Method Article

Высокой пропускной способностью, высоким содержанием, на основе жидкости C. elegans Pathosystem

DOI:

10.3791/58068

⸱

July 1st, 2018

 ,  , 
1Department of Biosciences, Rice University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол, который является адаптируемой, весь узел, высоким содержанием скрининга инструмент, который может быть использован для изучения взаимодействия хост возбудителя и использоваться для обнаружения наркотиков.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количество выявленных новых препаратов, традиционных, в пробирке экраны waned, уменьшения успех такого подхода в поисках новых видов оружия для борьбы с несколькими лекарственной устойчивости. Это привело к выводу, что исследователи не только необходимость поиска новых лекарств, но также должны разработать новые способы их обнаружения. Среди наиболее перспективных кандидатов методов всего организма, в естественных условиях assays что использование высокой пропускной способностью, фенотипические отсчетов и находится в диапазоне от Caenorhabditis elegans до данио рерио. Эти узлы имеют несколько мощных преимуществ, включая резкое сокращение в ложных положительных хитов, как соединения, которые являются токсичными для пребывания и/или biounavailable обычно переносятся в начальный экран, до дорогостоящих последующей вверх.

Здесь мы покажем, как нашего анализа была использована допросить хост вариации в документально C. elegans—Pseudomonas aeruginosa жидкого убийства pathosystem. Мы также продемонстрировать несколько расширений этой хорошо отработанные методики. Например мы в состоянии осуществлять генетические экраны высокой пропускной способности с помощью РНК-интерференции в 24 - или 96-луночных пластины форматы запросов хоста факторов в этом взаимодействии хост патогена. Используя этот assay, весь геном экранов может быть завершена только через несколько месяцев, которые могут значительно упростить задачу выявления лекарственных препаратов, потенциально без необходимости кропотливого биохимической очистки подходов.

Мы также приводим здесь вариант нашего метода, который заменяет грамположительные бактерии Enterococcus faecalis для грамотрицательных патогенов P. aeruginosa. Много, как это предусмотрено для P. aeruginosa, убийство E. faecalis зависит от времени. В отличие от предыдущих C. elegans—E. faecalis анализов, наши пробирного для E. faecalis не требует preinfection, повышение его безопасности профиля и уменьшая шансы заражения жидкость разгрузочное оборудование. Assay является очень надежной, показаны ~ 95% смертности 96 h пост инфекции.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выявление и развитие эффективных, широкого спектра действия антибиотиков, теперь почти столетие назад, привели к переломным моментом в области общественного здравоохранения где существует широкое распространение убеждение, что инфекционные болезни будет бедствием прошлого. В течение нескольких десятилетий короткие этот оптимизм начал ослабевать, как возбудитель после возбудителя механизмы сопротивления, которые ограничивают эти однажды чудесных лечения. На некоторое время гонка вооружений между усилиями обнаружения наркотиков и возбудители казалось сбалансированным. Однако неправомерное использование противомикробных препаратов недавно стало появление Пан лекарственной устойчивостью штаммов Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter заболеваний, Serratia marcescensи P. aeruginosa1, 2,3,4.

P. aeruginosa является оппортунистических, грам отрицательные, мульти хост возбудителя, является серьезной угрозой для больных с ожогами, те, кто с ослабленным иммунитетом или кистозный фиброз. Он также все чаще определяется как возбудитель в тяжелых нозокомиальных инфекций, особенно из-за его постоянной приобретения устойчивости к противомикробным препаратам. Чтобы приступить к решению этой угрозы, мы использовали документально C. elegans-P. aeruginosa инфекции системы5. Наша лаборатория использовала эту систему для разработки платформы на основе жидкости, высокой пропускной способности, высоким содержанием скрининг для выявления новых соединений, которые ограничивают способность возбудителя убить пребывания6. Интригующе эти соединения, как представляется, принадлежат по крайней мере три общие категории, включая антимикробные7 и вирулентности ингибиторы8. Другие анализы обнаружения наркотиков высоким содержанием в C. elegans были зарегистрированы для tuberculosum микобактерии, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, золотистый стафилококк, Candida albicans, и Enterococcus faecalis, среди других9,10,11,12,13,14,,1516. Эти типы анализов есть несколько хорошо признанных преимуществ, таких как ограничение ложных положительных хитов, которые могут быть токсичными для принимающей страны и возбудителя, увеличение вероятности биодоступность, по сравнению с химической экрана и возможность выявления хитов за пределами просто, ограничивая рост микроорганизмов, таких как анти virulents, иммунных стимулирующих молекул или соединения, которые в противном случае смещение баланса в хост возбудитель взаимодействия пользу бывшей. Кроме того соединения, обнаружил в эти экраны часто эффективны в млекопитающих хостов.

Стоит отметить, что по крайней мере два других анализов17,18 доступны для выполнения высокопроизводительных экраны в C. elegans в жидкости. Однако, каждый из этих анализов представляет собой модификацию, который позволяет прототипом assay кишечных колонизации, известный как медленно убийства, чтобы выполняться в жидкости, увеличивая пропускную способность и позволяет соединения для более легко проверяться. Тщательно характеристика убедительно продемонстрировал, что механизмы вирулентности бактерий отличаются между этих анализов и жидкости на основе экрана7. Поскольку оба типа вирулентности наблюдаются в системах млекопитающих, важно рассмотреть, какие детерминант вирулентности является наиболее актуальной для экспериментатора интересы до отбора пробы.

Здесь мы показываем, оптимизированной версии на основе жидкости C. elegans-P. aeruginosa assay. Мы также доклад адаптации нашего Пробирной жидкости на основе метода для размещения грамположительных бактерий возбудителя Enterococcus faecalis. Как P. aeruginosa E. faecalis во все большей степени определяется как угроза серьезного нозокомиальных с растущей вооружение антибиотикорезистентности пути1. Хотя предыдущий метод для высокопроизводительного скрининга E. faecalis существует14, он требует preinfection с возбудителя, который усложняет процедуру и повышает вероятность заражения оборудования как COPAS FlowSort. Наш протокол устраняет необходимость предварительной инфекции, улучшение профиль безопасности. Наконец мы сообщаем средств, по которому любой из этих анализов могут быть объединены с кормления интерференции, позволяя пользователю для поиска узла факторов, которые играют определенную роль в создании, или устойчивость к инфекции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предупреждение: P. aeruginosa и E. faecalis патогенов биологической безопасности уровня 2, и надлежащие меры предосторожности должны быть приняты для предотвращения случайного заражения и свести к минимуму загрязнение поверхностей. Все средства массовой информации и материалы, которые вступают в контакт с патогенами должны стерилизовать или удалены. Дополнительные руководящие принципы доступны из CDC публикации биобезопасности в микробиологические и биомедицинских лабораториях (BMBL), 5-е издание.

1. Подготовка и поддержание P. aeruginosa

  1. P. aeruginosa полоска из замороженных запасов на пластину агар фунтов (Lysogeny бульон). Инкубировать 16-24 ч при 37 ° C
    Примечание: Выполните эксперименты P. aeruginosa внутри BSL-2 биологической безопасности кабинета для обеспечения стерильности. Используйте соответствующие меры предосторожности, чтобы свести к минимуму вероятность патогенной инфекции или контаминации.
  2. Передача этой пластины до 4 ° C. Эта пластинка может сохранить на 4 ° C и используется для инокуляции культур на срок до одной недели. После одной недели обеззараживания и отбросить пластину и сделать новую пластину полоска фунтов.
    Примечание: P. aeruginosa вирулентности уменьшается после длительного хранения.
  3. Два дня до создания пробирного пластины, прививать 3-5 мл стерильной LB отвара с одной колонии P. aeruginosa от пластины в 1.1. Инкубируйте при 37 ° C 12 до 16 часов.
    Примечание: Не больше, чем 16 ч инкубации. В богатых жидких культур P. aeruginosa PA14 начинает лизируют.
  4. Подготовить стерильные 10 см пластины с медленно убивать СМИ (3 г NaCl, 3.5 g Пептон, CaCl 1 мм2, 1 мм MgSO4, 25 мл фосфатного буфера (сумма за литр: 132 мл K2HPO4 (1 М) и 868 мл х2PO4 (1 М)) и 18 g агар/Л).
    Примечание: Подготовьте пластины впереди времени. Они могут храниться до 3 недель в герметичном контейнере на 4 ° C.
  5. Семя пластины, медленно убивают каждый 10 см (SK пластины) с 350 мкл P. aeruginosa свежие ночи LB культуры. С помощью стерильных бактериальных разбрасыватель, распространение бактерий равномерно по всей поверхности средств массовой информации и дать высохнуть в BSL-2 биологической безопасности кабинета.
  6. Инкубируйте пластины при 37 ° C в течение 24 ч.

2. Подготовка RNAi бактерий

  1. Полоса, или ПИН передача требуемой штаммов бактерий, интерферирующих РНК содержащих, на плиты агара LB, содержащие соответствующие антибиотики (carbenicillin на 100 мкг/мл) и тетрациклинов на 15 мкг/мл для библиотек Ahringer и Видал из замороженных запасов.
    Примечание: При работе с непатогенных бактерий, используйте либо BSL-2 A / B биологической безопасности кабинета или ламинарного потока BSL-1 капот для обеспечения стерильности культур и свести к минимуму вероятность загрязнения библиотеки.
  2. Инкубировать пластины для 24 ч при 37 ° C.
  3. Храните пластины на 4 ° C на срок до двух недель.
    1. После двух недель отменить пластины и заменить их с свежезаваренным сделал пластинами.
  4. Проверьте несколько штаммов RNAi параллельно, индивидуально прививки единую колонию от каждого клона в 4 мл carbenicillin дополнить фунтов в сингл хорошо пластины 24 deep скважины или в стерильную пробирку.
    Примечание: Тетрациклин как сообщается, снижают эффективность RNAi. Не использовать его в это средства массовой информации.
  5. Поместите пластины для 24-ну погруженный в тряску инкубатор, оптимизированный для multiwell пластины и инкубировать и при 37 ° C для 16 h при встряхивании в 950 об/мин.
    Примечание: Это трудно получить равномерное рост бактерий в multiwell пластины, с использованием обычных пожимая инкубатора. Покачивая инкубатор необходимо иметь возможность пожать как минимум 750 об/мин в порядке для культур расти должным образом. В отсутствие специализированных шейкер можно вырастить каждой культуры в отдельных труб. Культур могут быть перенесены в 24-ну пластина для центрифугирования, при желании.
  6. Собирайте бактерий центрифугированием на 5 минут в 2000 x g.
  7. Декант супернатант инвертирование пластину и энергично встряхивая. Ресуспензируйте RNAi бактерий в 100 мкл базальной S (5.85 г NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 растворяют в 1 Л ультрачистая вода и стерилизации в автоклаве).
  8. Пипетка ресуспензированы бактерий в соответствующее количество скважин multiwell плиты NGM (нематоды роста СМИ, 3 g NaCl, 2.5 g Пептон, CaCl 1 мм2, 1 мм MgSO4, 25 мл фосфатного буфера (сумма за литр: 132 мл K2HPO4 (1 M) и 868 мл х2PO4 (1 М)) и 18 g агар на литр воды) с IPTG (1 mM концентрации выпускных экзаменов) и carbenicillin (конечная концентрация 100 мкг/мл).
    1. Используйте 3,5 мл NGM СМИ за хорошо 6-ну пластины, 1 мл на хорошо 24-ну плиты или 150 мкл на хорошо 96-луночных пластины.
    2. Использовать 100 мкл/ну бактерий для 6-ну плиты; 50 мкл/колодец для 24-хорошо; или 20 мкл/96-луночных пластины. Дайте высохнуть.
      Примечание: Сушка обычно производится в стерильных потока капот для содействия быструю и равномерную сушку. Очень важно равномерное высыхание. Избегайте чрезмерного высыхания, как трещины в агар поощрять рыться червей. Это приводит к червь потерь и потенциальных засорение систем жидкость обработки.
  9. Сразу использовать подготовленные пластины или хранить их при температуре 4 ° C на срок до двух недель для последующего использования.
    Примечание: Для предотвращения высыхания плиты, их можно герметичные пластиковые парафин пленкой или помещены в контейнер плотно закрытыми с влажной салфетки.

3. техническое обслуживание и подготовка C. elegans

Примечание: Прежде чем начинать эксперименты, следующим создайте синхронизированные населения беременных, взрослые черви гермафродиты.

  1. Вымойте беременных взрослых (т.е., с несколько эмбрионов, видимый в пределах Гонада) из 4-6 10-см NGM плит в 15 мл Конические трубки путем добавления 4 мл S Базальные пластины, закрученной мягко и затем вливаются в 15 мл Конические трубки.
  2. Пелле червей через центрифугирования в 1000 x g за 30 секунд.
  3. Супернатант аспирата, стараясь не нарушить червь Пелле.
  4. Добавить 3,5 мл раствора отбеливатель червь (конечная концентрация 0,5 М NaOH, гипохлорит натрия 1%, в стерильной воде) червь Пелле, и микс от переворачивать за 1 минуту.
  5. Кратко вихря и центрифуги на 1000 x g за 30 секунд.
  6. Аспирационная или сцеживаться супернатанта, стараясь не нарушить червь Пелле.
  7. Добавьте 3,5 мл свежего червь раствор отбеливателя в Пелле червя.
  8. Энергично перемешивают червей в раствор отбеливателя. Периодически (примерно каждые десять секунд) осмотрите червей под микроскопом рассечения. Следите за червь кутикулы сломать, выпуская яйца. После того как большинство взрослых червей были растворенного (~ 95%), разбавленных отбеливатель для 15 мл с базальной S чтобы остановить пищеварение.
    Примечание: Яичная скорлупа являются более устойчивыми к отбеливать чем взрослых тканях, но они могут быть распущены в период длительного воздействия. Чтобы избежать распада яйцо, не подвергайте яйца червь раствор отбеливателя для более чем 7 минут. Если повреждены чрезмерно яичную скорлупу, эмбрионы будут умирать.
  9. Пелле эмбрионов в 1000 x g 30 секунд и аспирационная или сцеживаться супернатант без удаления Пелле эмбрионов.
  10. Ресуспензируйте червей в S базальной окончательный объемом 15 мл для разбавления оставшийся раствор отбеливателя.
  11. Повторите шаги стиральная (3,9-3.10) три раза для в общей сложности 4 последовательных моет.
  12. После четвертого вымыть удалить супернатант и добавить до 5 или 6 мл стерильного базальной S в 15 мл Конические трубки. Цель заключается в Ресуспензируйте эмбрионов для концентрации ~ 50 червей за мкл.
    Примечание: Количество S базальной зависит от размера гранул яйцо; чем больше Пелле, больше базальных S является необходимым.
  13. Инкубировать Конические трубки ночь на столешницы ротатор при комнатной температуре или 48 ч при 15 ° C. Личинки вылупятся, но развития личинок будет арестовать на стадии L1 (L1 диапауза) вследствие лишения питательных веществ.
  14. Изучения под микроскопом рассечения, чтобы убедиться, что большинство из них вылупился и арестованы на L1 стадии развития эмбриона.
  15. Определите количество червя, приняв 20 мкл червь подготовительной и разбавления с 80 мкл базальной S. Пипетка 10 мкл разбавленного червь раствора непосредственно на пустую тарелку NGM. Повторите 2 раза.
    1. Граф личинок в каждом месте и определить среднее число. Разделите этот средний 2 получить приблизительное количество червей за мкл в червь prep. Парфюмерные Червь затем может использоваться для распространения пластин или экспериментов.
      Примечание: После 4-5 дней, голодали личинки начнут умирать; на данный момент отменить prep.
  16. Для размножения напряжение, соответствующее количество L1 червей (5000-6000 человек) на 3-4 10-см NGM пластин пятнистый с пипеткой сосредоточены ОР50 E. coli – «супер-пупер» (E. coli ОР50 заметили на 25 X концентрации (т.е., 1 Л из ночи ОР50 культуры, выращенные в LB дает 40 мл 25 X OP50 супер-пупер); 2 мл этой концентрации бактериальных подвеска запятнаны на каждой пластинке NGM 10 см).
  17. Подготовить пластины для экспериментов, выполните одно из следующих действий (для установки использовать 3.17.1 «Основной протокол», для «RNAi экран, расположенный на» использование шаги 3.17.2 - 3.17.4 в соответствующих случаях):
    1. Пипетка ~ 5000 червей/10 см пластины семенами с супер-пупер RNAi или ОР50.
    2. Пипетка ~ 500 червей/хорошо в пластине 6-ну семенами с RNAi.
    3. Пипетка ~ 300 червей/хорошо в пластине 24-ну семенами с RNAi.
    4. Пипетка ~ 100 червей/хорошо в плиту 96-луночных семенами с RNAi.
      Примечание: Для инструкций на как был посеян RNAi пожалуйста обратитесь к шагам 2,7-2,9 в подготовке RNAi бактерий.
  18. Если используется плодородные штамм червей, Инкубируйте червей при 25 ° C для ~ 44-48 ч. Использование этих червей как можно быстрее после того, как населения достиг соответствующего возраста. Это минимизирует влияние Яйца инкубационные в пределах червей в assay.
  19. Если используется штамм является температура стерильные (например, fer-15(b26); FEM-1(hc17) или glp-4(bn2)), инкубировать червей на 15 ° C ~ 16 h, а затем передавать на 25 ° C для 44 h завершить разработку и предотвратить эмбриогенеза.

4. жидкость убийство Assay установки (основной протокол)

Примечание: Это протокол для одного бактериальный штамм и один источник червей.

  1. С помощью скребка ячейки, удалить P. aeruginosa из СК пластины и Ресуспензируйте в ~ 5 мл базальной S. Масштабирование при необходимости. Измерение оптической плотности бактериальных подвеска, используя спектрофотометр (600OD)
  2. Подготовка 24 мл разбавленной акций P. aeruginosa в базальной S в ОД ≈600 0,09 (3 X конечная концентрация). Смотрите 4.6.2 для окончательного содержания на хорошо и соответственно масштабировать объем бактериальных разрежения.
  3. Добавьте 21 мл жидких сред медленно убивать (3 g NaCl, 3.5 g Пептон/л, дополненная CaCl2 и4 MgSO до конечной концентрации 1 мм). С помощью многоканальных дозаторов, передачи 45 мкл бактерий и средств массовой информации в каждой скважине 384-ну плиты.
  4. Моют червей от их источника (т.е., шаг 3.17.1) в 50 мл Конические трубки и позволяют червей селиться под гравитационных сил. Аспирационная супернатанта по 5 мл. Ресуспензируйте в общей сложности 50 мл S базальной.
  5. Повторите шаг 4.4 дважды.
  6. С помощью сортировщика червь, сортировать приблизительно 22 червей в каждой скважине 384-ну пластины.
    Примечание: Установка падает каждый червь в мкл ~1.1 жидкости. 22 червей составит 25 мкл, достигло 70 мкл/хорошо общего анализа тома.
    1. Окончательный состав каждой скважины состоит из 70 мкл. 45 мкл этого тома добавляется как Бактериальное средство (0,03 ОД600 бактерий в 24 мкл S базальной и 21 мкл SK дополнена CaCl2 и4MgSO). Другие 25 мкл добавляется с 22 червей.
    2. Если используется сортировщик здесь (см. Таблицу материалы) недоступна, черви могут быть ослаблены в конечной концентрации 1 червь/мкл в базальной S и накапаны 25 мкл/колодец с помощью многоканальных дозаторов. Однако результаты могут демонстрировать повышение изменчивости. Кроме того это можно использовать перистальтические жидкого мыла, как описано в19Леунг и коллеги.
  7. После того, как черви были отсортированы в пластину 384-Ну, печать плита с газовой полупроницаемых и инкубировать пластин при 25 ° C в течение 24-48 ч.
  8. В нужное время используйте микропланшетов мыть 384-ну пластины с базальной S в общей сложности 5 раз.
    1. После второго вымыть, удалить большую часть средств массовой информации, оставив ~ 20 мкл. энергично встряхнуть пластины Гонав Вортекс для по крайней мере 30 секунд чтобы ослабить любой мусор в нижней части скважины).
  9. После того, как окончательный мыть, аспирационная супернатант вплоть до 20 мкл. Добавьте 50 мкл 0,98 мкм нуклеиновых кислот пятна (см. Таблицу материалы) / хорошо 384-ну плита, для окончательного концентрации 0,7 мкм.
  10. Инкубации при комнатной температуре на 12-16 ч. Эта краска будет только пятно мертвых червей. После желаемого инкубационного периода мыть тарелки, удалить излишки с помощью микропланшетов пятно (минимум 3 стирок).
  11. Для сбора данных используйте спектрофотометр или автоматизированных микроскоп для изображения пропускаемого света и флуоресценции (531 Нм возбуждения и 593 выбросов).
    1. Используйте малое увеличение цель разрешить изображение всего хорошо быть захвачен.
    2. Кроме того использование потока vermimetry. Этот метод использует большой объект проточный цитометр как червь fluorimeter, измерение размера и флуоресценции всего организма (т.е., C. elegans) в моде, которая сильно похож на проточной цитометрии.
  12. Использовать программное обеспечение для анализа автоматизированных изображения (например, CellProfiler, студия анализ бесплатный изображений на основе MatLab http://cellprofiler.org/) для расчета области флуоресцентные и общая червь в колодец на беспристрастной основе.
    Примечание: Коэффициент этих чисел представляет смерть дроби для каждой скважины. Если один хорошо были 7 окрашенных червей из 20 всего, то смерть фракция состоит из 0.35 или 35%.
    1. Перед первым использованием автоматизации обработки изображения трубопровода должны быть проверены, ручная биговка. Это делается путем сравнения результатов от автоматизированный конвейер баллы, полученные путем визуального осмотра изображения и записи фракций мертвых червей для каждого из них. Процесс проверки гарантирует, что параметры для автоматической обработки изображений являются точными и представляют данные правильно.

5. Адаптация для отбора нескольких C. elegans штаммов или нокдаунов (RNAi экран Setup)

Примечание: Это RNAi экран, описанной для установки 24-ну пластины.

  1. Добавить 1 мл базальной S на хорошо 24-ну плиты (см. шаг 3.17.3). Осторожно агитировать червей путем встряхивания пластины, а затем передать пустой, стерильные 24 штанхглубинных плиты червей. Разрешить червей урегулировать гравитационно (~ 5 минут).
  2. Супернатант аспирата, оставив примерно 1 мл. Добавление 7 мл базальной S для каждой скважины.
  3. Повторите шаги 5.1-5.2 минимум 2 еще раз. После окончательной стирки аспирационная супернатанта, оставив примерно 400 мкл.
  4. Используя функцию ухудшенной червь сортировщик, сортировать 22 червей от 24-ну пластины червь подвеска в каждой скважине 384-ну плиты (каждый хорошо 24-ну лунках урожайность 8-12 384-ну плиты).
    1. Чтобы избежать голода, Пипетка бактерий в 384-ну пластины (штамм, который служит исключительно в качестве пищи, таких как ОР50, или патогенный штамм) до сортировки.
      Примечание: Патогены могут быть добавлены следующие шаги 2.3-2.5 или 6,4-6,5, и источник пищи бактерии могут быть разведен и добавил, следуя той же схеме, как P. aeruginosa.
  5. После того, как черви были отсортированы в пластину 384-хорошо, добавьте малых молекул или другие материалы, специфичные для эксперимента.

6. Адаптация для E. faecalis

Примечание: Только отличия от P. aeruginosa пробирного описаны.

  1. Подготовьте свежий источник E. faecalis мелирование бактерий из замороженных запасов на тарелку агар BHI (мозг сердца инфузии) и инкубации для 16-24 ч при 37 ° C.
    Примечание: Выполните эксперименты E. faecalis внутри BSL-2 биологической безопасности кабинета для обеспечения стерильности. Используйте соответствующие меры предосторожности, чтобы свести к минимуму вероятность патогенной инфекции или контаминации.
  2. Плиты могут храниться при температуре 4 ° C до одной недели. После этого периода замените свежим пластины.
  3. В ночь перед сортировки червей, прививать 3-5 мл стерильной BHI с одной колонии E. faecalis. Инкубируйте 12-16 ч при 37 ° C с перемешиванием.
  4. Добавьте бактерий к скважинам для P. aeruginosa (3 x бактерий в S базальной, ОД600≈0.09).
    Примечание: Для E. faecalis, это окончательный состав хорошо: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, с оставшийся объем состоит из S базальной. Помните, что 25 мкл S базальной будет поставляться с червей.
    Примечание: E. faecalis производит густой биопленки, которые поглощают флуоресцентные пятна, вызывая нечеткость изображения. Обширные Стиральная может быть недостаточно, чтобы удалить этот биопленки. В этом случае черви могут передаваться пустой пластину, используя многоканальные пипетки. Для облегчения передачи, анимации 20 могут добавляться к базальной S до конечной концентрации 0,1% (v/v) 20 анимации в базальной S. Это помогает в устранении червей от биопленки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важные параметры для анализа производительности

Правильное понимание биологии, лежащие в основе этого анализа необходим для устранения неполадок и оптимизации assay. С этой целью, мы сначала коснуться нескольких ключевых документов, изучение механизмов патогенеза P. aeruginosa-опосредованной, убийство в жидком7,20. Условии, что выполнены шаги, описанные...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот assay (или аналогичных анализов, где другие патогены подставляются P. aeruginosa или E. faecalis) является полезным для целого ряда целей, в том числе лекарственных препаратов. Это также полезно для решения фундаментальных биологических вопросов, такие факторы вирулентности, выяснение принимающей обороны путей, выявление и определение механизма регулирования участвующих в хост возбудитель взаимодействия.

Хотя надежные Пробирной жидкости убийство P. aeruginosa , ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано путем профилактики рака и исследовательский институт штата Техас (CPRIT) награда RR150044, Грант C исследовательский фонд Уэлч-1930 и национальных институтов из здравоохранения K22 AI110552 присуждена НВК. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
COPAS FP BioSorterUnion BiometricaБольшой проточный цитометр/червячный сортировщик
Cytation 5BioTek
EL406 Стиральный дозаторBioTek
Multitron Pro InforsHT
24 Глубокий колодец RB BlockThermo Fisher ScientificCS15124
384-луночный планшетGreiner Bio-OneMPG-781091
Питательная среда для нематод (NGM)Количество на литр: 18 грамм агара, 3 грамма NaCl, 2,5 грамма пептона, 1 мл CaCl<суб>2 (1 М), 1 мл MgSO<суб>4 (1 М), 25 мл буфера фоспата и 973 мл таблеток
для медленного уничтожения воды (SK) милли-QКоличество на литр: 18 грамм агара, 3 грамма NaCl, 3,5 грамма пептона, 1 мл CaCl2 (1 M), 1 мл MgSO4 (1 M), 25 мл фоспатного буфера и 973 мл milli-Q водного
среды медленного уничтожения (SK) Количество налитр:   3 грамма NaCl, 3,5 г пептона, 1 мл CaCl2 (1 M), 1 мл MgSO4 (1 M), 25 мл фосфатного буфера и 973 мл milli-Q water
Lysogeny Broth (LB)USBiological Life SciencesL1520
Brian Heart Infusion broth (BHI)Research Products International Corp50-488-526
Раствордля отбеливания червейКоличество на 100 мл: 10 мл 5 М раствора NaOH, 20 мл 5% раствора гипохлорита натрия и 70 мл стерильной воды
S Базальноеколичество на литр: 5,85 грамма NaCl, 6 грамм KH2PO4, 1 грамм K2HPO4, и 1 литр milli-Q воды
AgarUSBiological Life SciencesA0930
NaClUSBiological Life SciencesS5000
PeptoneUSBiological Life SciencesP3300
CaCl2USBiological Life Sciences
MgSO4Fisher ScientificM63-500
Количество фоспатированного буферана литр: 132 мл K2HPO4 (1M) и 868 мл KH2PO4 (1M)
KH2PO4Acros Organics7778-77-0
K2HPO4USBiological Life SciencesP5100
5% раствор гипохлорита натрияBICCA7495.5-32
NaOH растворFisher ScientificSS255-1
Breathe-easyDiversified BiotechBEM-1
SYTOX Оранжевый краситель для нуклеиновых кислотFisher ScientificS11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
< em>E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli РНКи, экспрессирующие бактерии (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP репортер (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167(2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189(2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921(2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C Elegans PathosystemLiquid Killing AssayHigh throughput ScreeningRNAi Genetic ScreenPseudomonas AeruginosaEnterococcus FaecalisWorm SortingSpectrophotometer AnalysisMulti well PlateBiosafety Cabinet

Related Articles