Здесь мы представляем протокол точно определить несколько генетические изменения целевого региона в одном реакции с использованием высадки ddPCR и уникальный Пара зондов гидролиза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Капелька цифровой полимеразной цепной реакции (ddPCR) является высокочувствительным количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) метод, основанный на фракционирование образца в тысячи индивидуальных реакций воды в нефти, нано размера. Недавно ddPCR стал одним из наиболее точных и чувствительных инструментов для циркулирующих опухолевые выявления ДНК (ctDNA). Одним из основных ограничений стандартного ddPCR техники является ограниченное количество мутаций, которые могут проверяться на реакции, которые требуются конкретные гидролиза зонды, признавая каждой возможной аллельные версии. Альтернативная методология, высадки ddPCR, повышает пропускную способность, так как он требует только одна пара зондов для выявления и количественной оценки потенциально все генетические изменения в целевом регионе. Высадки ddPCR отображает сопоставимых чувствительности обычных ddPCR анализов с преимуществом обнаружения большее количество мутаций в одной реакции. Он является экономически эффективным, экономит драгоценное образец материала и может также использоваться как инструмент для обнаружения при мутации не известны заранее.
Введение
Были сообщения о1тысячи соматических мутаций, связанных с развитием рака. Среди них некоторые являются прогнозирования маркеры эффективности таргетная терапия 2,3 и генетический скрининг этих мутаций теперь обычной клинической практике. Капелька цифровая технология ПЦР (ddPCR) может использоваться для наблюдения за наличие или отсутствие мутации с высоким Определение точности и высоко совместим с неинвазивные жидкого биопсий4,5. Однако текущий ddPCR анализы предназначены прежде всего для выявления мутаций известный априори
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокола, представленные здесь руководящими принципами этики Institut Кюри. Все человеческие образцы были получены от пациентов, зачисленных, после обоснованного согласия, в исследованиях, утвержденных Советом по рассмотрению институциональных на Institut Curie.
1. кровь сбора, хранения плазмы и экстракции ДНК клеток бесплатно
Примечание: ДНК, извлеченные из любого типа «ткани» может использоваться (например, свежие или формальдегида Исправлена парафин-врезанных тканей (FFPE), клетки в культуре или крови образцов). Здесь мы предоставляем подробные инструкции для сбора крови, плазмы изоляции и хранения и с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В исследовании, доказательство концепции крас 2 экзона мутации (кодоны 12 и 13) и EGFR экзона 19 изъятия были исследованы в образцах плазмы от больных раком с использованием стратегии сдачи в ddPCR6и FFPE тканей.
Зонд высадки крас допрашивали 16 bp регион, охватывающий несколько мутации экзона 2 крас гена, которые гавань более чем 95% известных крас мутаций в ч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для разработки эффективной высадки ddPCR assay, оптимизация имеет решающее значение, и протокол должен быть тщательно следили за. Каждая комбинация грунты и зонды имеет уникальную эффективность реакции PCR. Таким образом отдельные assay должно тщательно проверяться на контрольных образцах перед использованием на ценные образцы. Оптимизация и проверки имеют важное значение для сертификации пика сигнала и оценить специфичность и чувствительность. Как описано в протоколе, потенциально можно опросить все мутации, расположенн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Несколько авторов названы изобретателей два патентных заявок (EP17305920.5, EP18305277.8), связанные с ctDNA обнаружения.
Благодарности
Эта работа была поддержана Institut Curie SiRIC (Грант инков-DGOS-4654). Авторы также хотел бы поблагодарить Каролин Hego за ее вклад в видео.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пробирка K2EDTA (цветовой код: лаванда) | Пробирки BD | 367863 | EDTA используются для получения образца цельной крови или плазмы ЭДТА |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (ручной протокол) | Qiagen | 55114 | Для выделения свободно циркулирующей ДНК из плазмы человека |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (автоматизированный протокол) | Qiagen | 937556 | Для выделения свободно циркулирующей ДНК из плазмы человека |
| Система QIAsymphony SP | Qiagen | 9001297 | полностью интегрированная и автоматизированная система для очистки cfDNA, ДНК или РНК |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | Для одновременной очистки до 24 cfDNA |
| Флуориметр Qubit | Invitrogen | Q33226 | Флуориметр Qubit - это настольный флуориметр для количественного определения ДНК |
| QX100 или QX200 считыватель | Bio-Rad | 186-3003 или 186-4003, соответственно | Считыватель измеряет интенсивность флуоресценции каждой капли и определяет размер и форму, когда капли проходят через детектор |
| QX100 или QX200 генератор капель | Bio-Rad | 186-3002 или 186-4002 соответственно | Прибор, используемый для |
| генерации капель C1000 термоамплификатор | Bio-Rad | 1851196 | Модульная платформа термоамплификатора, включает в себя шасси термоамплификатора C1000 Touch, 96-луночный модуль быстрой реакции |
| Пластинчатый герметик | Bio-Rad | 181-4000 | PX1 и торговлю; Запайщик пластин PCR |
| DG8 держатель картриджа | Bio-Rad | 186-3051 | Позиционирует и удерживает картридж DG8 в приборе для генерации |
| капель Картриджи и прокладки генератора капель | Bio-Rad | 186-4007 | Микрофлюидный картридж DG8 используется для смешивания образца и масла для генерации капель; Прокладки DG8 герметизируют картридж для предотвращения испарения и приложения давления, необходимого для образования капель |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix для зондов (без dUTP) |
| 96-луночные ПЦР-планшеты | Eppendorf | 951020362 | 96-луночные полуюбки |
| Фольгированные пластины | Bio-Rad | 181-4040 | Прокалываемая фольга термосвариваемая |
| ddPCR Считыватель капель Масло | Bio-Rad | 186-3004 | масло, используемое при чтении |
| Масло для генерации капель для зондов | Bio-Rad | 186-3005 | масло для генерации капель |
| DNA loBind Tube 1,5 мл | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes максимизируют извлечение проб за счет значительного снижения связывания образца с поверхностью |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | Референтные стандарты Multiplex I cfDNA представляют собой высокоохарактеризованные, биологически значимые эталонные материалы, используемые для оценки эффективности анализов cfDNA, обнаруживающих соматические мутации |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | Анализ HS обладает высокой степенью селективности в отношении двухцепочечной ДНК (дцДНК) по сравнению с РНК и разработан с учетом точности исходных концентраций образца от 10 пг/&м; L до 100 нг/&м; Пробирки для |
| анализа L Qubit | Life Technologies | Q32856 | Пробирки для анализа кубитов - это 500 & микро; L тонкостенные полипропиленовые трубки для использования с флуориметром Qubit |
Ссылки
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic C....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
