Методическая статья

Идентификация Морская минога феромоны, используя Bioassay руководствуясь фракционирования

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58059

⸱

17 июля 2018 г.

 ,  , 
1Department of Fisheries and Wildlife, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол к изоляции и охарактеризовать структуру, обонятельные потенции и поведенческие реакции предполагаемого феромонов соединений морской миноги.

Аннотация

Биопроб руководствуясь Фракционирование это итеративный подход, использующий результаты физиологических и поведенческих bioassays изоляции и выявление активных феромонов соединения. Этот метод привела к успешной характеристика химических сигналов эту функцию как феромоны в широком диапазоне видов животных. Море миноги полагаются на обоняние обнаружить феромоны, которые посредником физиологических или поведенческих реакций. Мы используем эти знания биологии рыб постулировать функций предполагаемым феромоны и направлять изоляции и идентификации компонентов активного феромонов. Хроматография используется для извлечения, сконцентрироваться и отдельных соединений с кондиционерами воды. Электро olfactogram (ЭОГ) записи проводятся для определения, какой фракции вызывают обонятельных ответы. 2 выбор лабиринт поведенческих анализов затем используется для определения если любой из пахучих фракций поведенчески также активны и побудить предпочтение. Спектрометрические и спектроскопические методы предоставляют молекулярный вес и структурной информации для оказания помощи с разяснения структуры. Биологическую чистых соединений подтверждено ЭОГ и поведенческих анализов. Поведенческие реакции, наблюдается в лабиринте в конечном счете должно проверяться в поле параметр для подтверждения их функции в обстановке естественный поток. Эти bioassays играть двойную роль 1) направлять процесс фракционирования и 2) подтвердить и далее определять биологическую изолированных компонентов. Здесь мы приводим представительных результатов идентификации феромонов Морская минога которые иллюстрируют утилита биопроб руководствуясь фракционирование подход. Идентификация Морская минога феромоны особенно важна, потому что модуляции своей коммуникационной системы феромонов среди вариантов считается для контроля инвазивных Морская минога в районе Великих озер в Лаврентийские горы. Этот метод может быть легко адаптирована для характеристики химической связи в широком массиве таксонов и пролить свет на водной основе химической экологии.

Введение

Феромоны конкретные химические сигналы, выпущенный лицами, которые помогают им в поиске источников питания, обнаружение хищников и посредничество социальных взаимодействий сородичами1. Связь феромоны насекомых была хорошо изучены2; Однако химической идентификации и биологические функции водных позвоночных феромоны не были изучены как широко. Знания о личности и функции феромоны выпустила может применяться для облегчения восстановления угрожаемых видов3,4 или управления вредителей видов5,6. Применение этих методов требует изоляции и характеристика компонентов биоактивные феромонов.

Феромоны идентификации является филиалом натуральный продукт химии. Прогресс в исследованиях феромонов был частично ограничено из-за природы феромоны молекул, сами. Феромоны зачастую нестабильным и выпущенный в небольших количествах, и только несколько методов выборки существуют для обнаружения мизерных количествах летучих7,8 или9водорастворимые соединения. Подходы к идентификации феромоны включают 1) целевой скрининг известных соединений, 2) метаболомики и 3) биопроб руководствуясь фракционирования. Целевые обследования известных соединений коммерчески доступных метаболических побочных продуктов физиологических процессов, предположили, чтобы функционировать как феромоны. Этот подход ограничивает потому что исследователи могут проверять только известных и доступных соединений. Однако это привело к успешной идентификации половых гормонов в золотой рыбки эту функцию как феромоны10,,1112. Метаболомика — это второй феромонов идентификации подход, который отличает потенциальные малые молекулы продуктов метаболизма в биологической системе13. Сравнение метаболические профили двух групп (т.е., активные против неактивного экстракт) позволяет идентифицировать потенциальные метаболических профиля от которого очищается метаболит, осветил структура и биологическую является подтвержденным14. Аддитивные или синергических эффектов сложных формулировок конкретных смесей, скорее всего, быть обнаружены с метаболомики метаболитов, которые считаются вместе, а не как ряд фракций13. Тем не менее реализация метаболомики полагается на наличие синтетических ссылки потому, что полученные данные не способствуют прояснению новых структур.

Руководствуясь биопроб Фракционирование это комплексный итеративный подход, который охватывает два поля: Химия и биология. Этот подход использует результаты физиологических и поведенческих bioassays изоляции и выявление активных феромонов соединения. Незрелая выдержка фракционированный химические свойства (т.е.молекулярный размер, полярности, и т.д.) и протестированы с электро olfactogram (ЭОГ) записи и/или в биопроб. Биологически активных компонентов отсев, повторяя эти шаги фракционирования и EOGs и/или bioassays. Спектрометрический и спектральными методами, которые обеспечивают молекулярный вес и структурной информации для создания шаблона соединения, которые будут обобщены освещены структуры чистой активных соединений. Фракционирование биопроб руководствуясь может принести различных метаболитов и потенциально Роман феромонами с уникальной химической скелеты, которые вряд ли предсказал от биосинтетических пути.

Здесь мы описываем биопроб руководствуясь фракционирование протокол, используемый для изолировать и характеризует биологическую мужчины Морская минога Секс феромоны соединений. Морская минога (Petromyzon marinus) является идеальным позвоночных модель для изучения феромонов коммуникации, потому что эти рыбы полагаются на обонятельные обнаружения химических сигналов посредничать их проходных истории жизни, состоит из трех этапов: личинки, несовершеннолетних и взрослых. Морская минога личинки зарываются в отложениях пресноводной потоков, пройти радикальные метаморфоза и превратить в несовершеннолетних, которые мигрируют в озера или океана, где они паразитируют крупных принимающих рыбы. После отсоединения от принимающей рыбы, взрослые мигрируют обратно в нереста потоки, руководствуясь мигрирующих феромоны, выпущенное поток резидентов личинки15,16,,1718,19 . Зрелые мужчины взойти на время нереста, релиз многокомпонентных Секс феромоны для привлечения товарищей, периодически появляться примерно на неделю и затем умирают15,20. Определение Морская минога феромоны имеет важное значение, потому что модуляции системы связи феромонов среди рассмотренных для контроля инвазивных морской миноги в Лауренциана Великих озер21вариантов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитета Мичиганского государственного университета (AUF # 03/14-054-00 и 02/17-031-00).

1. сбор и добыча морской миноги кондиционерами воды

  1. Место сексуально пожилые мужской морской миноги (15-30 животных) в цистерне поставляется с 250 Л газированная вода озера Гурон, поддерживается на 16-18 ° C.
  2. Соберите мужчины кондиционерами воды в течение каждую ночь с июня по июль.
    Примечание: морской миноги естественно умирают после нереста. Если рыба близится этот момент в его жизни, замените его свежие зрелые мужчины.
  3. Экстракт кондиционерами воды методом экстракции твердой фазы.
    1. Замочите смолы в метаноле для 4 h перед загрузкой его в столбец. Загрузить смолы в столбце, а затем насоса 10 Л воды через колонку для устранения органических растворителей.
    2. Передайте кондиционерами воды из бака, холдинг рыбы через насосной системы в верхней части столбца. Вода проходит через кровать 2 кг умеренно полярных полимерных ионообменные смолы (например., смола амберлит XAD-7 HP), содержащийся в серии из четырех 2,5-л стекло столбцы. Поддерживать скорости загрузки между 400 и 600 мл/6 мин элюировать метаболитов с 10 Л метанола, сразу же после 5 Л ацетона.
      Предупреждение: Этот шаг использует метанол и ацетон. Оба являются легковоспламеняющиеся и ядовитые.
      Примечание: Пула остаточной может храниться при температуре-80 ° C до дальнейшей обработки.
  4. Повторно активируйте столбец после 1 недели обогащения, Стиральная его с водой (примерно 10 Л).
  5. Удаление органических растворителей (смесь метанола и воды) и урожай экстракт вращательное испарения для 5 h при пониженном давлении (до 300 мбар) при 40 ° C. Концентрации остатков воды путем замораживания сушки лиофилизации за 48 ч при-20 ° C до полного высыхания.

2. изоляция фракция бассейнов с хроматографии

  1. Замочите силикагель (230-400 mesh) на начальном этапе мобильные для 30 min. передачи гель с растворителем (подвеска) к столбцу стекла. Откройте клапан столбце Разрешить подвижная фаза пройти. Разрешить силикагель осадок и сформировать силикагель кровать.
  2. Тщательно перемешать выдержки с силикагель (70-230 сетки) и загрузить их в столбце жидкостной хроматографии над кроватью силикагель. Элюировать их с градиентом от 95% КХКЛ3 (хлороформ) / метанола (метанол) до 100% метанола, 2,5 Л в общем объеме. Соберите элюента в отдельных флаконов (каждый 10 мл).
    Предупреждение: Хлороформ, используемые на этом шаге является ядовитым реагента.
  3. Руководство объединения eluents в 20 фракций путем анализа хроматографии (ТСХ) тонким слоем.
    1. Выполните TLC эксперимент на предварительно покрытых силикагель пластины, применяя образца на стартовой линии и погружая стартовой линии пластины в развивающихся растворителей, (выбрать полярности на коэффициент КХКЛ3 метанола из 100-0%), в ампулах стекла танк.
    2. Выберите отношение развивающихся растворителя, чтобы сделать все пятна TLC с фактором удержания (Rf) от 0,3 - 0,8.
    3. После того, как развивающиеся растворителя достигает конца строки, вынуть пластину из танка и ждать 10 минут для растворителя испаряется.
    4. Визуализировать пятна сначала под УФ 254 Нм и затем пятно их распыления их с кислой метанола раствором 5% альдегид (20 мкл), опрыскивателя хроматографии и отопления их на 85 ° C в течение 3 мин.
      Примечание: Красочные пятна на TLC табличке указывают основной компонент в фракции.
    5. Объединить элюента до 20 долей, основанный на плашечный цвет и Rf сходство основной компонент.
  4. Концентрат дробь к остатков вращательное испарения при пониженном давлении (согласно свойство растворителей 300 мбар) при 40 ° C приблизительно 30 мин.

3. электро olfactogram (ЭОГ) записи для идентификации пахучих дроби/соединения

  1. Тянуть боросиликатного стекла капилляров (наружный диаметр: 1.5 мм, внутренний диаметр: 0.86 мм; длина: 100 мм) микропипеткой съемник с уровнем нагреватель установлен в 65.
  2. Оценка и вырежьте отверстие на кончике капилляра с наконечником алмазный стеклорез и заполнить его с расплавленный агар 0,4% в 0,9% физиологического раствора. Открытие на кончике капилляра должно быть около 10 мкм в диаметре.
  3. Заполнения вытащил капиллярного электродов от шаги 3.1-3.2 и твердотельные электроды Держатели быстровозводимые Ag/AgCl гранулы (см. Таблицу материалы) с 3 M с помощью микропипеткой KCl.
    Примечание: Выбить воздушные пузыри в капилляр или держатель электрода.
  4. Вставьте вытащил электродов в Держатели электродов.
  5. Подготовка 100 мл 10-5 M L-аргинин в угольного фильтра воды из L-аргинина Стоковый раствор 10-2 M в деионизированной воде (хранить при 4 ° C) в объемных колбу. Перевести 20 мл 10-5 M L-аргинин в стеклянный флакон.
  6. Для кривой концентрация реакция Подготовьте десятикратного разведений фракция бассейнов от шага 2.3 в стеклянные флаконы по 10 мл. Подготовьте свежие разведений ежедневно до экспериментов и использовать их в течение дня. Положите стеклянных флаконах рабочих растворов L-аргинин и фракция бассейн разведений в рециркуляционный водяной бане, чтобы позволить температуры сбалансировать 8 ° c.
  7. Анестезировать минога с 3-аминобензойной кислоты этилового эфира (MS222; 100 мг/Л) и парализовать его с внутримышечной инъекции gallamine triethiodide (3 мг/кг веса тела, 0,9% физиологического раствора) с помощью стерильного шприца.
    Примечание: Достаточной глубины анестезии определяется путем наблюдения о непринятии Гилл, неспособность сохранить вертикальное положение, а не всасывания сторон танка, используя свои устные диска. Чтобы свести к минимуму любые микробного загрязнения до и во время операции, стерильных перчатках и замочить рассечение инструменты в 70% этанола (v: v) в деионизированной воде для по крайней мере 10 минут перед использованием.
  8. Ориент наркотизированных миноги в V-образный стенд и оберните его с влажной салфеткой для предотвращения высыхания.
    Примечание: Не закрывайте отверстия Гилл.
  9. Вставить трубку рециркуляционных газированная вода, содержащая 50 мг/Л MS222 в ротовой полости, отрегулировать скорость потока и убедитесь, что вода является выходом через жаберные отверстия для непрерывно орошают жабры.
  10. Используйте стерильным скальпель и щипцы [под стереоскопическим микроскопом на 1,25 кратном (см. Таблицу материалы)] для удаления 5 мм2 участок кожи на поверхности обонятельных капсул подвергать обонятельного эпителия.
  11. Флеш одоранта доставки трубки с фильтрованной воды и подключить его к клапан, смонтированный на микроманипулятор. Место одоранта доставки капиллярной трубки в полость обонятельного эпителия, используя микроманипулятор для доставки фильтрованной воды для обонятельного эпителия для предотвращения высыхания, когда не управляющей отдушки.
  12. Прикрепите электроды записи и ссылки на микроманипуляторов. Нижняя электрод сравнения на внешнюю кожу возле нарис. Использование стереоскопические (1.25 X), ниже запись электрод для едва прикасаться к поверхности обонятельного эпителия.
  13. Передать поглощение одоранта Отводная трубка из фона фильтрации воды 10-5 M L-аргинин решения.
  14. Включите компьютер, усилитель (установить режим DC), фильтр и дигитайзер. С помощью программного обеспечения драйверов клапан, программа процедуры для администрирования 4 s одного импульса одоранта, установив флажок T1, установка T-4 s и установив флажок T2.
  15. В программное обеспечение получения данных (см. Таблицу материалы), установите режим приобретение высокоскоростного осциллографа, щелкните значок воспроизведения и нажмите кнопку начать в драйвере клапан для показа одоранта пульс.
    Примечание: Программы для сбора данных автоматически записывает дифференциального ЭОГ ответ амплитуда 20 s (3 s до 4 s во время импульса одоранта и 13 s позже). Используйте микроманипулятор для маневра позиции записи электрод, электрод сравнения или одоранта Отводная трубка для увеличения соотношения сигнал шум с максимальной реакции на стандарте L-аргинин и минимальный отклик (пустой элемент управления фильтрованная вода). Молотого усилитель, переключателем AC-DC усилитель к GND при перемещении электродов.
  16. Начните запись пустой элемент управления, L-аргинин, а затем отдушки, подготовленную на этапе 3.6 от низких до высоких концентраций с 2 мин флеш фильтрованной воды между приложениями.
  17. После записи ответов на все Отдушки для проверки, молотый усилитель и тщательно убрать электродов и одорант доставки капиллярной трубки. После утвержденной институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) методы, при прекращении ЭОГ эксперимента, усыпить наркотизированных минога с передозировкой MS222 (1 г/Л).
    Примечание: Проверьте успешное эвтаназии, отмечая отсутствие движения Гилл и сердцебиение по крайней мере 5 минут, после чего смертельная мозга.
  18. Анализировать и печати с помощью программного обеспечения для анализа данных. Определите порог обнаружения отдушки22 для выявления пахучих фракций, которые вызывают ответы больше, чем контроль пустой воды. Фракция бассейны, которые вызывают зависит от концентрации обонятельных ответы, которые отличаются от пустой воды управления затем проверяются в поведенческого анализа (шаг 4).

4. два выбор лабиринт поведенческих биопроб для выявления функционально активных фракций/соединений

  1. Акклиматизироваться половозрелые женский Морская минога в клетке выхода в лабиринте (см. дополнительный рис. 1) для 5 минут поддерживать заданную скорость потока воды в реке в лабиринте
    Примечание: Лабиринт построен из лакированных морской сорт дерева и меры 6,5 м в длину и 1,2 м в ширину с делителя измерения 2,7 м в длину, чтобы разделить два канала вверх в конце лабиринта. Временно вода направляется в лабиринте. Глубина воды должна поддерживаться на 0,19 м и скорости должна поддерживаться на 0,07 м/с ± 0,01.
  2. Отпустите Морская минога и записывать совокупное количество времени, минога тратит в экспериментальных и канала управления, каждый содержащий речной воды за 10 мин.
    Примечание: Если Морская минога не ввести экспериментальных и контролировать канал для по крайней мере 10 s в этот период 10 мин, конец судебного разбирательства, как это признак бездействия или сильная сторона предвзятости.
  3. Применить тест стимул (т.е., предполагаемый феромонов на 10-12 М растворяют в 50% метанол/деионизированная вода) назначенный случайным образом экспериментальный канал и транспортного средства (50% метанол/деионизированная вода) для канала управления с помощью Перистальтический Насосы постоянной скоростью 200 мл/мин за 5 мин.
    Примечание: Обнаружения порога концентрации тестового стимула как определено с электро olfactogram записи должны использоваться в качестве начальной концентрации для поведенческой теста.
  4. Применять тест стимул и транспортное средство для дополнительных 10 мин и записывать совокупное количество времени, тратит миноги в экспериментальных и канал управления.
  5. Промойте лабиринт с воды за 10 мин до начала следующего судебного разбирательства. Повторите шаги 4.1-4.4 с по крайней мере 7 миноги, при наличии достаточных стимул тест.
  6. Рассчитать индекс22 предпочтения для каждого судебного разбирательства и оценить значение с помощью теста Вилкоксон подписали ранга.
    Примечание: Индекс результаты в один номер, который может быть либо положительным или отрицательным. Положительное значение индекса предпочтения указывает притяжения, тогда как отрицательное значение индекса предпочтение показания отталкивания. Если индекс предпочтения значительно отличается от нуля, фракция считается активной.
    figure-protocol-1
    Здесь,
    Bc = время, затраченное тест миноги в канале управления до подачи одоранта,
    Be = время, затраченное на экспериментальный канал до подачи одоранта,
    C = время, затраченное на канале управления после применения одоранта, и
    E = время, затраченное на экспериментальный канал после применения одоранта.

5. хроматографический изоляции чистых соединений из активных фракций

  1. Повторите шаги 2.1-2.4 с бассейнами фракции, которые индуцируют обонятельных ответы (шаг 3) и вызывают поведенческих реакций (шаг 4).
  2. Дальнейшего очищения активных фракций в соединения с размер-гель-проникающей хроматографии с использованием торфов LH-20 столбца.
    1. Подготовка образца в 0,5 мл на начальном этапе мобильных [КХКЛ3- метанола (1:1) или метанола 100%], загрузить в соответствующий столбец КХКЛ3- метанола (1:1) и столбца затем метанола (100%) и элюировать их уступить соединений.

6. Структура разяснения чистого соединения с масс-спектрометрия (МС) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

  1. Распустить и разбавленных очищенная смесь на начальном этапе (как правило, метанола для воды, 1:1, v: v) мобильных высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) сформировать 10 мкл раствора примерно 1 мкг/мл.
    1. Пример решения передать ВЭЖХ флаконов и установите их в автоматический пробоотборник ВЭЖХ. Придать электроспрей ионизационная масс-спектрометрия (ESIMS) образца (10 мкл) и записи с высоким разрешением электроспрей ионизации масс-спектрометрия (HRESIMS) спектры с использованием хроматографии масс-спектрометр23.
  2. Предсказать молекулярную формулу согласно базе в масс-спектрометры Программное обеспечение (см. Таблицу материалы)24.
    1. Откройте Хроматограмма закачиваемой образец и получить его массовые спектр, выбрав хроматографического пика.
    2. Ввод измеренной массы ионов (m/z) значения (4 десятичных знаков) в элементного состава под модулем инструмент . Значение параметра tolerance PPM < 5.
    3. Отрегулируйте параметры символа подогнать элементный состав измеренных молекулы. Программное обеспечение производит предсказание молекулярной формулы на основе одного массового анализа.
  3. Выберите транс растворителей (600 мкл, CH3OH -d4 или ДМСО -d6) согласно протоколу25 развести образцы.
    1. Полностью растворите образец в выбранной транс растворители, образуя раствор с концентрацией около от 0,1 до 10 мг/мл. Передать образец решения в ЯМР-пробирку для записи 1D (1H, 13C) и 2D ЯМР [1H -1H корреляции спектроскопии (COSY), гетероядерных сингл квантовой согласованности (HSQC), гетероядерных несколько Бонд корреляции (HMBC)] спектры на 900 МГц ЯМР спектрометр26.
  4. Место ЯМР трубки с образцом внутри счетчика турбины. Измеритель глубины для обеспечения Высота образца используется в середине окна измерения. Откройте программное обеспечение ЯМР (см. Таблицу материалы) и нажмите кнопку отменить , чтобы изменить образец в магнит.
    Примечание: Держите руку поверх магнита чувствовать газа, поступающего из верхней части магнита. В то же время свист звук должен быть слышен.
  5. Осторожно поместите образец на воздушной подушке поверх магнита и нажмите кнопку снять снова спуститься в образце в магнит ЯМР.
    Примечание: Слушайте шум «нажмите кнопку» указывает, что образец находится в правильном положении.
  6. Создание нового набора данных и загрузить параметры по умолчанию, рекомендованный ЯМР инструмент (см. Таблицу материалы).
    1. Тип «замка» для вызова процесс автоматической блокировки и выберите растворителя на странице запрос.
    2. Для тонкой настройки, в Управление Панель, отрегулировать кнопку разблокировки модели, настроить курсор на панели манипулировать и снова зафиксировать магнита.
    3. На запрос страницы Атма настройте параметр в панели Управление к процедуре настройки, который может занять несколько минут. Подождите завершения настройки для продолжения.
    4. Запуск процедуры автоматического шиммирования «topshim», введя в командной строке. Подождите, пока шиммирования завершения, чтобы продолжить.
    5. Тип «ПГА», чтобы задать автоматическое получение выгоды корректировок, то типа «d1», чтобы установить задержку между импульсами, то типа «ЖГ» чтобы начать приобретение и дождитесь завершения приобретения.
    6. Тип «ef» или «efp» для обработки данных и затем введите «АПК «автоматического прекращения. Обработка данных на программное обеспечение для обработки ЯМР.
  7. Выяснения химической структуры, интерпретация анализа данных ЯМР.
  8. Граф углерода сигналов в спектре ЯМР C 13. Выберите соответствующий молекулярную формулу из прогнозируемого результата в высоким разрешением масс-спектрометрия (HR-МС).
  9. Интегрировать сигналы протона в спектре 1H ЯМР и назначить подключения из углерод - и Протон-на основе сигналов в спектре HSQC.
  10. Назначение подключения углеродного скелета, основанный на корреляции в 1H -1H уютный и HMBC спектра.
  11. Предварительно назначьте химической структуры, основанные на структуре обоснование27. Поиск примерная структура в химической структуры баз данных. Сравните примерная структура с аналогами в ссылках.
  12. Назначьте относительную конфигурацию с спектр ядерной спектроскопии эффект Оверхаузера (NOESY).
    Примечание: Поскольку свойства идентификации энантиомеров на спектрометрии и спектроскопические методы идентичны, абсолютной конфигурации некоторых соединений, особенно с 2'-алкоголя и 2'-NH2, должен быть определен с реакция деривации. После деривации реакции различия, указал на спектры облегчить недвусмысленное назначение абсолютной конфигурации большинства соединений28.

7. ЭОГ и биопроб для подтверждения чистого соединения пахучие и функционально активных

  1. Повторите шаги 3.1-3.5.
  2. Для кривой концентрация реакция Подготовьте 10 мл десятикратного разведения чистых соединений от 10-6 М - 10-13 M 10-3 M феромонов запасов раствора в 50% метанол/воде хранящихся в-20 ° C на основе молекулярной массой, предусмотренных Шаг 6.2. Положите стеклянных флаконах с рабочих растворов L-аргинин и чистых соединений рециркуляционный водяной бане, чтобы позволить температуры сбалансировать 8 ° c.
  3. Повторите шаги 3,7-3.18.
  4. Повторите шаги 4.1-4.2.
  5. Применение чистого соединения в концентрации порог обнаружения ЭОГ назначенный случайным образом экспериментальный канал и транспортного средства (50% метанол/деионизированная вода) для канала управления с использованием перистальтического насоса постоянной скоростью 200 мл/мин за 5 мин.
  6. Повторите шаги 4.4-4.6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Диаграмма, резюмируя шаги, описанные в протоколе биопроб руководствуясь Фракционирование это показано на рисунке 1. Протокол включает в себя шаги, чтобы изолировать и охарактеризовать структуру, обонятельные потенции и поведенческой активности 5 предполагаемый Морская минога феромоны (рис. 2). С помощью масс-спектрометрических и данные ЯМР (рис. 3 и рис. 4), были выяснен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Рыбы живут в химической мире, полном соединений еще должны быть определены. Фракционирование биопроб руководствуясь доказал необходимо определить и охарактеризовать биоактивных молекул, которые посредником многих химических взаимодействий, например теми, которые наблюдались в масу лосося31и32азиатских слонов, морской миноги33, 34,35. Биопроб руководствуясь фракционирование являетс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим США геологического обследования Хаммонд залив биологической станции для использования их научно-исследовательских учреждений и персонала США рыбы и дикой природы и рыболовства и океанов Канады для предоставления морской миноги. Это исследование было поддержано грантов от Комиссии по рыболовству в районе Великих озер Веймин Li и Ke Li.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стандартные настенные боросиликатные капилляры премиум-класса с филаментом Warner InstrumentsG150F-4записывающий электрод и электрод сравнения (наружный диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 0,86 мм)
Прибор для вытягивания пипетокNarishigePC-10тянет электроды для ЭОГ
Стеклорез с алмазным наконечникомУниверсальныйрежущий наконечник электродов для ЭОГ
Капилляры из боросиликатного стеклаWorld Precision Instruments1B150-4трубка подачи одоранта для ЭОГ
Держатель записывающего электрода серии E прямой с гранулой Ag/AgCl для стекла капилляр OD 1,5 ммWarner InstrumentsESP-M15Nдержатель записывающего
электрода серии E с ручкой с... Пеллеты Ag/AgCl  для стеклянного капилляра наружным диаметром 1,5 ммWarner InstrumentsE45P-F15NHдержатель электродов сравнения
1 мм штифтWarnerInstruments WC1-10для моста держателей референтных и записывающих электродов
2 мм штифтWarner InstrumentsWC2-5для моста держателей эталонных и записывающих электродов
SigmaA1296расплавленный агар для заполнения электродов
Хлорид калия (KCl)SigmaP93333M KCl для наполнения электродов и держателей электродов
Micropipette microfilWorld Precision InstrumentsMF28G-5для наполнения электродов и держателей электродов
L-ArginineSigmaA5006положительный контроль одоранта для EOG
МетанолSigma34860
Водяная баняна заказН/Дудерживает одоранты для ЭОГ
3-аминобензойная кислота этиловый эфир (MS222)Syndel СШАтрикаин1GEOG анестетик
триэтиодид галламинаSigmaG8134-5GEOG паралитический
1 мл шприцBD Biosciences301025для введения паралитической
подкожной иглы 26G 5/8BD Biosciences305115для введения паралитического
роликового зажимаWorld Precision Приборы14043-20регулируют скорость потока анестетика в рот миноги
Хлорид натрия (NaCl)J.T. Baker3624-05для приготовления 0,9% физиологического раствора
V-образная пластиковая подставка в качестве образцаИзготовленный на заказН/Дудерживает миногу во время пластикового
желобаИзготовленный на заказN/Aудерживает V-образную пластиковую подставку во время лезвий скальпеля EOG
- #11Fine Science Tools10011-00для рассечения EOG
Ручка скальпеля - #3Fine Science Tools10003-12для EOG dissection
Прямые ультратонкие щипцыFine Science Tools11252-00для EOG диссекции, Dumont #5SF щипцы
Изогнутые ультратонкие щипцыFine Science Tools11370-42для EOG диссекции, Moria MC40B
Прямые ножницыFine Science Tools15003-08для препарирования ЭОГ
СтереомикроскопZeissDiscovery V8для препарирования ЭОГ
Осветительный приборZeissCL 1500 ECOдля препарирования ЭОГ
Пластиковая трубкаДженерикдля подключения рециркуляционной установки ЭОГ и водяной бани
Трубка для подачи одоранта Изготовленныйна заказН/Д
Вход Линейный фильтр и комплект прокладокLeeCompany TCFA1201035A
МикроманипуляторыNarishigeMM-3для позиционирования электродов и подачи одоранта капиллярная трубка
Магнитные удерживающие устройстваKanetecMB-K
Драйвер клапанаArduinoизготовлен на заказдля управления открытием клапана для стимуляции запаха
Электромагнитный клапанLee КомпанияLFAA1201618Hклапан для стимуляции запаха
NeuroLog AC/DC усилительDigitimer Ltd.NL106для увеличения амплитуды электромагнитного сигнала
предусилитель постоянного тока NeuroLog с головной сценойDigitimer Ltd.NL102Gдля увеличения амплитуды электромагнитного сигнала
Фильтр нижних частот 60 ГцDigitimer Ltd.NL125
ДигитайзерMolecular Devices LLCAxon Digidata 1440A
водонепроницаемая морская фанера, покрытая пластиковым вкладышем
Насос для мусораHondaWT30XK4Aзаполняет лабиринт водой из близлежащей реки
Перистальтический насос с трубкойCole ParmerMasterflex 07557-00для администрирования одорантов в лабиринте
Инверторный генераторHondaEU1000iпитает перстальтический насос
Освобождающий каркасИзготовленный на заказН/Диспользуется для акклиматизации миноги в лабиринте
СеткаДженерикиспользуется для ограничения размеров лабиринта и минимизации турбулентности воды с помощью сетчатых
роликов Ведра (5 галлонов)Дженерикдля смешивания одорантов
РасходомерMarsh-McBirneyFlo-Mate 2000для измерения расхода
XAD 7 HP смолаDow химикат37380-43-1для добычи кондиционированной воды 
МетанолSigma34860для экстракции кондиционированной воды 
Водяная баняYamatoBM 200для экстракции кондиционированной воды 
Сублимационная сушилкаLabconcoCentriVap Концентратордля экстракции кондиционированной воды
ХлороформSigmaCX1050для изоляции фракционных бассейнов
Силикагель 70-230 мешSigma112926-00-8для изоляции фракционных бассейнов
Силикагель 230-400 мешSigma112926-00-8для изоляции фракционных бассейнов
Предварительно покрытый диоксид кремния гелевые пластины ТСХSigma99571для выделения фракционных бассейнов
анизальдегидSigmaA88107для выделения фракционных бассейнов
Sephadex LH-20GE Healthcare17-0090-01для выделения фракционных бассейнов
Amberlite XAD 7 HP смолаSigmaXAD7HPдля экстракции кондиционированной воды 
4, стеклянные колонны емкостью 2,5 лAce Glass Inc.5820для извлечения кондиционированной воды 
АцетонСигма650501для экстракции кондиционированной воды 
Масс-спектрометр TQ-S TOF LC (или аналог)Waters Co.Н/Ддля прояснения структуры
Бинарный насос ВЭЖХWaters Co.1525для выделения пулов/соединений фракций
Agilent NMR спектрометр, 900 МГц (или аналог)AgilentN/Aдля выяснения структуры
Rotovap сушильная системаBuchiRIIдля экстракции кондиционированной воды 
УФ-лампа (254 нм)Spectronics Co.ENF-240Cдля тонкослойной хроматографии 
Agar EOG Компьютер Dell (OptiPlex 745) под управлением программного обеспечения для сбора данных Axoscope Molecular Devices LLC AxoScope версия 10.4 Клетка Фарадея Изготовленный на заказ Н/Д Электромагнитный шумозащитный экран Лабиринт с двумя вариантами Изготовленный на заказ Н/Д

Ссылки

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
  3. Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
  4. Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
  5. Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
  6. Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
  7. Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
  8. Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
  9. Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
  10. Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
  11. Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
  12. Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
  13. Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
  14. Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
  15. Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
  16. Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
  17. Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
  18. Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
  19. Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
  20. Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
  21. Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
  22. Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
  23. Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
  24. Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
  25. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692(2007).
  26. Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
  27. Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
  28. Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
  29. Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
  30. Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
  31. Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
  32. Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
  33. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  34. Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
  35. Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
  36. De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
  37. De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
  38. Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
  39. Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи