Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сохранение биологических культур и измерения экспрессии генов в nerii тля: Non модель системы для взаимодействия растений насекомое

6.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58044

⸱

31 августа 2018 г.

 ,  , 
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

В этой статье

Краткое содержание

Nerii Бахчевая тля колонизирует на высоко защищал растений семейства dogbane (Apocyanaceae) и предоставляет многочисленные возможности для изучения взаимодействия растений насекомое. Здесь мы представляем серию протоколов для поддержания растений и тли, культур и поколения и анализ молекулярных и - omic данные для A. nerii.

Аннотация

Тли являются отличным экспериментальные модели для различных биологических вопросов, начиная от эволюции симбиозов и развития polyphenisms вопросы вокруг насекомых взаимодействия с их растений-хозяев. Геномных ресурсов доступны для нескольких видов тлей, и с достижениями в области секвенирования следующего поколения, транскриптомики исследования расширяются-модель организмов, которые не имеют геномов. Кроме того тля культур можно собраны из поля и выращены в лабораторных условиях для использования в научные и молекулярных экспериментов, чтобы преодолеть разрыв между экологических и генетических исследований. Наконец многие тля может быть сохранен в лаборатории на их предпочтительным разместить растения в вечный, parthenogenic жизненных циклов, позволяя для сравнения бесполым воспроизведения генотипов. Nerii тля, молочая олеандр тля, обеспечивает одной из таких моделей для изучения насекомых взаимодействия с токсичных растений, используя научные и молекулярных экспериментов. Методы для создания и обслуживания растений и тля культур в парниковых и лаборатории, экстракции ДНК и РНК, анализ микроспутник, de novo транскриптом Ассамблеи и аннотации, транскриптом дифференциального выражение анализ и проверка ПЦР дифференциально выраженной генов изложил и обсуждали здесь.

Введение

Тли являются небольшие, hemimetabolous насекомых, которые колонизировали на разнообразных растений семей во всем мире. Они являются отличительными для нескольких функций, наиболее особенно сложные жизненные циклы с участием циклический Партеногенез и дискретные polyphenisms и их обязывают питания симбиоз с бактериальной или дрожжи endosymbionts, которые поставляют питательные вещества, пропавших из их диета завод sap1. Хотя большинство тли являются специалистами завода хост, некоторые виды общего профиля являются важными сельскохозяйственными вредителями, нанося значительный экономический ущерб на посевах либо непосредственно или через патогенные микроорганизмы и вирусы они вектор2. Публикация первого тля генома в 2010 году, Гороховая тля Гороховая pisum3, отмечен важной вехой в изучении биологии тля, потому, что она представила геномных ресурсов для решения вопросов о насекомых адаптации к травоядным образа жизни, включая те, которые могут привести к лучшей стратегии управления4. С того времени дополнительные геномных ресурсов накопились с публикацией аннотированный генома glycines Бахчеваятля сои5, и публично доступен весь геном ресурсов для другого вида три тли (Myzus cerasi (Черная вишня тли), Myzus persicae (персик картофеля тли), Rhopalosiphum padi (Черемуха овсяная тля)6. Ценный de novo транскриптомики ресурсы доступны также для целого ряда других видов тли (e.g.,Aphis тля (хлопок тля)7, Sitobion avenae (зерно тля)8, Cinara pinitabulaeformis (сосна тля)9, nerii тля (Милкуид олеандр тля)10).

Тля также сделал прочный вклад в наше понимание взаимодействия растений насекомых и экологии жизни растений11. Одной из областей, где тли внесли особенно важный вклад находится в нашем понимании химической экологии принимающей завод взаимодействий. Растительноядные насекомые Экспресс различных приспособлений для преодоления защиты растений, а некоторые даже кооптировать защиты растений для их собственных пользу12,,1314. Например молочая олеандр тля, nerii тля, является яркий желтый, инвазивные тли в умеренных и тропических регионах во всем мире, который колонизирует на растений молочая семейства (Кутровые). Растения семейства Кутровые развивались различные химической защиты, включая молочный латекс и сердечных гликозидов, известный как cardenolides, которые связывают перевозчик катионов Na, K-АТФазы и эффективного сдерживания универсалом травоядных животных15, 16. специалистов в Милкуид выразить различные режимы сопротивления cardenolides, и некоторые выборочно пассивно накапливать или cardenolides в их тканях как средство сдерживания хищничества или другие преимущества17. A. nerii считается секвестр cardenolides таким образом, хотя механизмы и функциональные преимущества остаются неясными10,18.

Учитывая геномных ресурсов под рукой, а nerii обеспечивает отличную Экспериментальная модель для изучения молекулярных и генетических механизмов, участвующих в химико экологических взаимодействий между токсичных хост растений и их специалист травоядных животных. Стоит отметить, что, хотя некоторые из ранних исследований A. nerii сосредоточена на поглощение cardenolides19, с того времени, исследования а. nerii дали взглянуть на широкий набор эволюционные и экологические вопросы, в том числе генетическую структуру инвазивных насекомых20 и взаимосвязи между снизу вверх и сверху вниз регулирования плотности травоядных21. A. nerii , таким образом, является хорошим кандидатом как экспериментальная модель для особенно широкий спектр исследований насекомых завод взаимодействий. Решающее значение для успеха любого исследования с а. nerii является тщательное культура тля населения, которое включает в себя культуру растений, от которых зависят тли, а также эффективного поколения высокого качества - omic данных. Наша цель – направлять читателя через оба. Ниже перечислены методы для создания и поддержания культур растений и тли в парниковых и лаборатории, ДНК и РНК извлечений, микроспутник анализа, de novo транскриптом Ассамблеи и аннотации, транскриптом анализ дифференциального выражения и ПЦР проверка дифференциально выразил генов. Хотя эти методы пишутся для A. nerii, общие методы культивирования, извлечения и анализа может распространяться на различных видов тлей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. завод культур

  1. Купить семена от любого коммерческого поставщика или собирать от зрелых растений в поле.
    Примечание: Этот протокол подходит для большинства видов коммерчески доступных молочая (например, Ваточник мясо-красный, а сирийский, A. curassavica, гомфокарпус Пузыреплодник). Некоторые семена должны быть холодная стратификация, и инструкции от поставщика семена должны быть проверены.
  2. Семена растений в тонкой Прорастающий почвы (60 – 70% штрафа торфа, перлита, вермикулита, известняк).
    1. Заполнить стандартный Рассада лоток с прорастания смесь почвы; обеспечение того, что почвы достигает верхней части скважин. В каждом хорошо сделайте углубление для создания отверстия в почве о глубиной 3 см.
    2. Место одно семя в каждое отверстие и вода очень хорошо с лейкой что почвы охватывает семена и насыщен.
    3. Растут семена в Теплице (см. условия ниже, 1.5). Вода регулярно, ежедневно-другие ежедневно; достаточно, чтобы сохранить влажность почвы до умеренного уровня.
  3. Когда сеянцы выросли их первый набор полный листья, повторно горшок саженцев в общем заливки смеси (50-60% торф, кора и известняк) (рис. 1A).
    1. Использование 4-дюймовый круглые цветочные горшки, которые подходят с герметичное уплотнение с Кубка клеток. Заполните с общим заливки почвы до 5 см ниже края.
    2. Создание отверстие в почве глубокие достаточно, чтобы добраться до дна горшка.
    3. С рукой, мягко совок Зрелые рассады от его также и поместите его глубоко внутри отверстие в 4-дюймовый горшок. Обложка саженцев с почвой. Вода очень хорошо.
    4. Растут растения в парниковых и воды регулярно, ежедневно в любой другой день; достаточно, чтобы поддерживать умеренные почвенной влаги.
  4. Тепличных условиях.
    1. Установите парниковых термостаты для поддержания дневных температур между 18 – 28 ° C и ночных температур между 16-22 ° C, с помощью инструкции производителя.
    2. В зимние месяцы, когда дни становятся короче дополнение дневного света с 600 W высокого давления натрия луковицы (12 h, 8 утра-8 вечера).
  5. Контролировать нежелательные вредителей (например, трипсов, тли) внекорневая органических мыльным раствором, однако, эти продукты следует использовать с осторожностью.
    1. Сделать мыло раствор согласно рекомендации изготовителя и применить с помощью спрей бутылку.
    2. Отпуск, мыло на растения для 4-24 ч. Осторожно промойте растения водой, чтобы удалить приложение после 4 – 24 h soap и промойте их с воды второй раз до использования с лабораторных культур тля.
  6. Культура населения средний тли на растения, которые выросли по меньшей мере 3 – 4 комплекта полного листья и высотой минимум 10 см (рис. 1Б).

2. тля культур

  1. Начать Лаборатория тля населения от существующего населения isoclonal лаборатории или начать от поля собранные тли следуя инструкциям ниже.
    1. При запуске Лаборатория населения от существующего населения isoclonal лаборатории, передачи тлей, как описано в 2.3.1–2.3.3.
  2. Когда запуск нового isoclonal, собранных поле тля населения и тли один, воспроизводя, Взрослый на подходящей принимающей растений, как указано в шаге 1.6.
    Примечание: Население может быть запущен из крылатые (alate) или дать (Бескрылая) взрослых.
    1. Вручную проверяйте растений из парника для нежелательных вредителей до использования с лабораторией тлей. Замораживание любых растений с нежелательные тлей. При желании, используйте термос этанола для удаления трипса или других вредителей.
      Примечание: Не забудьте промыть растений, которые были обработаны с мылом до использования как описано в шаге 1.5.2.
    2. Безопасно передавать один взрослый тля, используя кисть или рот пипеткой, созданные с ID 3/16" x 1/4" ОД пластиковые трубы, 1000 мкл наконечник пипетки и наконечник пипетки мкл 2,00 (рисA).
    3. Надежно накройте растения с тлей клетке Кубок, созданные с пластиковый стаканчик с верхней, отрезать, покрыта тонкой сеткой и обеспеченных лентой (рис. 2B).
    4. Тля зараженных растений в лоток и удержание в контролируемой окружающей среды камере (16 Л: 8 d, 22 ° C, влажность 70%).
  3. Для поддержания запасов популяций, передачи тли на свежие, новые заводы за неделю (2.2.1–2.2.3).
    1. Безопасно передаватьnd 1 – 3 2 или 3rd Инстар нимф и 1 взрослого возраста тли, используя рот пипеткой (цифры, 2а, 3).
      Примечание: Лучше всего запасы поддерживаются путем передачи дать лиц.
    2. Надежно накройте тля зараженных растений клетке Кубок, созданные с пластиковый стаканчик с верхней, отрезать, покрыта тонкой сеткой и обеспеченных клейкой лентой.
    3. Растения в лоток и удержание тли в экологической палаты (16 Л: 8 d, 22 ° C, влажность 70%).
    4. В качестве альтернативы Если желаемого и если растения-хозяина достойного качества, используйте термос этанола для сокращения популяций, оставив только один воспроизведение взрослых и два-три 2 или 3 Инстар нимф.
  4. Для создания же возраст населения для использования в экспериментах, место до 5 взрослых (желательно дать) из запасов населения на новые растения-хозяина.
    1. Удаление взрослых 24 h позже.
    2. Около 5-7 дней позже, после F1 потомство созрели к взрослой жизни, место до 5 дать F1 взрослых на новые растения-хозяина. Удаление взрослых 24 h позже.
    3. После того, как население2 F созрел до совершеннолетия, это население готово к использованию в экспериментах.
      Примечание: Этот процесс гарантирует, что экспериментальный населения примерно то же возраста и рождаются примерно же возраст матерей.
  5. Подтвердите генотипического различия между поле поймал isoclonal линии с использованием микроспутника генотипирования (как описано ниже, разделы 3 и 4).

3. ДНК добыча

  1. Подготовка
    1. Используйте стерильные методы для подготовки буфера lysis 1 Л (0,1 М NaCl, 0,2 М сахарозы, 0.1 М трис (рН 9,1), 0,05 М ЭДТА, 0,05% SDS).
    2. Тепло Отопление блока или воды ванны до 65 ° C.
  2. Гомогенизацией тканей и lysis
    1. Место тли в нижней части стерильные, пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    2. Стерильные пестиком в трубку с тля и погрузиться в нижней части трубки в жидком азоте.
      Примечание: Оптимальный ткани распада достигается, когда тля располагается между пестик и стороне трубки.
    3. Измельчить тля с толкателем к первоначально Лизируйте клетки.
    4. Для одного взрослого тля используйте 200 мкл (разделить на аликвоты 2 x 100 мкл) буфера lysis. Добавьте первый Алиготе Измельчить и Ресуспензируйте щебень тля, до тех пор, пока образец заметно распалась, а затем использовать второй Алиготе смыть толкателем.
    5. Инкубируйте щебень тли литического буфера при 65 ° C в блоке Ванна или тепло воде для 30 мин.
  3. Высыпание дна
    1. В то время как трубка теплый, 14 мкл 8 M KOAc. Инвертируйте трубки смешивать. Магазин образец на льду за 30 мин.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, и образцы можно хранить при температуре-20 ° C до 24 ч.
    2. Центрифуга на 13 000 x g 15 мин при комнатной температуре. Супернатант передать новый 1,5 мл с пипеткой. Будьте осторожны, чтобы не удалить любой из гранулированного мусора.
    3. Для улучшения визуализации Пелле ДНК, добавьте 2 мкл гликогена (20 мкг/мл) в надосадке. Если размер выборки достаточно велик, пропустите этот шаг.
    4. Добавьте 200 мкл холодного этанола молекулярно класса 100% супернатант. Инвертируйте трубы смешивать и инкубации при комнатной температуре в течение по крайней мере 15 минут.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, и образцы можно хранить при температуре-20 ° C до 24 ч.
    5. Центрифуга на 13 000 x g 15 мин при комнатной температуре. Удалите этанола, закупорить.
  4. Мыть ДНК и элюции
    1. 200 мкл холодного этанола молекулярно grade 70%. Затем проведите трубки Ресуспензируйте и помыть лепешка.
    2. Центрифуга на 13 000 x g за 5 мин. Во время визуализации гранулы, тщательно удалить этанола, закупорить и 200 мкл холодного этанола молекулярно класса 100%.
    3. Центрифуга на 13 000 x g за 5 мин. При визуализации гранулы, тщательно удалите этанола, закупорить.
      Примечание: Повторить 100-70-100 этанола промыть в случае необходимости.
    4. Воздух сухой гранулы для 5 – 10 мин с прокладкой труб горизонтально открыт на папиросной бумаги.
    5. Ресуспензируйте Пелле ДНК в 80 мкл низкой TE (10 мм трис-HCl, ЭДТА 0,1 мм).
    6. Количественно ресуспензированы ДНК, используя спектрофотометр.
    7. Хранить при 4 ° C.

4. микроспутника ПЦР и последовательности генотипирования тля

  1. Закажите соответствующие F и R Праймеры для микроспутника виртуализации (Таблица 1-20).
    Примечание: Обратный грунтовка последовательности должна быть изменена с 5'-6-FAM или 5'-5-HEX флуоресцентные метки для мультиплексных образцов для секвенирования микроспутника.
  2. Выполните ПЦР с образцами ДНК одной тли (описано в разделе 3) и дневно обозначенные микроспутника грунтовки.
    1. Смесь ПЦР-реакции согласно протоколу производителя (0,2 мкм праймера F/R, 2,5 мм MgCl2, 50 – 200 ng дна шаблона).
    2. Используйте следующие параметры Термоциклер: первоначальный денатурации на 94 ° C 4 мин, 35 циклов 94 ° C за 30 s, 58 ° C 35 s, 72 ° C для 45 s и окончательный удлинение шаг в 72 ° C в течение 10 мин.
  3. Объединить ПЦР пробы с различными флуоресцентные метки уменьшить количество выборок, последовательность и последовательность микроспутника образцы на объекте генотипирования.
  4. Анализ .fsa сырых образцов файлов с помощью микроспутника анализа программного обеспечения.

5. РНК добыча

  1. Сбор образцов тли для извлечения РНК в 1,5 мл РНКазы / DNase свободной трубы и немедленное замораживание в жидком азоте.
    Примечание: Если следующие шаги не выполняются немедленно, образцы можно хранить при температуре-80 ° C.
  2. Гомогенизацией тканей
    1. С стерильных пестиком в трубку с тлей заморозить в жидком азоте для 10 – 15 секунд, до образца шипящих стоп. Раздавить тля хорошо с пестиком, как описано в шаге 3.2.
      Примечание: Оптимальный ткани распада достигается, когда тля располагается между пестик и стороне трубки.
    2. В Зонта добавьте 800 мкл Реагента Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ извлечения образца (1 – 5 взрослых тли). Однородный образцы с пестиком и распоряжаться толкателем.
  3. Разделение фаз
    Примечание: Все шаги должны быть выполнены в зонта.
    1. Инкубируйте гомогенизированных образцов для 5 мин при комнатной температуре. Мкл 160 метилхлороформа для образца. Shake энергично рукой для 15 s.
    2. Проинкубируйте 2-3 мин при комнатной температуре. Центрифуги для 15 мин на 12000 x g при 4 ° C.
      Примечание: После центрифугирования, смесь разделяется на 3 слоя: фазу ниже, красный фенол хлороформ, интерфаза и бесцветный верхняя водной фазе. РНК остается исключительно в водной фазе. Объем водного будет ~ 480 мкл.
  4. РНК осадков
    1. В Зонта передавать водной фазе трубу свежий, RNase бесплатно. Не беспокоить промежуточного этапа.
    2. Осадок РНК путем добавления 400 мкл изопропанола и инкубации образца при-20 ° C на 10 мин.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, и образцы можно хранить при температуре-20 ° C до 24 ч.
    3. Центрифугуйте образцы для 10 мин на 12000 x g при 4 ° C.
  5. Мыть РНК и элюции
    1. Удалить супернатант; Часы для РНК Пелле.
    2. Помойте лепешка РНК с 1 мл 75% этанола в DEPC-лечение водой. Смешать, медленно vortexing. Центрифуги для 5 мин при 7,500 x g при 4 ° C.
    3. Повторите шаги 5.5.1–5.5.2 чтобы помочь удалить примеси фенола.
    4. Удалить супернатант и высушите на воздухе Пелле за 5-10 мин с прокладкой труб горизонтально открытым на лавочке стерильные. Не позволяйте РНК гранулы полностью просохнуть.
    5. Растворяют гранулы РНК в 30 мкл РНКазы бесплатно или DEPC-лечение водой. Аккуратно Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать. Инкубируйте 55 – 60 ° c 10 – 15 мин.

6. RNAseq De Novo транскриптом Ассамблея, аннотация и анализ дифференциального выражения

  1. Анализируйте образец концентрации РНК и качество, с использованием чиповых капиллярного электрофореза системы.
    Примечание: Система на основе чипа капиллярного электрофореза является предпочтительным методом выбора чем анализ с спектрофотометр, потому что он обеспечивает более точное и чувствительных измерения концентрации РНК и качества.
    1. Если образцы имеют соответствующего качества (≥ 250 нг всего, Рин (РНК целостности номер) ≥ 5), выполняют РНК последовательности.
      Примечание: Важно, потому что эта последовательность данных будет использоваться для обоих выражение профилирования и de novo транскриптом Ассамблеи, Подробнее, глубина приведет к более высокой качество транскриптом. Для достаточно всеобъемлющий сборки с использованием технологии виртуализации Illumina, 100 – 200 млн 100 bp, парных конец читает бы рекомендуется начинать. Общая подготовка библиотека мРНК и РНК последовательности были исполнены объекта последовательности.
  2. Проверьте качество чтения с помощью быстро КК22.
  3. Объединить все пример читает и собрать транскриптом de novo с помощью Троицы23,24 (Trimmomatic качества включена фильтрация).
  4. Уточнить Ассамблея
    1. Использование Transdecoder25 для выявления открытых чтение кадры (ORFs), которые как минимум 100 аминокислот в длину.
    2. Выполните поиск гомологии для переведенных ORFs против Pfam26 и UniProt27 баз данных с помощью BLASTP28 и29HMMER, соответственно.
    3. Удаление бактериальной стенограммы (любой переведенный последовательности, чей лучший взрыв был бактериальный ген с счетом бит более 300 и идентификатор последовательности минимальный аминокислоты 50%).
    4. Сверните любое полное, переведенные ORFs, которые по крайней мере 99% идентичны на уровне аминокислоты с помощью CD-хит30.
    5. Сверните оставшиеся, неполной ORFs, которые по меньшей мере 95% идентичны на уровне нуклеотидов с помощью CD-хит30.
    6. Назначьте оставшиеся нуклеотидные последовательности с уникальным, поставляемому идентификаторы (например, APHNE 0001).
  5. Оцените полноту изысканный Ассамблеи, используя Григорьевич (http://busco.ezlab.org/) и членистоногих гена dataset31.
  6. Транскриптом Аннотация
    1. Во-первых аннотируйте изысканный транскриптом, используя HMMER против26,база данных Pfam29.
    2. Во-вторых аннотируйте транскриптом, используя BLASTP против UniProt базы данных27,28.
    3. В-третьих аннотируйте транскриптом, используя BLASTP против кодирования последовательностей отдельных насекомых с опубликованной, аннотированный геномов.
    4. Наконец аннотировать транскриптом, используя BLASTP против Гороховая тля белка только базу данных.
    5. Используйте Trinotate для создания аннотации GO из UniProt присоединения.
    6. Используйте Trinotate для организовать все аннотации результаты в базу данных SQLite и генерировать отчет аннотации.
  7. Анализ дифференциального выражения
    Примечание: С помощью изысканный транскриптом как ссылка, выравнивания и количественную оценку каждой библиотеке отдельно.
    1. Использование Trimmomatic качества фильтр и обрезки оригинала читать файлы32.
      Примечание: Если выполняя этот шаг после Троицы Ассамблеи, одно может использовать Trimmomatic вывода из этого шага.
    2. Выполните местные ряды для каждого образца, используя Bowtie233.
    3. Извлечь чтения графов из каждый образец индивидуально с помощью SAMtools34.
    4. Вычислить дифференцированный выражение между образцами интерес, используя DESeq2 с параметрами по умолчанию и параметрические подходят35.

7. ПЦР проверки дифференциально выразил генов

Примечание: Если пользователи заинтересованы в дифференциально выраженной гены от их RNAseq эксперименты, следующий протокол может использоваться для проверки модели дифференциальных выражения.

  1. Создание образцов РНК, как описано выше (шаг 5).
  2. Quantitate РНК зубов с помощью спектрофотометра для проверки качества и получения концентрации.
  3. Синтез cDNA образцы использование коммерчески доступных комплект в соответствии с рекомендациями производителя.
  4. Определите эффективность грунтовка для генов интерес для обеспечения точной амплификации PCR два раза.
    1. На основе оригинальной концентрации РНК, выполнить серийных разведений (101) для получения 3 cDNA концентрации.
    2. Используя мастер сочетанием количественного PCR, смешать тройные ПЦР реакции согласно производителя протокол, с помощью трех грунтовка концентрации (например, 100 Нм, 200 Нм, 300 Нм) с тремя последовательно разреженных cDNA концентрации (например, 0,1 нг/мкл, 10 нг/мкл, 100 нг/мкл).
    3. Для каждого целевого гена Вычислите наклон (m) линии, созданные с помощью средние значенияt C для каждого образца как зависимые переменные и журнал (cDNA концентрации) в качестве независимых переменных (три общее количество очков).
    4. Используйте следующее уравнение для расчета эффективности грунтовка (E), где m — это наклон вычисляется в 7.4.3:
      E = 10^(-1/m)
      Примечание: Эффективность грунтовка между 90-110% пригодны для анализа. Этот процесс обеспечивает равные амплификации генов всех включенных в расчеты.
  5. Используйте методt ΔΔC с геном уборки для количественного определения дифференциального выражение генов интерес36.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Завод культур: Семена будут принимать около двух-четырех недель, в зависимости от сезона, расти большой достаточно, чтобы быть повторно горшках (рис. 1А). Повторно горшках саженцы займет еще две-четыре недели расти оптимальный размер для тли культур (рис. 1Б).

Тля культуры: Взрослый A. nerii от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Давно признано, что aposematic A. nerii может обеспечить понимание структуры и механизмы сопротивления к заводе оборону и особенно химического связывания18,37. A. nerii10, предлагая новые возможности для экологического и функциональных геномных исследований, использующих A. nerii как модель недавно появились ряд геномных ресурсов. Мы приводим основные протоколы тля и растительные культуры, и молекулярных/геномной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Мишель Луна (Университет Вандербильта) за помощь с фотографией. Университет Вандербильта условии ПА и SSLB поддерживаются DGE-1445197.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Sun Gro Fafard Смесь для проращиванияHummert International10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro MixHummert International10-0951-2
2" x 4" Круглый стандартный горшокAnderson Pots1503
DreamTaq ДНК-полимеразаThermoFisher ScientificEP0701
ТризолThermoFisher Scientific
SuperScript® III Набор для синтеза первой нитиThermoFisher Scientific18080051
Power SYBR Green PCR Master MixThermoFisher Scientific4367659
15596026

Ссылки

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313(2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180(2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524(2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31(2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

de novo
Сохранение биологических культур и измерения экспрессии генов в nerii тля: Non модель системы для взаимодействия растений насекомое
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.