Методическая статья

Смешанных биолюминесцентных и позитронный выбросов томография/вычислительная томография томография множественной миеломы ксенотрасплантатов костного мозга мышей Нагель

DOI:

10.3791/58056

⸱

7 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Greater Los Angeles Veteran Administration Healthcare System, 2San Diego Veterans Administration Healthcare System, 3University of California, Los Angeles, 4Perkin Elmer

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы используем биолюминесцентных, рентген и позитрон выбросов/компьютерная томография томография изображений изучить как ингибирующих активность mTOR воздействия опухолей костного мозга-прижившимися миеломы в ксенотрансплантата модели. Это позволяет для анализа физиологически соответствующих, неинвазивная и смешанных эффекта анти миеломе терапии миеломы костный мозг прижившимися опухоли в естественных условиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Множественная миелома (мм) опухоли привито в костном мозге (БМ) и их выживание и прогрессирования зависят от сложных молекулярных и клеточных взаимодействий, которые существуют в рамках этой микроокружения. Тем не менее BM микроокружения не может быть легко реплицируемых в пробирке, что потенциально ограничивает физиологическая значимость многих экспериментальных моделях in vitro и ex vivo . Эти проблемы могут быть преодолены путем использования ксенотрансплантата модель, в которой Люцифераза (Люк)-transfected клеток 8226 мм будет специально привито в мыши скелета. Когда эти мыши даны соответствующие субстрата, D-люциферин, эффекты терапии опухолевого роста и выживания могут быть проанализированы путем измерения изменений в биолюминесцентных изображения (BLI) производимые опухоли в естественных условиях. Этот BLI данных в сочетании с позитронный выбросов томография/вычислительной томографии (ПЭТ/КТ) анализ с использованием метаболических маркер 2-deoxy - 2 - (18F) фтор D-глюкоза (18F-ФДГ) используется для мониторинга изменений в метаболизме опухоль со временем. Эти изображения платформы позволяют несколько неинвазивного измерения в пределах микроокружения опухоли/BM.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ММ является неизлечимой болезни состоит из плазмы злокачественное B-клетки, которые проникают BM и вызвать разрушение кости, анемии, почечной недостаточностью и инфекции. ММ составляет 10% - 15% всех гемобластозами1 и является наиболее часто рак привлечь скелет2. Разработка мм проистекает из онкогенных трансформации долгоживущих плазматические клетки, которые устанавливаются в зародышевых центров лимфоидных тканей прежде чем в конечном итоге самонаведения для БМ3. BM характеризуется весьма разнородных ниши; включая разнообразных и критических клеточных компонентов, регионы низкой Ро2 (гипоксии), обширные васкуляризации, сложных внеклеточной матрицы и цитокинов и фактор роста сети, все из которых способствуют мм tumorgenesis4. Таким образом развитие рассеянного мм гранулы ксенотрансплантата модель характеризуется опухолей, которые являются строго прижившимися, в BM бы очень мощный и клинически значимых инструмент для изучения мм патологии в vivo5,6. Однако многочисленные технические препятствия может ограничить эффективность большинства ксенотрансплантата моделей, что делает их дорогостоящим и трудным применять. Это включает в себя проблемы, связанные с последовательной и воспроизводимые опухоли приживления в нише, БМ, длительное время для развития опухоли и ограничения в возможность непосредственно наблюдать и измерять изменения роста/выживания опухоли без необходимости Пожертвуйте мышей в ходе эксперимента7,8.

Этот протокол использует изменение ксенотрансплантата модель, которая была первоначально разработана Миякава et al. 9, в котором внутривенно (IV) проблема с миеломой клетки приводит к «распространение» опухоли, которые последовательно и герметизации привито в БМ NOD/SCID/IL-2γ(null) (Нагель) мышах10. Визуализация на месте этих опухолей достигается стабильная трансфекции 8226 человека мм клеточной линии с люк аллелей и серийно измерения изменений в BLI производства эти прижившимися опухолевых клеток6. Важно отметить, что эта модель может быть расширена для использования различных других Люк выражая человеческие мм клеточных линий (например, U266 и OPM2) с аналогичные склонности специально привить в скелет NOG мышей. Выявление опухолей у биолюминесцентных Вообразимый мышей следуют измерения поглощения радиофармацевтические зонды (например 18F-ФДГ), ПЭТ/КТ вместе, это позволяет дополнительные характеристики важнейших биохимических пути (то есть, изменения в метаболизме, изменения в гипоксии и индукции апоптоза) в пределах микроокружения опухоли/BM. Основные преимущества этой модели можно выделить наличие широкого круга radiolabeled, биолюминесцентных и флуоресцентных зондов и маркеры, которые могут быть использованы для изучения мм прогрессии и патологии в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все животные процедуры, описанные ниже были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) системы более здравоохранения ва Лос-Анджелес и были исполнены в стерильных и свободной от возбудителя условиях.

1. Подготовка Люцифераза выражая 8226 клеток (8226-люк)

  1. Поддерживать линии клеток человека мм 8226, в среде RPMI 1640, дополненная плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллин стрептомицина при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 95% воздуха и 5% двуокиси углерода (CO2).
  2. Генерировать стабильные Люк выражая репортер 8226 клетки transfecting 1 x 106 8226 клетки с вектором репортер Люцифераза, следуют выбор с hygromycin (100-350 мг/мл), как ранее описанные6.
  3. Сохранить клетки стандартных стерильных условиях культивирования для 2-3 недели, изменения среды каждый день, пока не сгенерированы создание стабильно transfected клеток 8226 линии.
  4. Подтвердите действие Люцифераза в пробирке в 1 x 10-6 transfected клеток/100 мкл-фосфатный буфер (PBS), добавив Люцифераза субстрата, D-Люциферин (150 мкг/мл рабочего раствора в подогретую питательной среды) и измерения биолюминесценции в пробирке или 96-луночных пластины с помощью люминометра6клеток.

2. ортотопическая гранулы ксенотрансплантата модель

  1. Сохранить мыши Нагель (4-6 недель, старый, мужчина или женщина) стерильные/возбудитель свободно в условиях объекта соответствующего ухода за животными.
  2. Подготовьте 8226 Люк transfected клеток для IV инъекции в NOG мышей (~ 5 x 106 клеток/мыши) в день эксперимента. Вымыть клетки 3 x в ледяной PBS, считать их и Ресуспензируйте их в ледяной PBS (минус антибиотики и FBS) в конечной концентрации 5 х 106 клеток/200 мкл PBS) в стерильную пробирку. Держите клетки на льду и вызов мыши как можно скорее (в течение 30-120 мин).
  3. Анестезировать мыши (с изофлюрановая, 1% - 3% в воздухе на 0,5 - 1 Л/мин) и поместите животное в лежачем положении на грелку с головой, стоящих перед прочь. Проверьте уровень анестезии, защемления ног. Применить глазной мази в глаза.
  4. Придать 8226-Люк клетки в мышей через Вену хвост (200 мкл/инъекции), с помощью инсулина 1 мл шприц и игла 26-G.
    Примечание: Тепла лампы может использоваться для подогрева хвост, тем самым расширяя Вены и повышая эффективность инъекции.
  5. Вернуть их домой клетка животного и контролировать животных до тех пор, пока они полностью выздоровел.
  6. Подтвердите приживления 8226-Люк клеток мыши скелета, измеряя BLI наркотизированных мышей (описано ниже и показано на рисунке 1A).
    Примечание: BM экссудат также могут быть окрашены для человека CD45 выражения с помощью проточной цитометрии (рис. 1B) или по иммуногистохимия собранные кости (рис. 1 c).

3. Измерение BLI в естественных условиях

Примечание: Как правило, измеримые BLI от прижившимися опухолей у мышей может наблюдаться первый между postchallenge 10-20 дней, но это, возможно, потребуется быть экспериментально определены.

  1. Проверить уровень анестезии, защемления ног и анестезировать мыши (с изофлюрановая, 1% - 3% в воздухе на 0,5 - 1 Л/мин). Применить глазная мазь на его глазах.
  2. Дать животным IP инъекций (200 мкл /) из «в vivo-класс «D-люциферин субстрата (30 мг/мл разбавленной в стерильного физиологического раствора).
  3. Измерить BLI в течение 5-10 мин, после инъекции люциферин субстрата (хотя BLI активность может быть наблюдаемой в мышей до 45-60 мин), размещая наркотизированных животного в лежачем положении в съемочной системы малых животных (Рисунок 2 ). Выберите светящиеся и рентгеноструктурного анализа и получить изображения (рис. 3).
    1. Измерьте средний сияние (/steradian фотоны/s/см2) в отдельных регионах, представляющих интерес (ROI) с помощью изображений программное обеспечение (рис. 4).
    2. Вернуть его домой клетка животного и контролировать его, до тех пор, пока он полностью выздоровел (приблизительно 15-20 мин).

4. Лечение мышей с целенаправленной терапии

  1. Измерить базовые BLI и рандомизировать животных в группах (4-8 мышей/группа).
  2. Лечить мышей с IP инъекции temsirolimus (0,2 - мыши 40 мг/кг) с использованием режима пяти ежедневных инъекций IP, затем 2 дня отдыха и еще пять ежедневных инъекций11(200 мкл/инъекции).
  3. Измерения активности Люцифераза (/steradian фотоны/s/см2) 2 раза в неделю, как описано в разделе 3 и сюжет изменение BLI с течением времени. Изменения в опухоли BLI могут быть представлены как последовательные изображения мышей (Рисунок 5B).
    Примечание: Рекомендуется, что ежедневный мониторинг животных выполняться до тех пор, пока они представляют следующие симптомы (обычно в течение 45-60 дней первоначального вызова): вес потеря (потеря более 10% по сравнению с весом до имплантации) и/или Хинд паралич конечностей, в это время они должны быть euthanized, используя камеру2 CO, следуют шейки матки дислокации.

5. PET/CT анализ с использованием 18F-ФДГ для измерения изменения в метаболизме опухоли

  1. Быстро животных в их дома клетки путем удаления их питание за 24 часа до эксперимента, чтобы избежать избыточного поглощения неспецифической 18F-ФДГ.
  2. Подготовка 18F-radiolabeled ФДГ-ПЭТ зонды (50-100 Μки/инъекции в стерильного физиологического раствора) в день эксперимента. Запись времени и деятельности 18F-ФДГ зонда с дозы калибратора.
    Примечание: Поскольку 18F имеет относительно короткий период полураспада (~ 2 h), тщательной подготовки и планирования для использования этих датчиков должны создаваться.
  3. Анестезировать животное (с изофлюрановая, 1% - 3% в воздухе на 0,5 - 1 Л/мин) и поместите его в лежачем положении на грелку с головой, стоящих перед прочь. Проверьте уровень анестезии, защемления ног. Применить глазная мазь на его глазах.
  4. Вводить зонд через Вену хвост (100 мкл/инъекции), с помощью экранированных 1 мл инсулин шприц и игла 26-G.
    Примечание: Тепла лампы может использоваться для подогрева хвост, тем самым расширяя Вены и повышая эффективность инъекции.
  5. Измерить остаточная радиоактивность в иглы/шприца в дозе калибратор и обратите внимание на активность и время.
    Примечание: Стандартизация мыши инкубации, дозировки и сроки необходимо обеспечить воспроизводимость данных и сопоставимости.
  6. Сохранить мыши под наркозом и при 37 ° C, с помощью грелку на весь период поглощения зонд (~ 45-90 мин).
    Примечание: Важно, что мышей остаются покоя и при 37 ° C, чтобы избежать неспецифических поглощение зонда.
  7. Разнесите инъекции 18F-ФДГ зонд промежутки около 20 - 30 мин для обеспечения аналогичного маркировки раз в мышей.
    Примечание: Надлежащего процесса и сроков проведения инъекции зонд приведет к оптимальным и воспроизводимых изображений условий.
  8. Измерения активности 18F-ФДГ в PET/CT малых животных тепловизионные системы в отдельных регионах интереса, которые соответствуют прижившимися опухоли (рис. 6).
    Примечание: Первоначально, рекомендуется 10-мин статические PET воздействия и воздействия CT 2-мин, но точное воздействие раз может потребоваться экспериментально определены.
  9. Вернуть их домой клетки животных и следить за ними до тех пор, пока полностью выздоровел. Дом мышей в комнате выделенный возврата для 24 часа во время зонд разлагается на фоновых уровнях.
    Примечание: Из-за короткий период полураспада 18F, несколько измерений, используя свежие зонд можно сделать так часто, как 2 раза в неделю.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В первоначальных экспериментальных исследований IV инъекции клеток 8226-люк в кивок/SCID мышей не развиваться опухоли БМ прижившимися мм, хотя плоскоклеточный мм опухоли были легко сформирована (100% успеха). В противоположность этому IV проблемы с 8226 клеток в NOG мышей сгенерирована (в течение 15-25 дней) опухоли скелета (и только редко сформированных опухоли в не скелетные ткани, например, печени или селезенки). Так как опухоли в скелета могут не быть подтверждены визуально физически ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на разнообразие моделей доклинических ксенотрансплантата мм6,9,11,12,13возможность изучить взаимодействия опухоли/BM в BM микроокружения остается сложной 14. описанные здесь методы позволяют для быстрого и воспроизводимые приживления 8226-Люк клеток опухоли в скелет NOG мышей.

Важнейшие шаги в этом п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор Кевин Фрэнсис является сотрудником Perkin-Elmer.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана ва ЗАСЛУГИ grant1I01BX001532 из Соединенных Штатов Америки Отдел ветеранов дел биомедицинских лабораторных исследований и развития службы (BLRDS) п.ф., и ЕС признает поддержки от ва клинические науки R & D службы ( Заслуживают награды I01CX001388) и реабилитации ва R & D службы (заслуга премии I01RX002604). Дальнейшая поддержка пришли из Грант Seed факультет UCLA в ж.к. Это содержание не обязательно отражают взгляды нас Департамент по делам ветеранов или правительства США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
8226 клеточная линия миеломы человекаATCCCCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ мыши (NOG)Jackson Labs5557
VivoGlo Люцифериновый субстратPromegaP1041
Hypoxyprobe-1KitHPL HP1-100
PE-CD45 (клон H130)BD Biosciences555483Используется для проточной цитометрии для идентификации человеческих CD45+ опухолевых клеток в BM экссудат
кролика против человека CD45 (клон D3F8Q)Клеточная сигнализация Технология70527Первичное антитело, используемое для иммуногистохимии иссеченной кости
Козья антикроличья IgG (конъюгированный HRP)ABCAMab205718Вторичное антитело, используемое для иммуногистохимии иссеченной кости
Двухлюциферазная репортерная система PromegaE1910
pGL4.5 Люциферазный репортерный векторPromegaE1310
IVIS Lumina XRMS In Система визуализации VivoPerkin Elmer
Sofie G8 Система визуализации ПЭТ/КТ PerkinElmer

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
  2. Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135(2012).
  3. Anderson, K. C., Carrasco, R. D. Pathogenesis of Myeloma. Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).
  4. Reagan, M. R., Rosen, C. J. Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction. Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).
  5. Frost, P., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis. Journal of Oncology. 2013, 897025(2013).
  6. Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity. Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).
  7. Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy. Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).
  8. Campbell, R. A., et al. Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma. International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).
  9. Miyakawa, Y., et al. Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).
  10. Ito, M., et al. Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  11. Frost, P., et al. In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model. Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).
  12. Asosingh, K., et al. Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression. Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).
  13. Storti, P., et al. Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction. Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).
  14. Fryer, R. A., et al. Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment. PLoS One. 8 (2), e57641(2013).
  15. Gould, S. J., Subramani, S. Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology. Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).
  16. Czernin, J., Phelps, M. E. Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications. Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).
  17. Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition. Circulation. 122 (21), (2010).
  18. Wang, M. W., et al. An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation. Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

D18F

Похожие статьи