТЕМА
сканирующий электронно-микроскопическийPhilipsFEI Philips XL-30
поляризованный микроскопOlympusOlympus BX51
швыJohnson &
Пульсирующий насосГуандунский институт
LightLab Программное обеспечение для визуализацииSt. Jude Medical, Inc
Johnson сердечно-сосудистых заболеваний

Ссылки

  1. Chan-Park, M. B., et al. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).
  2. Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. Image-guided tissue engineering. Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).
  3. Smith, L. E., et al. A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering. Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).
  4. Chang, W. G., Niklason, L. E. A short discourse on vascular tissue engineering. NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).
  5. Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering. Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).
  6. Rice, W. L., et al. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
  7. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).
  8. Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure. Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).
  9. Gurjarpadhye, A. A., et al. Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT. Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).
  10. Chen, W., et al. In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography. Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).
  11. Naito, Y., et al. Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
  12. Ye, C., et al. The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).
  13. Chen, W., et al. Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).
  14. Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).
  15. Martinho, J. A., et al. Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography. Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).
  16. Poirierquinot, M., et al. High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding. Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).
  17. Naito, Y., et al. Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model. Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).
  18. Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Неразрушающего контроля развития разложению на основе эшафот инженерии тканей кровеносных сосудов с использованием оптическая когерентная томография
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.