Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптических Assay для синаптических пузырьков рециркуляции в культивированный нейронов, экспрессирующих Пресинаптический белки

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58043

⸱

26 июня 2018 г.

 ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Embryology, University Medical Centre Göttingen

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем оптических assay для синаптических пузырьков (SV) рециркуляции в культивированный нейронов. Сочетание этот протокол с двойной трансфекции выразить Пресинаптический маркер и протеин интереса позволяет нам найти Пресинаптический сайтов, их синаптических пузырьков, утилизации потенциала и определить роль протеина интереса.

Аннотация

В активных Пресинаптический нервных окончаний синаптических пузырьков проходить циклы экзо - и эндоцитоз. В процессе рециркуляции, просветный домены SV трансмембранные белки подвергаются на поверхности клеток. Один из этих белков-Синаптотагмин-1 (Syt1). Антитела, направленные против Люминал домен Syt1, однажды добавила к питательной среды, take up в ходе экзо endocytotic цикла. Это поглощение пропорционально количеству SV рециркуляции и может быть определена количественно через иммунофлюоресценции. Здесь мы сочетаем Syt1 антитела поглощения с двойной трансфекции культивировали гиппокампа нейронов. Это позволяет нам (1) локализации Пресинаптический сайты, основанные на выражения рекомбинантных Пресинаптический маркера Synaptophysin, (2) определить их функциональность с помощью Syt1 поглощения и (3) характеризуют ориентации и эффекты белка интерес, GFP-Rogdi.

Введение

Изучая синаптических пузырьков рециркуляции важную роль в определении как Пресинаптический свойств изменить, либо во время синаптической пластичности, или в ответ на возмущение синаптических функции. Изучение Синаптотагмин-1 (Syt1) антитела поглощение предоставляет один метод измерения объема переработки SV. Syt1 — SV-связанный белок, который действует как Ca2 + датчик и необходимые для exocytotic выпуска нейромедиатора1,2. Это трансмембранный белок с C-терминал цитоплазматических доменов вне SV и N-терминальный Люминал домена внутри SV-3. Во время экзоцитоз становится подвергаются Люминал домена Syt1 на внешний носитель. Этот внешний носитель мы добавляем антитела, направленные против цитоплазмы домен, который становится внутренним во время эндоцитоз. Эти антитела могут быть либо предварительно проспряганное с флуорофоров или immunostained с вторичные антитела4,5,6,7. Интенсивность флуоресценции результате immunosignal пропорциональна количество SV рециркуляции. Этот подход может использоваться для определения составных и деполяризации индуцированной SV рециркуляции6,8.

Syt1 поглощение анализов может выполняться после генов вируса опосредованной передачи практически все клетки в блюдо или разреженный трансфекции небольшого числа клеток. Наш метод сочетает в себе проба разреженных двойной трансфекции первичного гиппокампа нейронов, при использовании фосфата кальция9. Мы используем рекомбинантных маркер протеин, называемый накапливаться в presynapses, дневно тегами Synaptophysin, чтобы найти Пресинаптический терминалы и overexpress наш протеин интереса, Rogdi. Это позволяет нам проверить ли или не Rogdi цели функциональных синапсов и влияет на SV рециркуляции. Гену Rogdi был первоначально определен на экране дрозофилы мутантов, характеризующееся нарушением памяти10. В организме человека мутации в гене Rogdi вызывают редких и разрушительные болезнь под названием Kohlschütter-Tönz синдром. Пациенты страдают от пороков развития зубной эмали, фармакорезистентности эпилепсии и психомоторные задержки; Однако субцеллюлярные локализации продукта гена оставался неуловимым11. Таким образом пробирного поглощение Syt1 представил основные доказательства для локализации GFP-тегами Rogdi функциональных синапсы9.

Эта техника поглощение имеет несколько преимуществ. Во-первых SV рециркуляции может наблюдаться как в режиме реального времени, выполняя живых изображений7,12и после фиксации6,9 путем измерения интенсивности флуоресценции Syt1 флуоресцентной метки. Кроме того были разработаны несколько вариантов Syt1 антитела. Есть непомеченным варианты, которые могут быть помечены вторичное антитело после стандартного иммуноокрашивания протокол после фиксации и предварительно конъюгированных варианты с уже этикетку флуоресценции. Наконец на основе антител флуоресценции выгодно из-за большой выбор имеющиеся вторичные или конъюгированные красителей, которые могут быть использованы.

При фиксации и иммуноокрашивания нейронов, это также возможно для пятно для дополнительных белков и выполнять анализ colocalization. Это может помочь определить, где они расположены по отношению к утилизации СВС. Интенсивность флуоресценции лейбла является прямой мерой количество SV рециркуляции. Кроме того антитела выборочно ярлык Syt1-содержащих структур, что приводит к высокой специфичности и мало фона флуоресценции4. Может также использоваться протоколы различные стимуляции, например деполяризации буферов или электрической стимуляции протоколы9,12,,1314. Однако базальный SV рециркуляции могут быть измерены без стимулирования нейрональных культур15.

Наш метод конкретно рассматриваются Syt1 антитела поглощения в двойной transfected нейронов с immunolabeling вторичное антитело после фиксации. Однако мы ссылаемся на всех применяемых вариантов анализа в нашей дискуссии, чтобы дать зрителям возможность адаптировать протокол к конкретным потребностям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Были проведены исследования не с живых животных. Эксперименты с участием Усыпленных животных для получения клеток, которые культур были утверждены властями местной защиты животных (Tierschutzkommission der этот Гёттинген) под номером официального утверждения номер T10/30. Были проведены эксперименты с использованием утвержденных протоколов.

1. Первичные гиппокампа клеточной культуры

  1. Подготовьте культуре диссоциированных клеток гиппокампа крысы на эмбриональных день 1916,17. Пластины на coverslips 12 мм, покрытые полиэтиленимина (PEI) в 24-ну блюда на плотности 50 000-60 000 клеток/хорошо ячейки. Проверка плотности, с использованием клеток подсчета оптика камеры и фазы контраст.
  2. Культуры нейронов для 3 дней (день в пробирке (DIV) 3) в 24-ну пластины в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2.
  3. Оцените coverslips по показателям здоровья клеток с помощью передаваемых световой микроскопии (например, этап контраст оптика с увеличением 10-20 x). Проверьте следующие показатели хорошего здоровья: четкие фазы контраст гало, невритов без бисера структур и не Сома кластеризации или neurite планшеты.

2. transfection

Примечание: Следующий протокол относится к двойной трансфекции для 3 скважины. Однако протокол работает лучше, когда готовятся количествах, достаточных для 4 скважин.

  1. Подготовка 500 мл трансфекции буфера (274 мм NaCl, 10 KCl, 1,4 мм Na2HPO4, 15 мм глюкозы, 42 мм HEPES) в колбу Эрленмейера.
    1. Растворите 8,0 г NaCl, 0,37 г KCl, 0,095 g Na2HPO4, 1,35 г глюкозы и 5,0 г HEPES в 400 мл дистиллированной воды в колбу Эрленмейера.
    2. Отрегулируйте пэ-аш на 6,95 с 1 M NaOH с помощью рН метр.
    3. Отрегулируйте громкость с дистиллированной водой до 500 мл и проверьте pH с помощью рН метр.
    4. Сделать 20-30 мл аликвоты трансфекции буфера со следующими значениями рН дозирования 1 M NaOH в трансфекции буфер: 6,96 6,97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
      Примечание: pH буфера трансфекции имеет решающее значение для эффективности transfection.
    5. Чтобы проверить, что трансфекции буфера приводит к наибольшим числом transfected клеток, испытания каждого значения рН от 6.96 7.11. Используйте метод трансфекции, описанный в 2.2-2.11 и проверенных плазмида, выражая GFP. Определите количество transfected клеток на coverslip для каждого значения рН трансфекции буфера, для оценки которых буфер работает лучше всего.
    6. Аликвота буфер с наивысшую эффективность трансфекции в 2 мл пробирок microcentrifuge заморозить и хранить трубы при-20 ° C.
  2. Предварительно теплый сокращение сыворотке среднего, среднего культуры клеток и дистиллированной воды до 37 ° C в водяной бане.
  3. Подготовьте трансфекции микс в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Работа под капотом ламинарного потока для обеспечения стерильных условий труда.
    1. Mix 7,5 мкл рабочего раствора хлорида кальция 2 М с 4 мкг каждой свободной эндотоксина ДНК (Synaptophysin-mOrange и mGFP/GFP-Rogdi). Добавьте воды, чтобы достичь суммарный объем 60 мл в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    2. Добавьте 60 мл трансфекции буфера к смеси. Чтобы получить наилучшие результаты, добавьте буфер трансфекции каплям при встряхивании ДНК смесь осторожно на vortex.
    3. Инкубируйте 20 минут при комнатной температуре (RT). Избегайте тряски инкубация трубы во время инкубации, поставив трубку рядом с Ламинарный шкаф.
  4. Под капотом ламинарного потока удалите средство культуры клеток («условных среднем») из скважин с помощью пипетки 1000 мл и хранить его в отдельный контейнер в инкубаторе.
  5. Добавьте 500 мл сокращение сыворотке среды в каждой скважине. Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO2 до 20 минут инкубационного периода (шаг 2.3.3).
  6. Добавьте 30 мл трансфекции смеси для каждой скважины, закупорить несколько капель. Отбросить остаток в нижней части трубки.
  7. После того, как все скважины были поставлены с трансфекции микс, осторожно встряхните 24-ну пластины для обеспечения распределения трансфекции смеси в среде.
  8. Инкубируйте скважин для 60 минут при 37 ° C и 5% CO2.
  9. Удаление и отменить микс transfection и промойте его три раза клеток питательной среды. Добавить 1 мл среды культуры клеток в каждой скважине и Инкубируйте 30 секунд на RT. удалить 750 мл среды и добавить такое же количество свежей среды. Повторите это три раза.
    Примечание: Стиральная шаг очень важен. Сохранить время, каждый хорошо имеет не средний минимум (т.е., удалить и заменить скважины) и добавить средство Стиральная осторожно.
  10. Удалите и отбросить клеток питательной среды и добавьте 450 мл с кондиционерами средних-к скважины.
  11. Пусть нейроны Зрелые в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 в DIV 10.

3. стимулирование и Syt1 поглощения

Примечание: Следующий протокол применяется поглощение к 3 скважины. Для деполяризации любое количество скважин соответствующим образом скорректировать суммы.

  1. Подготовка 50 мл 10 x деполяризации буфера (640 мм NaCl, 700 KCl, 20 мм CaCl2, глюкозы 300 мм, 200 мм HEPES, рН 7,4 мм MgCl2, 10) в колбу Эрленмейера.
    Примечание: Деполяризации буфер может храниться при температуре 4 ° C на несколько недель. Если решение не расшатывания также используется, подготовить 10 x Tyrode в раствор, состоящий из 1290 мм NaCl, 50 мм KCl, MgCl 10 мм2, 20 мм CaCl2, 300 мм глюкозы, 200 мм HEPES рН 7,4 для того чтобы сравнить стимуляции индуцированного рециркуляции с самопроизвольно утилизации. После разбавления до 1 x добавьте 1 мкм Тетродотоксин перед использованием, чтобы блокировать поколения потенциал действия.
    1. Растворите 1,87 г NaCl, 2,61 г хлористого калия, 0,1 г MgCl2-6 H20, 0,15 g CaCl2-2 H2O и 3,0 г, глюкозы-1 H2O и 2,38 г HEPES в 50 мл дистиллированной воды в колбу Эрленмейера. Отрегулируйте пэ-аш с NaOH и стерильным фильтром решение. Разбавьте буфер 1:10 в дистиллированной воде для достижения 1 x концентрации.
  2. Подготовьте параформальдегида 4% (PFA) в однократном ПБС (рН 7,4) для фиксации после стимуляции.
    1. Для 500 мл 4% ПФА в однократном ПБС, растворяют 20 g параформальдегида в 450 мл дистиллированной H2O.
      Примечание: Отопление решение может ускорить растворение, но не нагревайте решение свыше 70 ° C, как PFA может распасться.
      Предупреждение: PFA токсичных и потенциально канцерогенных тератогенное. Надевайте перчатки при работе с PFA, работать под зонт и избегать употребления.
    2. Остудите раствор для RT и добавьте 50 мл 10 x PBS Стоковый раствор. Отрегулируйте рН 7,4 с NaOH/HCl с помощью рН метр.
  3. Предварительно теплой 600 мл 1 x деполяризации буфера и 10 мл среды культуры клеток до 37 ° C в водяной бане.
  4. Добавьте 1 mL антитела анти Syt1 мыши (клон 604.2) 1 x деполяризации буфера и вихревые для 10 секунд.
  5. Снимите и выбросьте среднего культуры клеток из клеток. Добавьте 200 мл смеси деполяризации антитела к каждой хорошо и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C и 5% CO2 в инкубаторе.
  6. Удаление и отменить микс деполяризации антитела и промойте его три раза средний культуры клеток. Добавить 1 мл среды культуры клеток в каждой скважине и Инкубируйте 30 секунд на RT. удалить 750 мл среды и добавить такое же количество свежей среды. Повторите три раза.
  7. Удалить и отказаться от среднего культуры клеток и добавить 300 мл 4% ПФА в однократном ПБС. Инкубировать в течение 20 минут при 4 ° C.
  8. Мойте три раза по 5 минут с ПБС.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

4. Immunocytochemistry

  1. Подготовка 50 мл блокировки буфера.
    Примечание: Блокирование буфера может храниться при температуре-20 ° C в течение нескольких месяцев.
    1. 2,5 г, сахарозы и 1 g бычьим сывороточным альбумином (БСА) растворяют в 5 мл 10 x PBS Стоковый раствор. Добавьте 1,5 мл 10% раствора моющего средства фонда. Перемешайте раствор, пока все компоненты правильно развели и добавить дистиллированной H2O до достижения окончательный объем 50 мл. Алиготе решение и заморозить аликвоты для хранения.
  2. Разбавленных вторичных, Флюорофор сочетании антитела (направленные против основных видов Syt1-антитела) в 200 мл блокировки буфера в каждой скважине в разведении 1: 1000.
  3. Снимите и выбросьте ПБС от каждой хорошо содержащие coverslip.
  4. Добавить 200 мл блокировки буфера антитела смеси для каждой скважины и проинкубируйте 60 минут на RT.
    Предупреждение: Ведь светочувствительные, вторичные антитела двигаться вперед все шаги должны выполняться в темноте.
  5. После инкубации Вымойте клетки три раза по 5 минут с 1 мл раствора 1 x PBS.
  6. Внедрить coverslips на скольжениях микроскопа с внедрения среды.
    1. Добавление 7 мл капли встраивания среднего на слайд микроскопа. Удалите coverslip от 24-ну пластины, подняв его с помощью шприца и захвата его с щипцами.
      Предупреждение: Клетки на поверхности coverslip легко повреждены, поэтому щипцами должны быть обработаны с осторожностью.
    2. Падение coverslip в дистиллированную воду, чтобы удалить PBS и тщательно сушить прикоснувшись один край для мягких тканей.
    3. Флип coverslip на встраивание средних капелька, так, чтобы поверхность, перевозящих клетки микроскопа, тем самым встраивание клетки в средство вложения.
  7. Оставьте слайды сушиться под капот для 1-2 ч (покрыть их, чтобы избежать воздействия света) и хранить их в коробке слайд микроскопа при 4 ° C.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

5. микроскопический анализ

  1. После того, как сухой coverslips, разместите их под микроскопом с объективной и камеры.
  2. Отрегулируйте время экспозиции для каждого канала, таким образом, чтобы несколько пикселей переэкспонированных для обеспечения максимального распределения серого значений.
    Примечание: Хотя время экспозиции может варьироваться между каналами, она должна быть постоянной на один канал для обеспечения сопоставимости между coverslips.
  3. Приобрести многоканальных изображений для 10 регионов интерес (ROI) в coverslip. Проверьте, что ROI содержит аксональное процессов из transfected нейрона, проверяя GFP-флуоресценции, который должен быть пунктата.

6. Статистический анализ

  1. Экспортируйте изображения в формате TIF. Загрузить изображения в OpenView18 , нажав файл | Загрузить файл образа.
  2. Выберите Synaptophysin-mOrange изображение как канал 1, Rogdi-GFP/mGFP изображение как канал 2 и Alexa647 флуоресценции изображение как канала 3.
  3. Порог ROIs.
    1. Нажмите кнопку анализ | Место области над puncta. Выбор значения порога и Дельта интенсивности , так что после визуального осмотра, исключается диффузных флуоресценции, оставив только пунктата сигналов в изображении канала 1 (представляющих флуоресценции Synaptophysin-mOrange). Держите тот же самый порог для всех изображений.
  4. Передача этих ROIs на соответствующий канал 2 (флуоресценции GFP-Rogdi/mGFP) и 3 (Syt1-флуоресцентным) каждой coverslip области, нажав кнопку выполнить сейчас.
    Примечание: ROIs должен рассматриваться только если ячейка является двойной transfected. В этом методе mOrange - и GFP-флуоресценции должна быть отчетливо видна.
  5. Сохраните данные в редактор журнала анализа, нажав кнопку данные журнала.
  6. Откройте редактор журнала анализа на вкладке Windows и скопировать значения для каждого канала. Вставьте значения для отдельных каналов в электронную таблицу.
  7. Определите интенсивность средняя флуоресценции Syt1-канала в ROIs в обоих условиях трансфекции (GFP-Rogdi и mGFP).
  8. Примените соответствующие статистические тесты, такие как студента t тест для определения существенных различий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ожидаемый результат этого подхода обнаружение примерно 50 двойной transfected нейронов в coverslip на плотности 50 000 нейронов в колодец. Ожидается, что аксон каждый нейрон показать несколько горячих точек дневно тегами накопления Synaptophysin, указав ofSVs кластеров. На пресинаптическом функциональные сайты рекомбинантных сигнала Synaptophysin colocalizes с пунктата Syt1 флуоресценции. С помощью двойной трансфекции, GFP-Rogdi как протеин интереса (рис. 1) ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует три анализов, обычно используются для изучения синаптических пузырьков (SV) утилизации. Первые два включают в себя использование) флуоресцентных стириловых красителей например FM1-43, (который инкорпорировать в мембраны, учитываются органеллы во время эндоцитоза и освобожден после экзоцитоз); и b) дневно меткой рекомбинантных белков SV (которые, после гиперэкспрессия, включить в белковых утилизации машин). Если прилагаемый флуорофоров изменить их флуоресценции в зависимости от рН, они могут использоваться для ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Ирмгард Weiss за экспертной технической помощи. Эта работа была поддержана DFG через кластер передового опыта для микроскопии в нанометровом диапазоне и молекулярной физиологии мозга (CNMPB, B1-7, т.д.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
B27Gibco17504-044
BSASigmaA7030-50G
CaCl2Sigma-AldrichC3306-100G
CoolSNAP HQ2Photometrics
dH2OInvitrogen15230
DABCOMerck8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647Jackson-Immunoresearch715605151антитело
DMEMInvitrogen41966
DPBSGibco14190
Eppendorf tubesEppendorf30120094
multiwell 24 лункиFisher Scientific087721H
tube (50 мл)Greiner Bio-One
FBS superiorBiochromAGS0615
ГлюкозаMerck1,083,421,000
HBSSInvitrogen14170
HEPESSigmaH4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)ThermoElectron Corporation
KCLSigma-AldrichP9541-500g
L-глутаминGibco25030
MgCl2HoneywellM0250-500g
предметные стекла для микроскопаFisher Scientific10144633CF
Microsoft ExcelMicrosoft
Mowiol4-88Calbiochem475904
NaClBioFroxx1394KG001
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
Нейробазальныйинвитроген21103049
OpenView Приложение для анализа экспериментовБесплатное программное обеспечение, см. комментариинаписанные Ноамом Э. Зивом, Технион – Израильский технологический институт, Хайфа, Израиль
PBS (10x)Roche11666789001
OptimemInvitrogen31985
PenstrepGibco15140-122
PFASigmaP6148-1кг
защитный капюшонThermoElectronСерийный номер 40649111
SucroseneoFroxx1104kg001
Synaptotagmin1 SynapticSystems105311мышиной моноклональной; клон 604.2
Triton X-100Merck1,086,031,000
Vortex Genius 3 IKA3340001
водяная баняGFL1004
Zeiss Observer. Z1 Цейсс
227261,

Ссылки

  1. Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
  2. Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
  3. Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
  4. Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
  5. Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
  6. Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27(2014).
  7. Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
  8. Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
  9. Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
  10. Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
  11. Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
  12. Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
  13. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  14. Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246(2018).
  15. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
  16. Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
  17. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
  18. Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
  19. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
  20. Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
  21. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
  22. Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
  23. Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
  24. Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
  25. Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
  26. Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
  27. Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
  28. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
  29. Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
  30. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
  31. Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
  32. Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  33. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
  34. Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
  35. Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
  36. Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
  37. Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Поглощение синаптотагмина-1культивируемые нейроны гиппокампадвойная трансфекциясинаптофизин-mOrangeколокализация GFP-Rogdiколичественный анализ иммунофлуоресценциидеполяризирующий буферантитела к Syt1пресинаптические терминали
Оптических Assay для синаптических пузырьков рециркуляции в культивированный нейронов, экспрессирующих Пресинаптический белки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.