Мы разработали простой и адаптации рабочего процесса для получения количественных данных из ячейки на основе изображений флуоресценции биологических исследований агрегации белков и autophagic потока в центральной нервной системе дрозофилы моделей нейродегенеративные.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественные клеточной биологии нейродегенеративные у дрозофилы путем объективного анализа дневно тегами белков с помощью ImageJ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
С ростом распространенности нейродегенеративных заболеваний все более важно понять основные патофизиологии, что приводит к дисфункции нейронов и потери. На основе флуоресценции изображений инструменты и технологии позволяют беспрецедентный анализ субцеллюлярные нейробиологических процессов, пока сохраняется потребность в беспристрастной, воспроизводимые и доступные подходы для получения количественных данных из изображений исследования . Мы разработали простой и гибкой рабочий процесс, чтобы извлекать из на основе флуоресценции изображений исследования с использованием модели дрозофилы нейродегенеративные количественные данные. В частности, мы описываем easy-to последующие, полуавтоматическое подход с использованием Фиджи/ImageJ для анализа двух клеточных процессов: во-первых, мы количественно совокупного содержания белка и профиль в доле зрительного дрозофилы , с помощью люминесцентной меткой мутант гентингтина белков; и во-вторых, мы оцениваем autophagy Лизосома потока в системе дрозофилы визуальные с количественной оценки на основе ratiometric тандем флуоресцентные репортер autophagy. Важно отметить, что изложенные здесь протокол включает полуавтоматическая сегментация шаг, чтобы убедиться, что все флуоресцентные структуры анализируются к минимуму систематическая и увеличить разрешение тонкие сравнений. Этот подход может быть продлен для анализа других клеток биологических структур и процессов причастны нейродегенеративные, таких как белковых puncta (гранулы стресс и синаптическую комплексы), а также мембраны прыгните отсеков (митохондрии и мембрана везикулы торговли людьми). Этот метод обеспечивает стандартизированный, но адаптированы ссылку для анализа изображений и количественной оценки и могли бы способствовать надежности и воспроизводимости через поле и в конечном итоге повысить механистического понимания нейродегенеративные.
Введение
Нейродегенеративные заболевания затрагивают миллионы людей каждый год, и растет с старение населения1. Хотя каждый нейродегенеративные заболевания имеет уникальный этиологии, агрегирование смятых протеинов и разбивка proteostasis сети общих патологических отличительными особенностями являются многие из этих болезней. Разъяснение, как нарушение этих основных и взаимосвязанных процессов идет наперекосяк вносить нейрональных дисфункции и клеток смерть имеет решающее значение для понимания нейродегенеративных заболеваний, а также руководящих терапевтических вмешательств. На основе флуоресценции изображений позволяет для расследования эти сложные и ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. соображения и подготовка для проектирования эксперимент анализ изображений
- Предопределяют подходит анатомические, сотовых, или внутриклеточных маркеров, чтобы служить в качестве ориентиров для стандартизации региона интерес (ROI) через различные образцы, например 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), маркеры мембраны, локализованные люминесцентные белок и т.д.
- Выберите флуоресцентные маркер, который можно разграничить дискретных puncta Помимо фоновых уровней для структуры интереса.
Примечание: Этот протокол оптимизирован для белковых структур (например, смятых протеинов агрегаты) и мембранных органелл (например, a....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Количественная оценка числа, область и интенсивность дневно тегами мутант Htt агрегатов в доле зрительного дрозофилы
Расследовать агрегации смятых протеинов в центральной нервной системе дрозофилы модели болезни Гентингтона, ЗП тегами мутант человека Htt с не патологических (UAS-ЗП hHttQ15) или патологического расширения ( UAS-RFP-hHttQ138) и мембраны GFP (UAS-mCD8::GFP)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, изложенные здесь может использоваться для энергично и герметизации quantitate биологических процессов клетки визуализированы на основе флуоресценции изображений. Контекста биологических и технических ограничений необходимо тщательно направлять экспериментальный дизайн. Флуоресцентные маркеры внутриклеточных структур, представляющих интерес, ли иммуногистохимии, на основе красителя, или генетически выражено, нужно быть различимыми выше фона по морфологии и интенсивности. UAS/GAL4 система широко использу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа поддерживается Шейла и Дэвид Фуэнте нейропатической боли исследовательской программы стипендий (для J.M.B.), Лоис Папа Римский жизни стипендиатов программы (C.L., ВМФ и J.M.B.), лектор Стипендия фонда Снайдер-Робинсон (чтобы C.L.), д-р Джон T . Фонд Макдональд (чтобы C.L.), контракты, субсидии, полученные от национальных институтов здравоохранения (НИЗ) HHSN268201300038C, R21GM119018 и R56NS095893 (R.G.Z.) и Тайшань ученый проекта (провинция Шаньдун, Китайская Народная Республика) (R.G.Z.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| SYLGARD(R) 184 Набор силиконовых эластомеров | Dow Corning Corporation | PF184250 | Диссекционная чашка |
| Falcon 35 мм Не обработанная TC Легкая Ручка Стиль Бактериологическая чашка Петри | Corning | 351008 | Диссекционная чашка |
| Dumont #5 Щипцы | Fine Science Tools | 11251-20 | Инструмент для вскрытия |
| Хлорид натрия | Sigma | S3014 | PBS раствор |
| Натрия фосфат двухбазовый | Sigma | S5136 | PBS раствор |
| Калийфосфат Моноосновной | Sigma | P5655 | PBS раствор |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Раствор для мытья и инкубации антител. |
| 37% формальдегида | VWR | 10790-710 | Фиксация |
| одноразовых микроцентрифужных пробирок (0,5 мл, синий) | VWR | 89000-022 | Фиксация, промывка и инкубация антител. |
| Однотонные и матовые микрогорки (25× 75mm) | VWR | 48312-004 | Слайды для конфокальной визуализации |
| Микрозащитные стекла, прямоугольные (22&ум; 40мм) | VWR | 48393-172 | Слайды для конфокальной визуализации |
| Резина Цемент | Слайм | 1051-A | Монтаж |
| VECTASHIELD Antifade Монтаж Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Монтажная |
| лента Scotch Magic 810 Невидимая лента (19мм&раз; 25,4m) | 3M Company | 810 | Монтаж |
| нормальной козьей сыворотки | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | антитела инкубационный |
| DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Окрашивание нуклеиновыми кислотами. Растворите в деионизированной воде до получения исходного раствора 5 мг/мл и храните при -80°C. Разбавьте до рабочей концентрации 10-20°C; г/мл в PBTx. |
| 3.5X-90X Стерео Зум Инспекционный Промышленный Микроскоп | AmScope | SM-1BNZ | Диссекционный эндоскоп. Оснащен светодиодным двойным осветителем на гусиной шее мощностью 6 Вт |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | С SCF_MPI_CBG плагинами (версия 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Конфокально-лазерный сканирующий микроскоп | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
Ссылки
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-imag....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
